黃芪提取物對(duì)DR模型大鼠眼部血流動(dòng)力學(xué)的干預(yù)效果及對(duì)血清IL-6和VEGF水平的影響

儀立群 王淼 林琳 仲蘇鄂 王慶海

(三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院眼科，湖北 宜昌 443000)

糖尿病(DM)患者人數(shù)在我國(guó)截止到2010年以達(dá)到九千余萬(wàn)，每年呈上升趨勢(shì)。DM屬于慢性全身疾病，2型糖尿病(T2DM)患者占DM患者人數(shù)的95%，患者的身體健康及生存質(zhì)量已經(jīng)嚴(yán)重受到威脅〔1〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)屬于一種慢性低度炎癥病變，是由DM引起的視網(wǎng)膜血管病變，導(dǎo)致DM患者喪失視力的主要原因〔2〕。有學(xué)者研究表示，DR嚴(yán)重的可導(dǎo)致患者失明，視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)損傷是由于糖代謝紊亂，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞凋亡、血管舒縮調(diào)節(jié)功能失常及血管基底膜增厚等〔3〕。DR患者在早期并無(wú)明顯癥狀，由于長(zhǎng)期病變累積則會(huì)出現(xiàn)黃斑水腫、眼底出血、異常微血管瘤等，最終視力下降，嚴(yán)重者甚至失明〔4〕。本研究黃芪提取物對(duì)DR模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)白細(xì)胞介素(IL)-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平的影響。

1 材料與方法

1.1材料 研究動(dòng)物：選取50只健康雄性SD大鼠，8～12個(gè)月，平均(10.6±1.2)個(gè)月，體重350～480 g，平均(420.6±20.4)g。由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，合格證號(hào)：京動(dòng)(2000)第015號(hào)，所有大鼠放于無(wú)病原菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度維持在(23.0±1.6)℃，飲用水和食物均進(jìn)行高溫及高壓消毒。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要藥物及主要儀器：黃芪(甘肅野生黃芪)，鏈脲佐菌素(STZ，上海穎心實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，免疫比濁法試劑盒(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司)，酶聯(lián)免疫試劑盒(北京維德維康生物技術(shù)有限公司)，血糖檢測(cè)儀(德國(guó)羅氏)，兔抗大鼠IL-6、VEGF抗體(Sigma公司)，小鼠抗大鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)抗體(Dako公司)，兔抗小鼠低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)抗體(Gibco 公司)。電子天平、pH計(jì)(上海京孚儀器有限公司)；蛋白垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；微量移液器(廣州雷得生物技術(shù)有限公司)；超純水儀(中天光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；磁力攪拌器(其林貝爾儀器制造有限公司)；多功能酶標(biāo)儀(Bio-rad公司)；離心機(jī)(Sigma公司)；-80℃冰箱(日本三洋公司)；紫外分光光度計(jì)(莫賽飛公司)；恒溫水浴箱(上海一凱儀器設(shè)備有限公司)。

1.2方法

1.2.1黃芪提取物制作 稱(chēng)取黃芪片20 g，加入100 ml蒸餾水，冷浸過(guò)夜后，進(jìn)行加熱煮沸30 min,倒出清液，使用小火進(jìn)行濃縮到10 ml，制成含生藥2 g/ml的藥液，使用濾紙將涼后的藥液過(guò)濾，使用一次性針頭濾器過(guò)濾，分裝滅菌放入安瓿瓶后放入冰箱備用。

1.2.2DR模型建立 選取40只大鼠制作模型，參考楊欽欽等〔5〕研究實(shí)驗(yàn)中DR大鼠模型的建立方法并進(jìn)行適當(dāng)改動(dòng)，建立DR模型，均以高脂飼料喂養(yǎng)6 w后禁止飲食飲水12 h，建立DR大鼠模型使用STZ 60 mg/kg進(jìn)行腹腔注射。3 d后取大鼠尾尖血，測(cè)血糖≥16.7 mmol/L則DM大鼠造模成功。將DM大鼠繼續(xù)進(jìn)行高脂飼料飼養(yǎng)1個(gè)月后以普通飼料喂養(yǎng)，DM大鼠眼底有明顯視網(wǎng)膜出血及滲出者為DR大鼠建模成功。

1.2.3用藥及分組 將建模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各組10只。低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別使用40、60、80 mg/kg黃芪提取物溶液進(jìn)行灌胃處理，1次/d，連續(xù)干預(yù)2 w。正常組及模型組給予同等體積的無(wú)菌生理鹽水灌胃治療。治療期間大鼠均自由飲食。

1.2.4視網(wǎng)膜組織觀察 使用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉處理后處死，解剖快速取出新鮮大鼠雙眼視網(wǎng)膜，放置于甲醛溶液中，固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，間距5 μm做連續(xù)切片。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入100%、95%、80%、75%濃度的酒精中各復(fù)水3 min。使用蘇木素染色15 min后清洗3次，使用鹽酸-酒精分化處理30 s，再次清洗兩次，使用1%氨水泛藍(lán)，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5血脂檢測(cè) 采取禁食12 h后的大鼠腹靜脈抽取靜脈血液3 ml，離心后取血清，采用CHOD-PAP法檢測(cè)TC水平，GPO-PAP法檢測(cè)TG水平，檢測(cè)過(guò)程分別按照總膽固醇單試劑測(cè)定試劑盒、TG檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用直接法-過(guò)氧化物酶清除法檢測(cè)LDL-C、HDL-C。酶標(biāo)儀預(yù)熱0.5 h，波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至240 nm，將檢測(cè)工作液37℃反應(yīng)5 min，提取已采集的血清樣本，加入190 μl工作液，在酶標(biāo)儀上振動(dòng)5 s開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄240 nm下初始吸光值A(chǔ)1和1 min后的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算公式A=A1-A2。

1.2.6IL-6、VEGF 取各組大鼠血清標(biāo)本，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6、VEGF水平：對(duì)抗原進(jìn)行稀釋后將其加入聚苯乙烯的反應(yīng)孔中，加蓋處理后，在溫度4℃的條件下放置24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液(pH值為7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測(cè)標(biāo)本0.1 ml，并加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照標(biāo)本，在溫度為42℃的條件下放置60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入IL-6、VEGF抗體0.1 ml，再次放置60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入底物液〔0.1 mol/L的磷酸氫二鈉(Na2HPO4),0.05 mol/L的枸櫞酸〕混勻，且加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L硫酸 (H2SO4) 0.05 ml放置各孔內(nèi)，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值，分析IL-6、VEGF水平。

1.2.7空腹血糖檢測(cè) 大鼠進(jìn)行麻醉處死前，使用血糖監(jiān)測(cè)儀對(duì)血糖進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行組間比較。

1.2.8視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈(CRA)血流動(dòng)力學(xué)變化檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)大鼠在最后一次給藥前1 d對(duì)大鼠右眼進(jìn)行彩色多普勒檢查，檢測(cè)每次大鼠右眼CRA的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)收縮期峰值血流速度(Max)、舒張末期流速(Min)、平均血流速度(TAMx)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DR模型建立前后大鼠圖片 正常大鼠晶狀體透明，無(wú)異常病變現(xiàn)象；DR模型大鼠晶狀體組織較為混濁。見(jiàn)圖1。

圖1 DR模型建立前后大鼠

2.25組大鼠病理形態(tài)學(xué)觀察 正常組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)外顆粒層細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，無(wú)異?，F(xiàn)象。模型組與正常組比較，視網(wǎng)膜內(nèi)外顆粒層細(xì)胞排列雜亂且較為稀疏、腫脹，伴有空泡樣變化；與模型組相比，低劑量組，中劑量組，高劑量組視網(wǎng)膜內(nèi)外顆粒層細(xì)胞充血、腫脹情況緩解，內(nèi)膜光滑程度上升，細(xì)胞排列雜亂情況出現(xiàn)緩解。與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組內(nèi)膜較為光滑，內(nèi)外顆粒層細(xì)胞排列最為緊密，細(xì)胞充血、腫脹情況基本消失。見(jiàn)圖2。

2.35組血脂水平及空腹血糖比較 模型組TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明顯高于正常組，HDL-C水平明顯低于正常組(P<0.05，P<0.001)；低劑量組、中劑量組、高劑量組TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明顯高于正常組，明顯低于模型組，HDL-C明顯低于正常組，明顯高于模型組(均P<0.001)；高劑量組TC、TG、LDL-C、空腹血糖水平明顯低于低劑量組，中劑量組，HDL-C明顯高于低劑量組、中劑量組(均P<0.001)。見(jiàn)表1。

圖2 5組病理學(xué)形態(tài)觀察(HE染色，×400)

表1 5組血脂水平、空腹血糖水平比較

2.45組IL-6、VEGF水平及CRA血流動(dòng)力變化 模型組Max、Min、TAMx水平明顯低于正常組，IL-6、VEGF明顯高于正常組(均P<0.001)；低劑量組、中劑量組、高劑量組Max、Min、TAMx水平明顯低于正常組，明顯高于模型組；IL-6、VEGF水平明顯高于正常組，明顯低于模型組(均P<0.001)；高劑量組Max、Min、TAMx水平明顯高于低劑量組、中劑量組，高劑量組IL-6、VEGF水平明顯低于低劑量組、中劑量組(均P<0.001)。見(jiàn)表2。

表2 5組CRA血流動(dòng)力學(xué)及IL-6、VEGF變化

3 討 論

DR屬于DM最常見(jiàn)的并發(fā)癥，視網(wǎng)膜血管屏障的破壞、血管通透性增加、視網(wǎng)膜局部缺氧等病理現(xiàn)象均有多種炎性因子參與〔6〕。視網(wǎng)膜微血管循環(huán)功能異常開(kāi)始在DR最早時(shí)期，視網(wǎng)膜微血管循環(huán)功能異常主要表現(xiàn)是血液流變學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)〔7〕。DR的病理特征主要有視網(wǎng)膜新生血管形成和血-視網(wǎng)膜屏障破壞〔8〕。

黃芪主要成分包括黃芪總黃酮、黃芪總皂苷、黃芪總多糖及各種氨基酸和微量元素等〔9〕。主要藥理作用有利尿降壓、抗炎鎮(zhèn)痛，抗氧自由基生成及提高免疫功能〔10〕。有學(xué)者研究表示，DM患者及并發(fā)癥使用黃芪治療有一定的療效，可以改善學(xué)流動(dòng)力學(xué)，使血糖降低，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的同時(shí)還可以抑制微血管病變的功能〔11〕。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，患者高糖狀態(tài)下產(chǎn)生的大量活性氧可以被黃芪甲苷有效清除，并且可以在調(diào)節(jié)足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)后，來(lái)抑制足細(xì)胞凋亡〔12〕。

本研究顯示，DR大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞排列出現(xiàn)雜亂、稀疏現(xiàn)象，視網(wǎng)膜內(nèi)外顆粒層細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡樣變化，使用黃芪提取物進(jìn)行干預(yù)的DR大鼠膜組織細(xì)胞排列雜亂、稀疏、內(nèi)外顆粒層細(xì)胞腫脹、空泡樣變化明顯緩解，出現(xiàn)這一研究結(jié)果原因可能是使用黃芪提取物進(jìn)行干預(yù)能夠調(diào)節(jié)DR大鼠血糖、血脂水平，從而發(fā)揮干預(yù)效果。黃芪干燥根中提取的大分子多糖成分屬于黃芪多糖，抵抗自由基損傷，可以清除氧自由基，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，調(diào)節(jié)免疫功能、抗衰老等多種功效〔13〕。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以調(diào)節(jié)血脂，降低正常人群血液中的TC、TG、LDL-C水平〔14〕。本研究說(shuō)明，使用黃芪提取物可以有效調(diào)控血脂指標(biāo)水平，從而對(duì)DR大鼠起到干預(yù)效果。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在DM慢性炎癥反應(yīng)中，多種炎性因子逐漸受到重視，IL-6在DM中存在獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在急性相反應(yīng)中屬于始發(fā)因子和主要物質(zhì)，胰島素與其相互作用〔15〕。研究顯示，增加到一定程度上的IL-6，可以抑制胰島素分泌，進(jìn)而損傷β細(xì)胞，導(dǎo)致DM的加重〔16,17〕。VEGF在DR患者中屬于一種可溶性血管因子，由視網(wǎng)膜缺血產(chǎn)生，不僅可以使血管再生，還可以增加血管的通透性，在患者視網(wǎng)膜缺血狀態(tài)下，VEGF會(huì)異常高表達(dá)，從而促進(jìn)患者視網(wǎng)膜新生血管生長(zhǎng)，加重患者病情〔18,19〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，黃芪提取物能夠調(diào)控IL-6、VEGF及血糖水平，改善血糖及眼底視網(wǎng)膜環(huán)境，從而治療DR大鼠。

CRA是眼動(dòng)脈終末分支，反映視網(wǎng)膜學(xué)流動(dòng)力學(xué)改變可以通過(guò)監(jiān)控患者血流流速，血液流變學(xué)改變主要體現(xiàn)在紅細(xì)胞凝集性增高、變形能力下降和血液黏度增高，視網(wǎng)膜學(xué)流動(dòng)力學(xué)變化監(jiān)測(cè)可以檢測(cè)以上相關(guān)指標(biāo)〔20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，黃芪提取物能夠調(diào)控Max、Min、TAMx水平，改善動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)眼部血管學(xué)流動(dòng)力學(xué)水平，從而發(fā)揮干預(yù)效果。

綜上，黃芪提取物能夠調(diào)控血脂紊亂，改善血糖及眼底血液供應(yīng)，從而治療DR大鼠，為臨床治療DR提供理論依據(jù)。