ERK/Smad通路在BMP2介導(dǎo)的牙髓干細胞增殖、分化中的作用

沈玉芹 崔娟娟 魯曉娟

(1皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，安徽 六安 237000；2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科)

牙髓干細胞(DPSCs)是存在于牙髓中的一種具有多向分化潛能的成體干細胞，是牙本質(zhì)再生的重要種子細胞〔1〕。近年來，以DPSCs作為種子細胞實現(xiàn)牙髓牙本質(zhì)再生修復(fù)的研究受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注〔1〕。骨形成蛋白(BMP)2可誘導(dǎo)和調(diào)控DPSCs向成牙本質(zhì)細胞分化〔2〕，研究證實，BMP2可通過激活細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SMAD家族成員1/5/8(Smad1/5/8)途徑，促進DPSCs中的Smad1-Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白(Runx)2和Runx2-牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)相互作用，調(diào)控DPSCs分化〔3，4〕。近來研究發(fā)現(xiàn)，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路也參與調(diào)控DPSCs成骨、成牙分化過程〔5，6〕，且已有研究發(fā)現(xiàn)ERK通路阻滯劑能夠抑制Runx2的活化〔7〕，并阻斷Smad1/5/8和ERK1/2信號在Runx2的會聚，調(diào)控DPSCs的牙母質(zhì)分化〔8〕。但BMP2與ERK/Smad通路之間的調(diào)控機制還不甚明確。給予ERK1/2抑制劑能否完全逆轉(zhuǎn)BMP2促進干細胞成骨分化作用還未見報道。本研究對此進行探究驗證，以期闡明BMP2在DPSCs牙髓牙本質(zhì)再生修復(fù)過程中的其他可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 人前磨牙牙髓干細胞(hDPSCs)(貨號：HZNC024，購自上海滬震實業(yè)有限公司)；胎牛血清DMEM培養(yǎng)基和兔抗人CD44、CD34、CD29、骨唾液蛋白(BSP)多克隆抗體和小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(貨號：E510002、E600010、D261338、D263155、D261488、D190090上海生工生物工程股份有限公司)；ERK通路抑制劑U0126(上海碧云天生物科技有限公司，貨號：S1901)，兔抗人ERK1/2、磷酸化(p)ERK1/2、DSPP、Runx2抗體(貨號：ab17942、ab223500、ab272929、ab236639，均購自美國Abcam公司)；Smad1/5/8、p-Smad1/5/8抗體(貨號：10822-100，10823-1001，購自艾美捷科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)染液及活性測定試劑盒(貨號：D001、A059，購自南京建成生物工程研究所)，茜素紅、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：G8550、T2210，均購自北京索萊寶生物科技有限公司)。重組腺病毒(Ad-GFP)、攜帶BMP2基因的腺病毒載體(Ad-BMP2)均由美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心何通川教授團隊構(gòu)建并饋贈。

1.2hDPSCs培養(yǎng)、鑒定 取液氮中凍存的hDPSCs細胞，常規(guī)復(fù)蘇后，以胎牛血清DMEM培養(yǎng)基吹成混懸液；轉(zhuǎn)入6孔板中，在5%CO2、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)；2 d后半量換液，收集上清液，加入DMEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)，待細胞生長至85%融合度時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集生長良好的第3代hDPSCs，調(diào)整細胞濃度為105個/ml后，以每孔200 μl接種至6孔細胞板上。常規(guī)培養(yǎng)過夜后，棄上清液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，用4%多聚甲醛固定20 min、0.5% Txion X-100處理20 min、3%H2O2處理15 min，反復(fù)漂洗后，以山羊血清封閉10 min；加入稀釋一抗(CD29、CD34、CD44、波形蛋白、角蛋白抗體，稀釋倍數(shù)為1∶200)，于4℃下孵育過夜，并將加入等量的PBS作為陰性對照；次日，加入二抗(生物素標記)于37℃下孵育20 min；經(jīng)鏈霉卵白素(辣根酶標記)孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色10 min后，樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.3hDPSCs分組與處理 取生長良好的第3代hDPSCs細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基配制成密度為5×104個/ml的細胞懸液，接種于48孔板上，并分為空白組、熒光蛋白(GFP)組、BMP2〔9〕組、BMP2+ERK通路抑制劑(U0126)〔6〕組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁培養(yǎng)6 h后，空白組不做任何處理并進行正常培養(yǎng)；GFP組加入終濃度為80 ng/ml的重組腺病毒(Ad-GFP)溶液及終濃度為8 mg/L的聚凝胺以增強病毒轉(zhuǎn)染；BMP2組加入終濃度為80 ng/ml的攜帶BMP2基因的腺病毒載體(Ad-BMP2)溶液及終濃度為8 mg/L的聚凝胺的溶液進行轉(zhuǎn)染；BMP2+U0126組在BMP2組基礎(chǔ)上加入終濃度為25 μmol/L的U0126溶液。各組細胞處理后置于37℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，并分別于轉(zhuǎn)染后48 h觀察熒光表達情況，并用RT-qPCR法檢測細胞中BMP2 mRNA表達情況，以判定BMP2基因轉(zhuǎn)染效果。

1.4CCK-8法檢測各組細胞增殖情況 取生長良好的第3代hDPSCs細胞，按1.3方法分組處理后，分別取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)1、3、5 d的各組細胞，加入10 μl CCK-8，于37℃條件下孵育4 h后用酶標儀檢測562 nm波長下的吸光值，繪制細胞生長曲線。

1.5ALP染色檢測ALP活性 收集處理7 d后的各組細胞，用4%多聚甲醛固定20 min，加入ALP染色30 min后洗去染色液后，置于顯微鏡下觀察拍照，并采用Image pro-plus軟件測定染色區(qū)域所占百分比，染色區(qū)域所占百分比=(染色面積/總面積)×100%。

1.6茜素紅染色 將長勢良好的第3代hDPSCs按照每孔106個細胞接種至6孔板上，按照1.3方法分組處理21 d后，棄培養(yǎng)液；經(jīng)4%多聚甲醛固定、磷酸緩沖液洗滌后，加入1%茜素紅溶液染色15 min，洗去染色液后，顯微鏡觀察拍照。

1.7RT-qPCR檢測 收集處理7 d各組細胞，利用Trizol試劑盒提取總RNA，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA后，將cDNA作為模板行實時熒光定量PCR反應(yīng)，2-ΔΔCt法計算hDPSCs中BMP-2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達水平，GAPDH作內(nèi)參照。其中，反應(yīng)條件如下：95℃ 120 s(1個循環(huán))，95℃ 30 s、55～60℃ 30 s、72℃ 30 s(40個循環(huán))，72℃ 300 s(1個循環(huán))；由大連寶生物公司合成的RT-qPCR擴增引物序列如下：BMP2上游引物5′-TCTTCTCCAATGACCGCAGCAATG-3′、下游5′-CTCCTCCTCTTGGCTCTCACCTG-3′；Runx2上游引物5′-CCAACCCACGAATGCACTATC-3′、下游5′-TAGTGAGTGGTGGCGGACATAC-3′；DSPP上游引物5′-TTCCGATGGGAGTCCTAGTG-3′、下游5′-TGAGCTTCTGGGTGTCCTCT-3′；BSP上游引物5′-GATTTCCAGTTCAGGGCAGTAG-3′、下游5′-CCCAGTGTTGTAGCAGAAAGTG-3′；GAPDH上游引物5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′、下游5′-GTAGAGGCAG GGATGATGTTCT-3′。

1.8Western印跡檢測 收集處理7 d各組細胞，加入細胞裂解液抽提總蛋白后，采用二喹啉甲酸法檢測總蛋白濃度；將變性后的蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以半干法轉(zhuǎn)膜；脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯膜2 h后，加入一抗(ERK1/2、p-ERK1/2、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP抗體，稀釋倍數(shù)為1∶2 000，內(nèi)參抗體為GAPDH，稀釋倍數(shù)為1∶2 000)，在4℃下孵育過夜；次日，加入稀釋5 000倍的二抗于室溫下孵育1 h。顯影曝光后，化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)拍照并分析灰度值。每組試驗重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1hDPSCs形態(tài)及鑒定結(jié)果 傳代培養(yǎng)第3代hDPSCs細胞呈長梭形且有凸起。免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，波形蛋白染色呈陽性，角蛋白染色呈陰性，說明細胞具有成纖維細胞的形態(tài)特征，符合牙髓細胞的生物學(xué)特征。CD29及CD44呈陽性表達，CD34呈陰性表達，符合干細胞特征。見圖1。

圖1 hDPSCs形態(tài)及鑒定(DAB)

2.2各組細胞BMP2轉(zhuǎn)染效果 用腺病毒轉(zhuǎn)染hDPSCs細胞后均呈綠色熒光表達。且轉(zhuǎn)染后48 h，與空白組相比，GFP組細胞BMP2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP2組、BMP2+U0126組細胞BMP2 mRNA表達均明顯升高(P<0.05)。與BMP2組相比，BMP2+U0126組BMP2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.3轉(zhuǎn)染BMP2后對hDPSCs細胞增殖的影響 隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細胞均逐漸增多，且各組細胞均在5 d時達到峰值，7 d時下降至接近3 d水平。與空白組中相比，GFP組在1～7 d時，細胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP2組3～7 d時細胞增殖最多(P<0.05)。與BMP2組相比，BMP2+U0126組3～7 d時細胞增殖明顯下降(P<0.05)。見表1。

2.4ALP染色結(jié)果及其活性比較 與空白組比較，GFP組細胞染色無明顯變化，細胞染色區(qū)域所占百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP2組細胞染色區(qū)域所占百分比明顯升高(P<0.05)；與BMP2組比較，BMP2+U0126組上述指標明顯降低(P<0.05)。見表1、圖3。

2.5茜素紅染色結(jié)果 與空白組比較，GFP組細胞染色無變化，BMP2組細胞染色加深且礦化結(jié)節(jié)增多；與BMP2組比較BMP2+U0126組染色變淺礦化結(jié)節(jié)減少。見圖4。

表1 各組細胞轉(zhuǎn)染后48 h BMP2 mRNA及ALP活性及不同時間細胞增殖比較

圖2 各組hDPSCs腺病毒轉(zhuǎn)染后綠色熒光表達(免疫熒光染色，×100)

圖3 各組hDDSCs ALP染色(×200)

2.6RT-qPCR檢測結(jié)果 與空白組比較，GFP組細胞BMP2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP2組細胞中BMP2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達均明顯升高(P<0.05)。與BMP2組比較，BMP2+U0126組細胞中Runx2、DSPP和BSP mRNA表達明顯降低(P<0.05)，BMP2 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.7Western印跡檢測結(jié)果 與空白組相比，GFP組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；BMP2組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)。與BMP2組比較，BMP2+U0126組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。見表3、圖5。

表2 各組細胞中BMP2、Runx2、DSPP和BSP mRNA表達

表3 各組細胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達水平比較

圖5 Western印跡檢測各組p-ERK1/2/ERK1/2、p-Smad1/5/8/Smad1/5/8、Runx2、DSPP、BSP蛋白表達

3 討 論

齲病、牙髓病等口腔疾病損傷牙髓及牙本質(zhì)細胞時，牙髓中的hDPSCs可增殖、分化成成牙本質(zhì)細胞、骨細胞等多種細胞而修復(fù)受損牙齒及丟失的骨組織〔10〕。hDPSCs的高度增殖、自我更新及多向分化能力，為牙組織再生修復(fù)工程及牙髓疾病的治療帶來了新的希望〔11〕。但hDPSCs增殖、分化及牙本質(zhì)再生修復(fù)過程中的分子機制復(fù)雜且不明確，這嚴重限制了應(yīng)用組織工程實現(xiàn)牙體牙髓再生的進程〔12〕。

BMP2具有骨誘導(dǎo)活性，其可在缺損骨組織中誘導(dǎo)未分化干細胞轉(zhuǎn)化為骨母細胞，并進一步形成骨組織〔13〕。研究證實，在牙胚發(fā)育過程中，BMP2可通過自分泌或旁分泌形式，表達于成釉上皮細胞、牙乳頭細胞、牙囊細胞和牙胚周圍的成骨細胞中促進本質(zhì)及牙基質(zhì)的分化再生〔14〕。近年來，大量體內(nèi)外試驗均證實BMP2參與牙髓組織損傷修復(fù)過程，王皓等〔15〕發(fā)現(xiàn)在先天性牙齒發(fā)育不全患者體內(nèi)檢測到牙齒BMP2基因突變及異常，提示BMP2與牙齒發(fā)育關(guān)系密切。浦鐵民等〔16〕及仵韓等〔17〕體外研究試驗發(fā)現(xiàn)BMP2可通過調(diào)節(jié)細胞的增殖狀態(tài)，促進牙髓細胞ALP合成等作用，誘導(dǎo)牙髓細胞向成骨及牙本質(zhì)分化，證實BMP2與牙髓組織修復(fù)關(guān)系密切。本研究給予hDPSCs轉(zhuǎn)染BMP2基因后，hDPSCs細胞增殖、礦化能力、牙本質(zhì)細胞分化標記基因DSPP基因及蛋白、成骨分化標志基因BSP表達均顯著高于空白組，證實了BMP2可誘導(dǎo)hDPSCs增殖分化及在牙髓組織損傷修復(fù)過程中扮演重要角色。然而干細胞分化是一個復(fù)雜的過程，需要多種生長因子、胞外基質(zhì)及細胞本身特性共同作用〔18〕，BMP2在hDPSCs分化這個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，如何與其他因子協(xié)同作用誘導(dǎo)細胞分化，仍需要繼續(xù)探討。

BMPs家族蛋白發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的分子機制與Smads介導(dǎo)的信號通路關(guān)系密切，研究證實，靶細胞膜上BMPs受體需要細胞質(zhì)內(nèi)各型Smads蛋白協(xié)同參與BMPs生物調(diào)控作用〔19〕。Qiu等〔3〕及任格等〔20〕發(fā)現(xiàn)BMPs中的BMPR-Ⅰ與BMPR-Ⅱ結(jié)合在一起，可促使Smad1/5/8發(fā)生磷酸化形成p-Smad1/5/8，然后p-Smad1/5/8在細胞核內(nèi)與Smad4結(jié)合形成一個異質(zhì)二聚體，從而激活靶基因如成骨相關(guān)Runx2的表達，促進干細胞向成骨分化；而阻斷Smad1/5/8信號通路及其磷酸化水平后，BMPs促進干細成骨作用及成骨分化相關(guān)基因Runx2表達水平也顯著下降，提示BMPs促進干細胞成骨分化過程中需要Smad1/5/8通路的調(diào)控。本研究提示，BMP2可介導(dǎo)Smad通路活化，參與hDPSCs細胞分化過程。但又有研究發(fā)現(xiàn)，用Smad1/5/8抑制劑抑制Smad1/5/8表達后，并不能完全阻斷Runx2及成骨分化活性，而用BMP2抑制劑卻可完全阻斷Runx2及成骨分化活性〔21〕，提示BMP2調(diào)控干細胞成骨分化作用，除了Smad通路參與外，還可能有其他通路共同參與。Li等〔8〕用Ca2+刺激hDPSCs細胞后，檢測了與BMP2相關(guān)的信號通路如ERK、末端激酶或應(yīng)激活化激酶(JNK)、p38絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)三條通路分子的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)只ERK磷酸化水平在hDPSCs中表達升高，提示BMP2調(diào)控hDPSCs成骨及牙本質(zhì)細胞分化過程中，ERK通路也發(fā)揮重要調(diào)控作用。Park等〔22〕發(fā)現(xiàn)抑制小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1細胞中ERK1/2磷酸化水平，導(dǎo)致磷酸Smad1/5/8和Runx2水平的下調(diào)，進而降低成骨細胞ALP、礦化及Runx2活性，提示ERK1/2可通過Smad/Runx2途徑調(diào)控細胞成骨分化。本研究結(jié)果提示，ERK1/2通路抑制劑可逆轉(zhuǎn)BMP2促進hDPSCs細胞增殖、分化作用，表明ERK/Smad通路在BMP2介導(dǎo)的hDPSCs細胞增殖、分化作用中發(fā)揮重要作用，BMP2與ERK之間可能存在間接或直接的靶向調(diào)控作用。