miRNA-194-5p通過減少神經(jīng)炎癥降低腦卒中風(fēng)險(xiǎn)

王霞 李美 王冰 陳秋菊 李巖 劉振元 張文奇

(衡水市人民醫(yī)院(哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院)康復(fù)醫(yī)學(xué)科，河北 衡水 053000)

在血管風(fēng)險(xiǎn)高發(fā)、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)巨變(老齡化、城市化)、生活方式欠佳(久坐、飲食)和經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的背景下，腦卒中的發(fā)病率、致殘率、死亡率呈升高趨勢，已成為威脅中老年人健康的一大公害〔1〕。急性缺血性腦卒中(AIS)作為一種危重的醫(yī)學(xué)急癥，其病因尚未確定，目前需要利用多種評(píng)估工具進(jìn)行及時(shí)的評(píng)估，包括非對(duì)比頭顱電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)檢查、磁共振成像(MRI)評(píng)估量表，這些評(píng)估工具非常有效，但也有其局限性，比如對(duì)特定腦區(qū)的敏感性有限〔2〕。在AIS的治療方面，腦卒中后4.5 h內(nèi)靜脈注射重組組織纖溶酶原激活劑仍是臨床首選，而由于缺乏對(duì)院前腦卒中癥狀的快速識(shí)別，AIS患者的及時(shí)干預(yù)常常受到阻礙〔3〕。

微小RNA(miRNAs)被認(rèn)為是重要的調(diào)節(jié)因子，可以作為人類疾病的診斷生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，為研究潛在的新治療方法提供了機(jī)會(huì)。很多研究表明miRNAs可以通過調(diào)節(jié)血管生成參與AIS的形成〔4，5〕。miRNA-194-5p已經(jīng)在多種癌癥中得到了很好的研究，并且在順式細(xì)胞癌患者中也被證實(shí)是下調(diào)的〔6〕。也有研究表明在低溫氧葡萄糖剝奪處理的神經(jīng)元中，miRNA-194-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，在miRNA-194-5p介導(dǎo)神經(jīng)元死亡的調(diào)控種，其下調(diào)對(duì)特定靶蛋白SUMO2缺血耐受至關(guān)重要，miRNA-194-5p在通過調(diào)節(jié)SUMO2調(diào)節(jié)深低溫循環(huán)停止反應(yīng)中發(fā)揮獨(dú)特作用。這些發(fā)現(xiàn)提示miRNA-194-5p可能是缺血性疾病干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)〔7，8〕。然而，miRNA-194在AIS中的作用尚未見報(bào)道。miRNA-194-5p對(duì)AIS 及其相關(guān)炎癥的作用和機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探索miRNA-194-5p對(duì)AIS相關(guān)炎癥的作用及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年12月衡水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的AIS患者72例為腦卒中組，男38例，女34例，年齡58～68歲；同期72例無腦血管病健康志愿者為正常組，男37例，女35例，年齡61～67歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床確診為AIS，入院前行頭部CT排除腦出血；②臨床資料完整；③首次發(fā)病且于3 d內(nèi)入院。排除標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病前有顱腦或精神創(chuàng)傷者及合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病;②年齡<18歲;③顱內(nèi)出血或合并梗死后出血;④合并腫瘤及心肺功能不全；⑤合并自身免疫性疾病。取血樣，4℃離心10 min，得血清，-80℃保存。經(jīng)CT或MRI檢查證實(shí)為AIS。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得每位患者的書面知情同意。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，從血清和細(xì)胞中收集總RNA。運(yùn)用RT試劑盒(TaKaRa Bio，Inc)合成cDNA。反應(yīng)在20 μl體積內(nèi)進(jìn)行，每個(gè)基因包含1 μl引物(10 μmol/L)、1 μl cDNA、10 μl SYBR Premix EX TaqTM(Takara Bio，Inc)和8 μl無核糖核酸酶水。RT-PCR使用LightCycle?96裝置(羅氏，中國上海)進(jìn)行。用2-ΔΔCt法分析mRNA表達(dá)量。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購自美國Ambion公司。HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中生長，細(xì)胞在37℃和5%CO2下孵育。使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)，miRNA-194-5p、simiRNA-194-5p、siTRAF6和對(duì)照質(zhì)粒(上海基因制藥有限公司)轉(zhuǎn)染HUVECs。①細(xì)胞分為正常組和脂多糖(LPS)模型組，培養(yǎng)48 h后，將100 ng/ml LPS加入LPS誘導(dǎo)組HUVECs中，孵育48 h，建立LPS誘導(dǎo)的HUVECs模型，并檢測6、12、24、48 h的miRNA-194-5p表達(dá)。②將LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h的HUVECs分為空白組、miRNA-194-5p組、simiRNA-194-5p組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒，培養(yǎng)12 h后，檢測miRNA-194-5p 、炎癥因子、TRAF6 mRNA、TRAF6蛋白表達(dá)情況。③將LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h的HUVECs分為空白組，simiRNA-194-5p組，simiRNA-194-5pa+siTRAF6組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒，培養(yǎng)12 h后，檢測TRAF6、炎癥因子表達(dá)。

1.4雙熒光素酶報(bào)告分析 使用了miRNA靶點(diǎn)預(yù)測軟件分析miRNA-194-5p的作用靶點(diǎn)。確定TRAF6的3′-UTR與miRNA-194-5p的結(jié)合位點(diǎn)。使用Lipofectamine2000(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc)誘導(dǎo)HUVECs轉(zhuǎn)染TRAF6-miRNA-194-5p 和TRAF6-negative 。轉(zhuǎn)染24 h后，使用雙熒光素酶分析系統(tǒng)進(jìn)行報(bào)告分析。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA試劑盒用于細(xì)胞上清中炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平檢測。使用FLUOstar-Omega微孔板閱讀器(BMG-Labtech股份有限公司)在450 nm波長處檢測吸光度。

1.6Western印跡分析 使用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。然后在10%的凝膠上用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)(50 μg/ml)，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。隨后，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，用(TRAF)6和GAPDH抗體在4℃孵育12 h。然后用辣根過氧化物酶結(jié)合的抗兔IgG二級(jí)抗體孵育膜2 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(EMD Millipore)對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行可視化，并使用密度測定法(Quantity One 4.5.0軟件；Bio-Rad Laboratories，Inc)對(duì)蛋白進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析和Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-194-5p在腦卒中患者血清的表達(dá) 腦卒中組miRNA-194-5p表達(dá)(0.39±0.15)顯著低于正常組(1.00±0.08，P<0.05)。

2.2LPS誘導(dǎo)的HUVECs中miRNA-194-5p的表達(dá) 與正常組相比，LPS模型組各時(shí)間點(diǎn)miRNA-194-5p表達(dá)水平顯著下降(均P<0.001)。見表1。

表1 LPS誘導(dǎo)HUVECs中miRNA-194-5p表達(dá)

2.3miRNA-194-5p抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展 與空白組比較，miRNA-194-5p組在miRNA-194-5p質(zhì)粒作用下顯著激活HUVECs miRNA-194-5p表達(dá)量(P<0.001)。與空白組比較，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。見表2。

表2 激活miRNA-194-5p對(duì)HUVECs模型中炎癥因子的影響

2.4下調(diào)miRNA-194-5p 促進(jìn)神經(jīng)炎癥發(fā)展 與空白組比較，simiRNA-194-5p組在simiRNA-194-5p作用下顯著抑制HUVECs miRNA-194-5p表達(dá)量(P<0.001)。與空白組比較，下調(diào)miRNA-194-5p表達(dá)，可明顯激活HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.001)。見表3。

表3 下調(diào)miRNA-194-5p 對(duì)HUVECs模型中炎癥因子的影響

2.5miRNA-194-5p通過TRAF6靶點(diǎn)抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展 miRNA-194-5p與TRAF6的結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。與空白組與TRAF6組比較，miRNA-194-5p與TRAF6的熒光素酶表達(dá)量顯著偏低(P<0.05)?？瞻捉M，激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)，下調(diào)miRNA-194-5p顯著激活TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)。見圖2、圖3、表4。

圖1 miRNA-194-5p與TRAF6的結(jié)合位點(diǎn)

圖2 激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 蛋白表達(dá)量

圖3 下調(diào)miRNA-194-5p顯著激活TRAF6 蛋白表達(dá)量

表4 miRNA-194-5p通過TRAF6靶點(diǎn)抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展

2.6調(diào)控TRAF6參與miRNA-194-5p抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展 用siTRAF6顯著抑制下調(diào)miRNA-194-5p對(duì)TRAF6蛋白表達(dá)量，與simiRNA-194-5p組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與simiRNA-194-5p組比較，下調(diào)TRAF6可顯著減少下調(diào)miRNA-194-5p對(duì)HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 調(diào)控TRAF6參與miRNA-194-5p抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展

1～3：空白組、simiRNA-194-SP組、simiRNA-194-5p+siTRAF6組

3 討 論

AIS是世界上神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率和死亡率的重要原因之一〔9〕。免疫系統(tǒng)在腦缺血損傷后的病理生理變化中起著復(fù)雜的作用，腦卒中通過激活自主神經(jīng)系統(tǒng)和應(yīng)激軸誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的抑制，顯著促進(jìn)腦卒中相關(guān)炎癥的發(fā)展。免疫應(yīng)激的生物標(biāo)志物被認(rèn)為是預(yù)測腦卒中相關(guān)感染的可靠指標(biāo)〔10〕。開發(fā)生物標(biāo)志物來指導(dǎo)腦卒中預(yù)后和相關(guān)性炎癥，將有助于對(duì)腦卒中高危患者的監(jiān)測和預(yù)防性抗感染治療。到目前為止，還沒有一種生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物模式能夠充分預(yù)測感染或具有足夠的陰性和陽性預(yù)測值為臨床提供可靠的靶點(diǎn)〔1，10〕。miRNA-194-5p/NXPH1軸在神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。這一發(fā)現(xiàn)將為生物醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究開辟新的途徑〔11〕。本研究結(jié)果說明miRNA-194-5p可能參與腦卒中相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。

miRNAs可能針對(duì)數(shù)百種不同的mRNAs，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞形成、分化、增殖和凋亡中具有重要作用，很多mRNAs并被認(rèn)為是參與神經(jīng)元保護(hù)基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子〔12〕。研究表明，缺血性腦卒中改變了小鼠和人類多個(gè)miRNA的表達(dá)，并具有改變細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的能力。此外，腦卒中誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥事件，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)在miRNAs水平上受到調(diào)節(jié)〔13〕。研究表明NF-κB激活可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)中miRNA-194的表達(dá)。miRNA-194的過度表達(dá)減輕了LPS誘導(dǎo)的ALI，并通過靶向CXCR4降低了炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)。在LPS誘導(dǎo)的ALI中，NF-κB通過抑制miRNA-194的表達(dá)介導(dǎo)CXCR4的表達(dá)，從而促進(jìn)肺組織的炎癥損傷〔14,15〕。有人認(rèn)為在LPS誘導(dǎo)后，miRNA-194在新生兒臍血粒細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，表明miRNA-194在LPS刺激的TLR信號(hào)通路中的作用〔16〕。另一項(xiàng)研究報(bào)道m(xù)iR-194可以通過靶向TRAF6調(diào)節(jié)棕櫚酸誘導(dǎo)的人THP-1細(xì)胞TLR4炎癥反應(yīng)〔17〕。此外，miRNA-194還可以通過介導(dǎo)TLR4的表達(dá)來調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)〔18〕。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)的HUVECs模型中 miRNA-194-5p的表達(dá)被顯著抑制，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。Chen等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miRNA-194-5p表達(dá)，HUVECs上清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平被激活。這些表明miRNA-194-5p可以抑制神經(jīng)炎癥，但機(jī)制尚不清楚。

TRAFs家族是一種多功能的細(xì)胞內(nèi)因子，最初發(fā)現(xiàn)它與細(xì)胞中的不同TNF直接結(jié)合，并存在于多種生物細(xì)胞中〔20〕。TRAF6與典型TRAF蛋白結(jié)構(gòu)同源性最小，TRAF-C結(jié)構(gòu)域差異最大〔21〕。越來越多的證據(jù)表明，TRAF6除了作為適應(yīng)性蛋白外，還可以作為E3泛素連接酶調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路。TRAF6可以介導(dǎo)炎癥因子信號(hào)的表達(dá)，在大腦中動(dòng)脈閉塞模型中發(fā)現(xiàn)TRAF6的表達(dá)水平明顯升高，腦水腫明顯，但應(yīng)用TRAF6抑制劑后，腦梗死面積減小，腦水腫程度減輕，免疫組化和Western印跡檢測顯示TRAF6的表達(dá)也明顯減少〔22〕。同樣，一些臨床試驗(yàn)表明，在AIS患者外周血中，TRAF6作為TLR4信號(hào)通路激活后的下游分子，在腦缺血中發(fā)揮著最重要的作用，對(duì)缺血性腦損傷的預(yù)后有重要影響〔23〕。本研究發(fā)現(xiàn)，激活miRNA-194-5p顯著抑制TRAF6 蛋白表達(dá)量。抑制TRAF6表達(dá)減少下調(diào)miRNA-194-5p對(duì)神經(jīng)炎癥發(fā)展的作用。 Kong等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-194調(diào)控TRAF6表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的椎間盤髓核細(xì)胞炎癥反應(yīng)。提示，miRNA-194-5p可能通過調(diào)控TRAF6，減少神經(jīng)炎癥阻止腦卒中風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，腦卒中患者血清中miRNA-194-5p表達(dá)顯著降低，激活miRNA-194-5p能夠抑制HUVECs上清中炎癥因子。同時(shí)miRNA-194-5p通過調(diào)控TRAF6靶點(diǎn)，抑制腦卒中相關(guān)神經(jīng)炎癥。提示，miRNA-194-5p可能作為臨床治療腦卒中相關(guān)神經(jīng)炎癥重要指標(biāo)，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。