基于TLR4/NF-κB信號通路探討槲皮素對直腸癌模型大鼠炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)的影響

馬仕虎 余昌達(dá) 陳志冰 張開華

(九江市第一人民醫(yī)院普外科，江西 九江 332000)

直腸癌(CRC)是胃腸道最常見的惡性腫瘤，也是世界上第三大癌癥相關(guān)死亡原因〔1〕，統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，男性比女性更易患直腸癌〔2〕。盡管CRC可以在任何年齡發(fā)生，但這種疾病的發(fā)生與年齡密切相關(guān)，最常見于50歲以上的人〔3〕。其他與生活方式和飲食因素相關(guān)的危險(xiǎn)因素包括大量食用紅色或加工過的肉類、肥胖、低水平的體力活動和吸煙，據(jù)報(bào)道都是導(dǎo)致CRC發(fā)生和發(fā)展的因素〔4〕。此外，CRC通常伴隨著預(yù)后不良，在高收入國家(如澳大利亞、加拿大、美國和一些歐洲國家)5年相對生存率低于65%，但在低收入國家仍然低于50%〔2〕。目前CRC的治療方法已經(jīng)取得一定效果，但是耐藥及治療后的轉(zhuǎn)移仍是亟待解決的一大難題。因此探究合適的治療藥物對于CRC的研究意義重大。槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮)是廣泛分布于各種水果和蔬菜中。槲皮素及其衍生物具有許多健康促進(jìn)作用，包括腫瘤的治療。Toll樣受體(TLR)4和核因子(NF)-κB在包括CRC在內(nèi)的腫瘤發(fā)生過程中扮演著重要的角色。研究表明，在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)展成CRC的研究中發(fā)現(xiàn)，使TLR4/NF-κB信號通路失活，可以減輕脂多糖(LPS)處理的人結(jié)腸組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，阻止CRC的發(fā)生〔5〕。本研究通過建立CRC大鼠模型，從TLR4/NF-κB通路著手，研究槲皮素介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號通路對CRC模型大鼠炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SW480(美國ATCC)保存在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，美國Invitrogen，美國)。雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購于濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動物有限公司。二甲基肼(DMH)購于J&K化學(xué)技術(shù)公司；槲皮素注射液來自醫(yī)院合作實(shí)驗(yàn)室；TLR4和NF-κB p65一抗，購于abcam公司；PrimeScript RT試劑盒購于寶日醫(yī)生物科技公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司；PCR試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物模型構(gòu)建和分組 選擇雄性SD大鼠(體重160～170 g)60只，在受控條件下將其置于適當(dāng)?shù)幕\子中使其適應(yīng)環(huán)境，并飼喂市售固體食物，大鼠隨意進(jìn)食和飲水。分為4組：Model組、槲斗皮素-L(25 mg/kg)組、槲斗皮素-M(50 mg/kg)組和槲斗皮素-H(75 mg/kg)組，選擇NC組作為正常對照。NC組和Model組腹腔注射二甲基亞砜(DMSO)0.2 ml，生理鹽水1 ml，1次/d；槲皮素處理組按照對應(yīng)濃度每天腹腔注射，生理鹽水1 ml，1次/d。每周皮下注射DMH(30 mg/kg)，持續(xù)18 w，建立CRC模型。動物實(shí)驗(yàn)獲得了醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2.2ELISA測定 在麻醉狀態(tài)下取血后頸椎脫臼處死，4℃離心分離血清，分離后的血清放置在-80℃保存，使用ELISA試劑盒檢測血清中白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色 所有的腫瘤標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，進(jìn)行HE染色，按照試劑盒操作進(jìn)行試驗(yàn)。HE染色光鏡病理組織學(xué)檢查并攝片，觀察各組顯色情況。在形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，在100倍放大倍數(shù)下取不同組別，并隨機(jī)采集圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4qRT-PCR法 采用RNA提取試劑盒(10296010，Invitrogen公司，上海，中國)提取各組腫瘤組織或職場組織總RNA，鑒定RNA純度和完整性后，然后使用PrimeScript RT試劑盒(RR014A，寶日醫(yī)生物科技公司，北京，中國) 將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μl，設(shè)計(jì)TLR4、NF-κB p65和GAPDH引物，交由TaKaRa公司合成。按PCR試劑盒操作步驟進(jìn)行qRT-PCR，采用2-△△Ct法檢測各組基因的表達(dá)量并進(jìn)行比較。

1.2.5Western印跡 采用總蛋白提取液RIPA試劑盒(R0010，北京索萊寶科技有限公司)提取同一患者的直腸癌組織和癌旁組織總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)方法測定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進(jìn)行定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，5%牛血清蛋白(BSA)室溫下封閉1 h。滴加稀釋的一抗小鼠抗人單克隆抗體TLR4和NF-κB p65，GAPDH，36 kD為內(nèi)參照。4℃過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次10 min，然后孵育辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體。TBST漂洗3次。使用凝膠成像分析系統(tǒng)分析，以樣本的平均吸光度除以相應(yīng)內(nèi)參照的平均吸光度，即為樣本蛋白的相對含量，然后將各樣本蛋白的相對含量間做統(tǒng)計(jì)分析圖。一抗和二抗都是購自Abcam公司，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù) 碘化丙啶(PI)單染法檢測：分別取各組組織100 mg，放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿中，用眼科剪剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整為1×106個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞1 500 r/min離心10 min，棄上清，每毫升細(xì)胞加2 ml PBS，再離心，棄上清后，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。第二天用PBS洗滌細(xì)胞2次，取100 μl細(xì)胞懸液，加入50 μg含RNAase的PI染液，避光30 min后用100目的尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/PI雙標(biāo)染色：將處理好的細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞、洗滌、離心，將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1槲皮素抑制直腸癌大鼠腫瘤發(fā)生 NC組、Model組、Quercetin-L組、Quercetin-M組、Quercetin-H組分別有12、11、10、9、9只大鼠存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。Model組、Quercetin-L組、Quercetin-M組、Quercetin-H組大鼠直腸腫瘤發(fā)生率分別為100%(11/11)，100%(10/10)，77.8%(7/9)，66.7%(6/9)。

2.2槲皮素抑制IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá) Model組炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α表達(dá)較NC組顯著升高(P<0.05)，與Model組相比，槲皮素各處理組炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α顯著降低(P<0.05)。且隨著槲皮素濃度增大，IL-1β，IL-6，TNF-α表達(dá)明顯降低(均P<0.05)，見表1。

2.3槲皮素改善CRC組織病理結(jié)構(gòu) HE染色結(jié)果顯示，NC組組織結(jié)構(gòu)完整，腸腺排列規(guī)則，而Model組結(jié)腸組織上皮細(xì)胞不規(guī)則，出現(xiàn)畸形腺窩灶，結(jié)構(gòu)被破壞，槲皮素-L組、槲皮素-M組、槲皮素-H組結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)稍微有所改善，并且隨著槲皮素濃度的增大，病理結(jié)構(gòu)依次改善，見圖1。

2.4槲皮素抑制TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá) Model組TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)較NC組顯著升高(P<0.05)，與Model組相比，槲皮素各處理組TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白明顯降低(P<0.05)，且隨著槲皮素濃度增大，TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見表1、圖2。

表1 各組CRC炎癥因子IL-1β、IL-6、TLR4、NF-κB p65 mRNA及蛋白表達(dá)

圖1 各組組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)

2.5槲皮素促進(jìn)CRC細(xì)胞凋亡 與NC組相比，Model組S期、G2/M期細(xì)胞明顯增多，G0/G1期細(xì)胞明顯減少，與Model組相比，槲皮素各處理組S期、G2/M期細(xì)胞明顯減少，G0/G1期細(xì)胞明顯增多(P<0.05)，且隨著槲皮素濃度增大，G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期、G2/M期細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)染色法檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，Model組凋亡率明顯減少(P<0.05)，與Model組相比，槲皮素各處理組凋亡率明顯降低(P<0.05)，且隨著槲皮素濃度增大(P<0.05)，各組細(xì)胞凋亡率明顯降低增大，見表2、圖3。

1～5：NC組，Model組，槲皮素-L組，槲皮素-M組，槲皮素-H組

表2 槲皮素促進(jìn)CRC細(xì)胞凋亡

3 討 論

CRC常伴有嚴(yán)重的腸道和身體免疫系統(tǒng)疾病。腫瘤介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是其重要的病理特征之一，也是治療腫瘤中遇到的難題。Malcomson等〔6〕研究表明，細(xì)胞的炎癥反應(yīng)促進(jìn)CRC的發(fā)生發(fā)展，通過改善炎癥反應(yīng)可以改善腫瘤的進(jìn)程，Solmaz等〔7〕研究表明，miR-330誘導(dǎo)通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子(BACH)1表達(dá)來抑制CRC細(xì)胞的增殖，能夠進(jìn)一步調(diào)控炎癥反應(yīng)進(jìn)程，說明炎癥反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞之間存在著密切的調(diào)控關(guān)系在治療方面，對于CRC患者，化學(xué)療法是不可避免的治療方法，但是會加劇免疫功能障礙。腸黏膜炎是接受聯(lián)合化療的癌癥患者中最常見和最有害的副作用之一，目前尚無有效的預(yù)防和控制措施。所以從炎癥反應(yīng)進(jìn)行突破，尋找更加有效，副作用更小的CRC治療藥物有重要的意義。

槲皮素在正常細(xì)胞中具有潛在的抗癌能力，而沒有明顯的細(xì)胞毒性〔8〕。越來越多的研究表明槲皮素可能對各種類型的癌癥(如結(jié)腸癌)具有治療作用。Qi等〔9〕研究表明，槲皮素和β-葡聚糖交替食用可以降低結(jié)腸癌小鼠的死亡率。 另一項(xiàng)研究表明，槲皮素負(fù)載的單甲氧基聚(乙二醇)e聚(ε-己內(nèi)酯)納米膠束在體外和體內(nèi)均可表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗腫瘤活性，這可能是CRC治療的潛在候選藥物〔10〕。在其他腫瘤中，槲皮素可以通過降低Notch 1的表達(dá)及下游信號蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化水平改善白血病細(xì)胞的〔11〕。槲皮素還可以靶向調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中的癌干樣細(xì)胞和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型〔12〕。

TLR是位于細(xì)胞表面的活性分子，可以觸發(fā)細(xì)胞質(zhì)信號通路來激活核因子(如NF-κB，IRF)，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，耐藥性及免疫細(xì)胞募集到腫瘤部位〔13〕。TLR系統(tǒng)構(gòu)成了一把雙刃劍，需要在腫瘤疾病的治療中進(jìn)行專門研究，TLR4被公認(rèn)為是促進(jìn)許多癌細(xì)胞免疫逃逸的關(guān)鍵因子〔14〕。NF-κB在腫瘤調(diào)控中也發(fā)揮重要作用，Zhu等〔15〕研究表明，MyD88調(diào)節(jié)的LPS/NF-κB/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路影響LPS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞的炎癥和生物學(xué)行為。Li等〔16〕在CRC中的研究表明，抑制NF-κB P65移位進(jìn)入細(xì)胞核能夠大腸癌異種移植物的肺轉(zhuǎn)移，Ezrin和NF-κB的異常激活與大腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。