殼寡糖調(diào)節(jié)db/db小鼠糖脂異常和抗氧化作用

程沁園 馬明 嚴(yán)琳 吳小瑜

(無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 無錫 214111)

糖尿病是我國老年人群中的高發(fā)性疾病之一，是由于胰島素生成缺陷或(和)作用缺陷而引起的血糖水平超高〔1〕，其中90%以上均為2型糖尿病。其發(fā)病機(jī)制尚未完全探明，主要與遺傳因素、環(huán)境、生活方式與免疫等因素密切相關(guān)〔2〕。db/db小鼠屬遺傳性肥胖2型糖尿病動物模型，其發(fā)病與瘦素基因有關(guān)，可用于2型糖尿病血脂紊亂的研究和抗糖尿病物質(zhì)的篩選〔3〕。糖尿病前期是介于糖代謝正常與糖尿病之間的一個狀態(tài)，包括空腹血糖受損(IFG)和糖耐量受損(IGT)，我國20 歲以上人群中糖尿病前期比例高達(dá)15.5%〔4〕。糖尿病前期不是一種疾病，而是一種不穩(wěn)定的狀態(tài)，既可以進(jìn)一步發(fā)展為顯性糖尿病，也可通過適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施而恢復(fù)正常或延長此過渡期〔5〕，對該人群進(jìn)行早期干預(yù)，可使2型糖尿病發(fā)病危險降低58%〔4〕，因此選擇合適化合物對其進(jìn)行干預(yù)具有重要的研究意義。殼聚糖是來源于甲殼類動物的一種線性多糖，其部分水解產(chǎn)物殼寡糖(COS)具有與其類似的生物活性，如抗菌、降低膽固醇、抗腫瘤等〔6～12〕。COS曾被報道具有降血糖作用〔13～15〕，臨床試驗(yàn)表明，COS顯著改善了血糖水平、糖化血紅蛋白、促炎細(xì)胞因子及脂聯(lián)素水平〔16〕。然而，由于COS活性受分子量和脫乙酰度等性質(zhì)的影響較大，各研究結(jié)論并不一致。同時關(guān)于COS在糖尿病前期的影響研究較少，一般都是出現(xiàn)血糖異常后才開始服用COS，對于其是否能預(yù)防或延緩糖尿病前期向糖尿病發(fā)展的作用有待研究。本文以db/db小鼠為自發(fā)性2型糖尿病模型動物，在其血糖尚未異常時給予不同劑量COS，探索COS在糖尿病前期和糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中對血糖異常、血脂異常和體內(nèi)氧化應(yīng)激等過程的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 自發(fā)性糖尿病db/db小鼠40只〔SPF標(biāo)準(zhǔn)，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010〕，雄性，4周齡，體重(24.0±2.0)g，購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，穩(wěn)定飼養(yǎng)1 w以適應(yīng)環(huán)境。

1.2試劑及設(shè)備 COS(Mw=1 000 Da)，購自浙江金殼藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號M-KG-1809001。正置顯微鏡：NIKON公司，型號ECLIPSE Ni；石蠟切片機(jī)：湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司，型號SQ2125；攤片機(jī)：湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司，型號PPTHK-21B；顯微圖像分析系統(tǒng)：NIKON公司，型號DS-Ri2；血糖測定儀：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，型號306悅準(zhǔn)Ⅱ型；血糖試紙：江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，生產(chǎn)批號380224；糖原、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、總蛋白定量測試盒：均為南京建成生物工程研究所；蘇木素染液，珠海貝索(BASO)生物技術(shù)有限公司，貨號714094；伊紅染液，珠海貝索(BASO)生物技術(shù)有限公司，貨號BA4099；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3動物分組及受試物劑量 小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，其中對照(Control)組按體重每日灌胃生理鹽水(10 ml/kg)；COS低、中、高劑量(COS-L、COS-M、COS-H)組每日稱重后按250、500、1 000 mg/kg體重劑量灌胃COS溶液。連續(xù)給藥16 w，各組均自由進(jìn)食飲水。

1.4指標(biāo)觀察 (1)每日給藥后觀察各組小鼠的一般狀況并記錄。(2)血糖測定〔17〕：每周測定1次空腹血糖(FBG)。提前禁食8 h，取小鼠尾尖血約5 μl，用血糖儀測定即得FBG。(3)口服糖耐量測定(OGTT)〔18〕：每4 w測定1次。提前禁食8 h，每組按體重灌胃250 mg/kg葡萄糖，分別于0.0、0.5、1.0、2.0 h取尾尖血測定餐后血糖值(PG)，計(jì)算曲線下面積(AUC)。 (4)糖尿病病程判斷：根據(jù)2012年世界衛(wèi)生組織(WHO)診療標(biāo)準(zhǔn)〔13〕，db/db小鼠FBG≥7.0 mmol/L或OGTT試驗(yàn)中2 h PG≥11.1 mmol/L時即為糖尿??；6.1 mmol/L≤FBG<7.0 mmol/L且OGTT試驗(yàn)中2 h PG<7.8 mmol/L時為IFG階段；7.8 mmol/L≤OGTT試驗(yàn)中2 h PG<11.1 mmol/L且FBG<7.0 mmol/L時為IGT階段。(5)血脂指標(biāo)檢測：給藥周期結(jié)束后采血，按測試盒說明書操作測定TC、TG、HDL-C、LDL-C等各項(xiàng)指標(biāo)。(6)肝糖原和肌糖原測定：給藥周期結(jié)束后斷頸處死db/db小鼠，取其肝臟和右后肢股直肌，用生理鹽水清洗干凈后按照測試盒說明書進(jìn)行測定。(7)肝臟抗氧化指標(biāo)檢測：取db/db小鼠部分肝臟，用生理鹽水清洗干凈后吸干表面，按照測試盒說明書操作測定總蛋白、SOD、GSH-Px、MDA等各項(xiàng)指標(biāo)。(8)器官系數(shù)及組織學(xué)檢查：db/db小鼠處死后立即剖取胰腺、肝、脾、腎等器官，生理鹽水清洗干凈后吸干表面，稱重計(jì)算器官系數(shù)(器官重量與小鼠體重之比)。各器官作組織切片，蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察其組織學(xué)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1COS對血糖的影響 Control組db/db小鼠FBG上升很快，第1周即已超過6.1 mmol/L，進(jìn)入IFG階段；第3周已超過7.0 mmol/L，進(jìn)入糖尿病階段，病程發(fā)展較為迅速。COS對FBG控制見效快，攝入1 w后即可顯著降低FBG(P<0.05)，至第3～4周時各劑量均已可顯著降低FBG(P<0.01)；至第16周時，COS-L、COS-M、COS-H各組FBG分別較對照組降低了40.89%、39.27%和51.01%。見表1。

表1 攝入COS對各組FBG的影響

2.2攝入COS對各組OGTT實(shí)驗(yàn)中AUC的影響 COS降低AUC的作用十分迅速且顯著，自第4周起各COS組的AUC即顯著低于Control組(P<0.01)；至試驗(yàn)結(jié)束時，COS各劑量組AUC分別較對照組降低了20.55%、19.53%和20.87%，即該作用無劑量依賴性。見表2。

2.3COS對各組db/db小鼠自發(fā)性2型糖尿病發(fā)展進(jìn)程的影響 Control組平均進(jìn)入IFG階段的時間是在試驗(yàn)第1周，進(jìn)入IGT階段并發(fā)展為糖尿病的速度較快，第2周已進(jìn)入糖尿病階段；COS各組進(jìn)入糖尿病前期和糖尿病階段的時間均有一定的延后，但均在第2～3周進(jìn)入IFG階段，在第5～6周時進(jìn)入糖尿病階段。COS對延長db/db小鼠IGT階段的效果較好，尤其是在COS-H組中db/db小鼠進(jìn)入IGT階段的時間被延長至第6周。攝入低、中、高劑量的COS可延長db/db小鼠處于糖尿病前期的時間，使其進(jìn)入糖尿病階段的時間分別延長至第4周、第5周和第5周(Control組為第2周)，即可延緩db/db小鼠的自發(fā)性2型糖尿病的發(fā)展進(jìn)程。見表3。

表2 攝入COS對AUC的影響

2.4COS對肝糖原和肌糖原的影響 與Control組相比，各劑量COS組均可顯著地提高肝臟和肌肉中糖原的含量，且具有劑量依賴性(均P<0.05)。見表4。

2.5COS對血脂的影響 與Control組比較各劑量COS組血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)，HDL-C水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表4。

2.6COS對肝臟抗氧化指標(biāo)的影響 與Control組比較，各劑量COS組肝組織內(nèi)SOD和GSH-Px比活力有所提高，COS-M組和COS-H組SOD、GSH-Px比活力明顯提高，COS-L組、COS-M組、COS-H組MDA水平顯著降低(均P<0.01)。見表5。

2.7COS對器官系數(shù)和組織學(xué)檢查的影響 攝入COS對db/db小鼠胰腺、肝臟、脾和腎等器官系數(shù)的影響如表5所示。與Control組比較，COS-L組、COS-M組、COS-H組胰腺和腎的器官系數(shù)差異顯著(均P<0.01)，肝臟和脾器官指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。見表5。組織切片結(jié)果見圖1，Control組胰腺萎縮，形狀不規(guī)則，有炎細(xì)胞浸潤，胰腺受損，COS各組胰腺均為較完整的橢圓形，形態(tài)較為完好，炎細(xì)胞減少，即COS對胰腺組織具有一定的保護(hù)作用，可部分抵御血糖異常引起的胰腺損傷。COS組肝臟內(nèi)脂肪空泡數(shù)量明顯減少(圖中黑色箭頭所示)，肝細(xì)胞排列整齊，肝組織形態(tài)有所改善。

表3 各組自發(fā)性2型糖尿病發(fā)生發(fā)展情況

表4 COS對各組db/db小鼠肝糖原、肌糖原和血脂的影響

表5 攝入COS對肝臟抗氧化指標(biāo)的影響及器官系數(shù)的變化

圖1 COS對各組胰腺組織的影響(HE染色，×200)

3 討 論

國際糖尿病聯(lián)盟的研究表明，幾乎所有的2型糖尿病患者發(fā)病前都要經(jīng)過糖尿病前期階段(IGT或IFG)，而且隨著病程的逐漸延長，其轉(zhuǎn)化為糖尿病的自然年轉(zhuǎn)化率逐年升高〔19〕。糖尿病前期階段是一可逆階段，人體內(nèi)糖代謝、脂代謝等已開始處于代償性紊亂狀態(tài)，是由正常人群向糖尿病患者過渡的階段。因此，對糖尿病前期人群進(jìn)行及時有效的干預(yù)和治療，通過改變飲食習(xí)慣和增加體育鍛煉，并輔以必要的藥物干預(yù)，對延緩糖尿病前期向2型糖尿病轉(zhuǎn)變，減少相關(guān)并發(fā)癥等有著非常重要的作用〔20〕。已有多篇文獻(xiàn)報道COS具有較好的降血糖作用〔1，17，21，22〕，然而其作用對象均為已發(fā)生血糖異常的患者或動物，且降糖效果隨COS性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)對象等不同而有較大差異。

本研究結(jié)果表明，COS可將db/db小鼠進(jìn)入IFG、IGT和糖尿病階段的時間都有所延后，延長其處于糖尿病前期的時間，對自發(fā)性糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有一定的阻滯作用。肝臟是哺乳動物進(jìn)行葡萄糖新陳代謝的一個主要場所，通過進(jìn)行糖原合成以及糖酵解過程增加肝臟葡萄糖的攝取，通過糖原分解和糖異生作用增加肝臟葡萄糖的輸出，從而保持機(jī)體血糖處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)〔23〕。2型糖尿病患者的胰島素抵抗在肝臟組織主要表現(xiàn)為肝糖輸出增多，從而造成FBG升高〔24〕。骨骼肌也是2型糖尿病胰島素抵抗發(fā)生的主要組織，由小腸吸收的葡萄糖經(jīng)門靜脈先被肝臟攝取和利用，其余進(jìn)入體循環(huán)的葡萄糖主要被骨骼肌攝取，代謝轉(zhuǎn)化為肌糖原儲存，因此骨骼肌攝取葡萄糖的減少是餐后血糖升高的主要原因之一〔17〕。已有研究顯示〔6〕，COS的降糖機(jī)制可能與骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取增加、肝葡萄糖生成減少有關(guān)，與本研究中肝糖原和肌糖原的變化一致。提示COS降低db/db小鼠血糖的機(jī)制之一為減少糖原分解，使肝、肌糖輸出減少，增加葡萄糖攝取，減少游離葡萄糖，使血糖濃度下降。

糖尿病不僅可引起血糖升高，還可加速脂肪分解，過多的脂肪酸重新酯化成TG釋放入血，形成高脂血癥等并發(fā)癥〔25〕。COS具有良好的降脂作用，Muanprasat等〔6〕研究表明，COS可抑制胰腺脂肪酶活性，并與膽汁酸結(jié)合，導(dǎo)致腸道脂肪吸收減少，糞便脂肪排泄增加。COS的攝入抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的細(xì)胞分化、TG的積累和成脂標(biāo)志物的表達(dá)，并抑制大鼠和小鼠肥胖模型的脂肪積累〔26〕。因此COS不僅可延緩db/db小鼠的糖尿病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，還可以通過降低體內(nèi)TC、TG和LDL-C改善其血脂異常，預(yù)防和延緩相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果提示，COS可部分改善糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中伴隨的血脂異常。因此，COS不僅可延緩db/db小鼠糖尿病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，還可以通過降低體內(nèi)TC、TG和LDL-C水平，改善其血脂異常，預(yù)防和延緩相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

氧化應(yīng)激與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。由于持續(xù)和慢性高血糖，糖尿病患者在胰島中表現(xiàn)出高氧化應(yīng)激標(biāo)志物和活性氧(ROS)，從而消耗抗氧化防御系統(tǒng)的活性，促進(jìn)自由基生成；自由基水平異常高和抗氧化防御機(jī)制同時下降可能導(dǎo)致細(xì)胞和酶的損傷、脂質(zhì)過氧化增加和胰島素抵抗的發(fā)展〔27〕。SOD和GSH-Px能夠清除超氧陰離子和羥基離子，是體內(nèi)重要的抗氧化酶。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，是脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)〔28〕。本研究結(jié)果提示，COS可有效減輕氧化應(yīng)激引起的氧化損傷。COS提高了db/db小鼠體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活力，降低氧化損傷，這可能是其減緩db/db小鼠糖尿病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的機(jī)制之一。本研究結(jié)果提示，COS可改善胰腺組織形態(tài)，增加胰腺系數(shù)，減少肝組織脂肪空泡，可使肝臟系數(shù)有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與以往報道有所不同〔29〕，這可能是與所用COS性質(zhì)、劑量和時間等不同有關(guān)。糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，而腎臟肥大是糖尿病腎病早期的重要病理特征〔29〕。本研究提示，COS可有效控制腎臟肥大，對糖尿病小鼠的腎臟具有保護(hù)作用，對糖尿病腎病的預(yù)防和治療具有一定的作用，可部分抵御糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中代謝異常引起的組織損傷。

綜上，COS可能通過控制血糖、改善血脂異常、抵抗體內(nèi)氧化應(yīng)激、保護(hù)組織等途徑延緩自發(fā)性糖尿病發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，但是否還存在其他作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。