三維打印血管的研究進(jìn)展

陳藝菲，張辰玥，張璟嵐，張濱婧，戎 鑫，胡芝愛(ài)

人造器官和組織可用于藥物評(píng)價(jià)、器官移植等多個(gè)方面，具有非常誘人的應(yīng)用前景。人造組織的技術(shù)在再生修復(fù)牙髓壞死、頜面創(chuàng)傷、頜面腫瘤切除等導(dǎo)致的口腔頜面部組織缺損方面具有重要意義[1-2]。但目前人造器官和組織的研發(fā)還面臨諸多瓶頸，其中一項(xiàng)是欠缺有效的血管化。在缺乏充足血管網(wǎng)絡(luò)的情況下，組織深部氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)受限、代謝產(chǎn)物不能及時(shí)排出，可能導(dǎo)致器官及組織中心部位細(xì)胞的壞死[3-4]。

促血管再生的方法包括細(xì)胞共培養(yǎng)、生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)、脫細(xì)胞血管支架、細(xì)胞膜片、三維(three-dimensional， 3D)打印等。向組織工程結(jié)構(gòu)中添加生長(zhǎng)因子能夠誘導(dǎo)血管新生[5]，但生長(zhǎng)因子的半衰期較短且價(jià)格昂貴，并且其特異性也缺乏具體的研究[6]。脫細(xì)胞血管支架雖能在促血管化的同時(shí)避免宿主免疫排斥反應(yīng)，但脫細(xì)胞技術(shù)仍有許多問(wèn)題亟待解決，例如：殘留的洗滌劑和酶引起的不良反應(yīng)，細(xì)胞去除不徹底，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和機(jī)械完整性，脫細(xì)胞支架的滅菌及體外保存技術(shù)等[7]。細(xì)胞膜片技術(shù)雖能提高細(xì)胞生存率，但由于細(xì)胞膜片疊加層數(shù)有限，以其構(gòu)建功能化血管的方法較為復(fù)雜[8]。

近年來(lái)，3D打印技術(shù)飛速發(fā)展，并被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。3D打印技術(shù)指在個(gè)性化數(shù)字設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)分層沉積材料的方式構(gòu)建物理對(duì)象的過(guò)程。3D生物打印(bioprinting)技術(shù)指活細(xì)胞與生物材料的共同打印，以個(gè)性化數(shù)字設(shè)計(jì)為藍(lán)本逐層打印，以制造最大限度模仿自然組織特征的活體結(jié)構(gòu)[9]。3D生物打印提供了一種具有高度可控性、可復(fù)制、可擴(kuò)展的組織重建方法，可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，包括再生醫(yī)學(xué)、體外疾病建模等[10]。

傳統(tǒng)的擠出式生物打印技術(shù)適用于機(jī)械性能強(qiáng)的高黏度生物墨水，而構(gòu)建血管的生物材料具有質(zhì)地柔軟、黏度較低、較難成形的特點(diǎn)[11]，為克服生物材料成形性能的限制，打印高精度且具有生物功能的血管結(jié)構(gòu)，同時(shí)促進(jìn)血管再生及組織修復(fù)，三維打印使用的材料與方法得到了改良?，F(xiàn)就三維打印血管的研究進(jìn)展作一綜述，簡(jiǎn)述幾種可構(gòu)建血管結(jié)構(gòu)的改良3D打印技術(shù)，并分析其優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展前景。

1 3D打印血管的前沿技術(shù)

1.1 懸浮打印

擠出式生物打印是應(yīng)用最廣泛的打印方法，適用于多種生物材料的打印，但在構(gòu)建高精度組織時(shí)仍需改進(jìn)。懸浮打印在擠出打印的基礎(chǔ)上引入了懸浮介質(zhì)，將打印噴頭直接置于懸浮介質(zhì)中進(jìn)行打印。如圖1所示，懸浮介質(zhì)應(yīng)具有剪切變稀特性，即在低剪應(yīng)力下表現(xiàn)為剛性固態(tài)，而當(dāng)打印噴嘴運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪應(yīng)力增加至高于屈服應(yīng)力時(shí)則表現(xiàn)為流動(dòng)性良好的黏性流體。故噴嘴移動(dòng)后隨著剪應(yīng)力逐漸減小消失，原位置周圍的支持浴又重新變?yōu)楣虘B(tài)。該特性保證了打印結(jié)構(gòu)能夠?qū)崿F(xiàn)自支撐，即使是在打印低黏度生物材料時(shí)也能保證打印結(jié)構(gòu)不易坍塌變形[12]。明膠、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯(poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide)， Pluronic F-127)、鋰藻土(laponite)等生物材料因具有這一特性，具備成為懸浮介質(zhì)的潛力[13]。同時(shí)由于噴嘴可以在懸浮介質(zhì)中自由移動(dòng)，懸浮打印還能實(shí)現(xiàn)全方向打印而不僅局限于自上而下的逐層沉積。這些優(yōu)點(diǎn)使懸浮打印適用于高效構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)等高精度結(jié)構(gòu)[14]。

根據(jù)懸浮介質(zhì)的用途，懸浮打印血管網(wǎng)大致可以分為兩類[14-15]。一類(圖1a)是將懸浮介質(zhì)作為成形材料，去除打印的材料，形成包含血管網(wǎng)絡(luò)的中空血管化結(jié)構(gòu)；另一類(圖1b)是將懸浮介質(zhì)作為犧牲材料，成形后保留打印的血管化結(jié)構(gòu)[16]。

懸浮打印通過(guò)打印針頭移動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的剪切力變化改變懸浮介質(zhì)流變性。a：保留懸浮介質(zhì)，將打印墨水作為犧牲材料在打印結(jié)束后去除，得到預(yù)留血管形態(tài)的中空結(jié)構(gòu)；b:去除懸浮介質(zhì)，將懸浮介質(zhì)作為犧牲材料在打印結(jié)束后去除，得到高精度血管結(jié)構(gòu)

1.1.1 保留懸浮介質(zhì)

通過(guò)保留懸浮介質(zhì)，可構(gòu)建含有可灌注血管結(jié)構(gòu)空腔的組織結(jié)構(gòu)。該方法既能打印內(nèi)部結(jié)構(gòu)又能構(gòu)建外部輪廓，在根據(jù)特定組織缺損的醫(yī)學(xué)成像定制植入式血管化人工組織方面具有較高的利用價(jià)值。

Wu等[16]利用Pluronic F-127作為犧牲生物墨水在屈服應(yīng)力流體丙烯?；鵓luronic F-127(Pluronic F127 diacrylate， PF127-DA)中打印微血管，光固化懸浮介質(zhì)后在4 ℃下去除液態(tài)的犧牲材料，最終全向打印出了3D仿生微血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但由于PF127-DA的自愈能力較差，打印的分辨率還需提高。除了Pluronic F-127，明膠也可以作為犧牲材料。Fitzsimmons等[17]比較了Pluronic F-127和明膠作為犧牲材料懸浮打印血管時(shí)的性能，發(fā)現(xiàn)Pluronic F-127因具有更大的壓縮模量及更好的可打印性，在打印精度上略高于明膠，但加入透明質(zhì)酸的明膠因?yàn)轲ざ仍黾觿t比Pluronic F-127更能抵抗塑性變形，因此在作為固態(tài)犧牲材料提供結(jié)構(gòu)支撐的情況下更有利于保持血管化結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.1.2 去除懸浮介質(zhì)

以犧牲懸浮介質(zhì)的方法打印血管時(shí)，在去除懸浮介質(zhì)時(shí)盡可能降低對(duì)打印結(jié)構(gòu)完整性和細(xì)胞活性的影響是成功打印的關(guān)鍵，這與懸浮介質(zhì)的選擇密不可分。明膠、Pluronic F-127等溫度響應(yīng)材料能在不損傷細(xì)胞活性的溫度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)固、液態(tài)轉(zhuǎn)變從而便于去除，常用作犧牲懸浮介質(zhì)[18]。

明膠因具有良好的生物相容性及優(yōu)秀的成形性，是作為懸浮介質(zhì)的重要材料之一，其在室溫下為固態(tài)，在37 ℃則熔化為液態(tài)。利用明膠的熱可逆性，Hinton等[11]以4.5%(質(zhì)量濃度)明膠和CaCl2溶液混合用作懸浮介質(zhì)支持浴，在其中嵌入打印海藻酸鈉形成血管樹(shù)結(jié)構(gòu)，最后加熱至37 ℃熔化并去除明膠漿，得到了高保真且可灌注的血管樹(shù)結(jié)構(gòu)。Kreimendahl等[19]在此基礎(chǔ)上將打印墨水替換為混合人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVECs)的纖維蛋白(Fibrin， FIB， 10 mg/mL)-透明質(zhì)酸(hyaluronan， HA， 5 mg/mL)溶液，這種低黏性的纖維蛋白生物墨水能更好地模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境從而促進(jìn)血管形成。

為了進(jìn)一步增加懸浮介質(zhì)對(duì)剪應(yīng)力的敏感性，Afghah等[20]將觸變性較好的鋰藻土與Pluronic F-127結(jié)合，得到了自愈能力更好的剪切變稀復(fù)合材料支撐浴，該體系可高保真地連續(xù)印刷復(fù)雜大型的結(jié)構(gòu)，同時(shí)保證較好的生物相容性，可用于復(fù)雜血管網(wǎng)的生物打印。

1.2 同軸打印

同軸生物打印是一種可以直接打印負(fù)載細(xì)胞的血管結(jié)構(gòu)的方法。如圖2所示，在同軸生物打印血管中，具有所需組織細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells， ECs)的生物墨水分別從同軸噴嘴的外部和內(nèi)部同時(shí)打印，因此，打印所得的組織大多由鞘-芯纖維組成，當(dāng)纖維中的芯結(jié)構(gòu)溶解形成通道時(shí)，其中的ECs會(huì)自動(dòng)沉積并黏附于通道“鞘”的內(nèi)壁上[21]?，F(xiàn)將同軸打印血管常用的“鞘”“芯”材料總結(jié)于表1。同軸生物打印在血管化組織的制造方面具有諸多優(yōu)勢(shì)，包括：精確控制鞘-芯部位材料的同時(shí)沉積，打印材料選擇廣泛，打印過(guò)程一步到位，可調(diào)節(jié)的釋放曲線以及通過(guò)內(nèi)部交聯(lián)提高分辨率等優(yōu)點(diǎn)。重要的是，同軸生物打印的組織結(jié)構(gòu)已被證實(shí)可以具備良好的生物學(xué)性能，打印的血管化結(jié)構(gòu)易與宿主整合[22]。同軸生物打印可以實(shí)現(xiàn)多級(jí)血管的打印，可打印的血管結(jié)構(gòu)包括10～300 mm的動(dòng)脈和靜脈、直徑為0.02～0.08 mm的小動(dòng)脈和小靜脈以及直徑通常為0.005～0.01 mm的毛細(xì)血管[23]。

圖2 直接同軸生物打印

表1 同軸打印常用的“鞘”“芯”材料

顯而易見(jiàn)的是，在同軸生物打印中，用于外部封裝細(xì)胞的生物墨水和犧牲墨水的特性，是決定其能否直接打印血管通道的重要因素。首先，兩者都需要具有優(yōu)越的生物相容性。除了常見(jiàn)的犧牲材料明膠，甲基丙烯酰明膠(gelatin methacryloyl， GelMA)作為一種光固化明膠的衍生物，因其具有可控的理化性質(zhì)及良好的生物相容性，可作為外部封裝細(xì)胞的生物墨水[28]。利用明膠及GelMA進(jìn)行同軸打印的步驟如圖2所示，首先將GelMA及明膠分別與組織細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞混合，前者作為“鞘”，后者作為“芯”進(jìn)行同軸打印，直接構(gòu)建具有血管通道的生物組織結(jié)構(gòu)[21]。通過(guò)該種方式可以用于具有血管通道的大規(guī)模復(fù)雜組織或器官，并且省去后續(xù)的細(xì)胞播種以提高制造效率。

除了負(fù)載細(xì)胞，同軸打印還可以通過(guò)負(fù)載藥物、生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管形成[29-30]。這證明了同軸生物打印是構(gòu)建可灌注血管并同時(shí)運(yùn)輸細(xì)胞及藥物的有效方法，以該方法制造的具有可灌注血管結(jié)構(gòu)的組織，在組織修復(fù)和再生領(lǐng)域都展現(xiàn)出較高的應(yīng)用價(jià)值。

1.3 4D生物打印

3D生物打印技術(shù)通過(guò)模仿及復(fù)制體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，促進(jìn)組織及器官的再生，但無(wú)法非干預(yù)、動(dòng)態(tài)地構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。為使生物打印結(jié)構(gòu)的幾何形狀能針對(duì)外部刺激進(jìn)行改變，引入時(shí)間概念的4D生物打印技術(shù)逐漸興起，“智能”可變材料也隨之出現(xiàn)[31]。變形效應(yīng)(shape-morphing effect，SME)是“智能”材料的固有屬性，即材料在外界刺激下形狀變化或恢復(fù)的能力[32]。變形效應(yīng)可以由溫度、濕度、光照等多方面的刺激產(chǎn)生，從而使打印結(jié)構(gòu)的形狀隨時(shí)間改變，從而成功引入第四維度——時(shí)間，同時(shí)并不會(huì)損傷細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)[31]。

具有變形效應(yīng)的刺激響應(yīng)材料是4D生物打印的關(guān)鍵。根據(jù)刺激響應(yīng)的種類，其可被分為物理刺激響應(yīng)材料、化學(xué)刺激響應(yīng)材料、生物刺激響應(yīng)材料和組合刺激響應(yīng)材料[33]。物理刺激包括溫度、水分含量、光照、磁場(chǎng)、電刺激等，通過(guò)改變物體內(nèi)部的原子排列結(jié)構(gòu)而使其發(fā)生形狀變形；化學(xué)刺激是通過(guò)pH值或離子濃度的改變刺激4D打印產(chǎn)物發(fā)生形狀變化；生物刺激依賴于參與人體生物信號(hào)反饋通路的小分子或大分子物質(zhì)進(jìn)行[34-35]。隨著生物組織工程學(xué)的進(jìn)步，刺激響應(yīng)材料也被發(fā)現(xiàn)可用于血管結(jié)構(gòu)的4D打印。

Arakawa等[36]利用光照降解光敏材料實(shí)現(xiàn)了精細(xì)內(nèi)皮化血管及載細(xì)胞的復(fù)雜多層血管結(jié)構(gòu)的4D制造；Lai等[37]利用一種溫度響應(yīng)水凝膠聚合物在人體溫度下實(shí)現(xiàn)了立體血管狀結(jié)構(gòu)的自折疊組裝，較完整地保存了細(xì)胞活性；Song等[38]開(kāi)發(fā)了一種在生物刺激響應(yīng)水凝膠內(nèi)打印復(fù)雜微通道的技術(shù)。首先，內(nèi)皮細(xì)胞附著于3D打印的復(fù)雜微通道上，相融合形成單層血管壁，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞暴露于血管生長(zhǎng)因子時(shí)，產(chǎn)生蛋白酶降解水凝膠并在水凝膠中出芽形成血管分叉及新的血管通路。

4D生物打印技術(shù)既可以幫助復(fù)雜精細(xì)血管系統(tǒng)的體內(nèi)外建造，并且能控制打印結(jié)構(gòu)中藥物及生長(zhǎng)因子的釋放，促進(jìn)血管化結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)[37，39-40]。但是部分刺激信號(hào)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響[40-41]，在現(xiàn)有研究中，僅證實(shí)了溫度(4～40 ℃)[41]和鈣離子濃度[42]改變既可以引起形狀變換又不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面影響。

1.4 其他

除了上述的打印方法，還有一些方法也具有構(gòu)建高仿真的血管結(jié)構(gòu)潛力，但在實(shí)際應(yīng)用方面具有較大局限。

在傳統(tǒng)3D打印方法的基礎(chǔ)上，Yang等[43]將擠出技術(shù)和噴墨技術(shù)相結(jié)合，雙噴嘴打印可灌注血管通道。這種方法首先利用氣動(dòng)擠出噴嘴逐層打印光固化水凝膠以構(gòu)建具有內(nèi)部通道凹槽的自支撐結(jié)構(gòu)，再利用壓電式噴嘴在內(nèi)部通道凹槽中噴射式打印犧牲水凝膠以填滿、支撐內(nèi)部通道。在內(nèi)部結(jié)構(gòu)打印完成后，繼續(xù)擠出光固化水凝膠以覆蓋內(nèi)部犧牲材料達(dá)到預(yù)設(shè)的厚度。在打印及光固化完成后，填充內(nèi)部通道的犧牲材料被去除，留下具有可灌注血管通道的水凝膠塊。這一方法在厚組織再生中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，但是在打印分辨率和結(jié)構(gòu)保真度上仍存在提升空間。

除了利用化學(xué)材料作為血管結(jié)構(gòu)的支撐，一些物理場(chǎng)如磁場(chǎng)、聲場(chǎng)也能實(shí)現(xiàn)懸浮打印的效果。這種方法首先將細(xì)胞制備成組織球體，再在物理場(chǎng)中實(shí)現(xiàn)組織球體的懸浮組裝，在確保生物安全性的同時(shí)具有構(gòu)建高精度復(fù)雜結(jié)構(gòu)如血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的潛力[44]。Parfenov等[45]結(jié)合磁、聲場(chǎng)構(gòu)建的空心管狀結(jié)構(gòu)具有良好的生物活性。這種方式省略了去除臨時(shí)化學(xué)支撐物的步驟，但是裝配組織球體的過(guò)程較復(fù)雜，且成本較高。

2 3D打印血管在口腔頜面的應(yīng)用前景

口腔頜面部的軟硬組織重建離不開(kāi)血管化，血管化游離組織瓣廣泛應(yīng)用于口腔頜面部大面積組織缺損的修復(fù)。3D打印血管的技術(shù)同樣可以用于口腔頜面部軟硬組織血管化工程[46]。

懸浮打印方法可以通過(guò)設(shè)計(jì)懸浮介質(zhì)支持浴及生物墨水的組合同時(shí)構(gòu)建心臟、骨組織等結(jié)構(gòu)及內(nèi)部為血管生長(zhǎng)預(yù)留的通道[47-48]，這提示懸浮打印具有體外構(gòu)建預(yù)血管化軟硬組織植入物的潛能，在頜面部軟硬組織重建中具有研究?jī)r(jià)值。

同軸打印同樣能參與預(yù)血管化組織植入物的構(gòu)建。Twohig等[49]通過(guò)在生物陶瓷骨支架中同軸打印負(fù)載人體間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells， hMSCs)和ECs的GelMA微通道，在體外培養(yǎng)三天內(nèi)骨支架內(nèi)部形成了豐富且穩(wěn)定的內(nèi)皮化通道；Li等[50]將HUVECs負(fù)載在同軸打印定制的微血管結(jié)構(gòu)內(nèi)部，再通過(guò)注射方式均勻分散到負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞的軟硬組織模型中。結(jié)果顯示引入微血管結(jié)構(gòu)的軟組織植入物內(nèi)部表現(xiàn)出血管生成行為并出現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)；在骨組織模型中，微血管結(jié)構(gòu)的植入能顯著促進(jìn)成骨分化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有微血管結(jié)構(gòu)的水凝膠能迅速與宿主血管吻合形成新的供血通道。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了通過(guò)3D打印制造的可注射微血管結(jié)構(gòu)為預(yù)血管化植入物的制造提供了一種靈活而便捷的方法，微血管結(jié)構(gòu)的引入在頜面皮膚、口腔黏膜、肌肉等軟組織及頜骨、牙槽骨等硬組織的修復(fù)重建中具有潛在的臨床應(yīng)用前景 。

除此之外，4D打印的概念也逐漸被引入血管化組織制造中。Benmeridja等[51]通過(guò)打印封裝脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASC)與HUVECs (ASC/HUVECs) 共培養(yǎng)球體的GelMA構(gòu)建了自組裝的血管化脂肪組織，其中ASC能夠在成脂分化的同時(shí)引導(dǎo)血管網(wǎng)絡(luò)的形成，推進(jìn)了血管化脂肪組織再生的研究，有潛力應(yīng)用于頜面部凹陷性軟組織缺損的體內(nèi)修復(fù)中。

3D打印的血管化組織植入物能通過(guò)與鄰近的宿主血管融合而在早期為移植部位建立血供，提高植入物的存活率，是再生醫(yī)學(xué)及組織工程學(xué)修復(fù)的發(fā)展方向，3D打印血管化植入物有望成為修復(fù)口腔頜面部骨、皮膚、肌肉等軟硬組織的新選擇。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，3D生物打印血管的技術(shù)日益精進(jìn)，在傳統(tǒng)方式上改良的打印技術(shù)更好地模擬了血管的形態(tài)與功能，有潛力用于制造血管結(jié)構(gòu)。組織工程的血管再生研究在骨、牙髓、皮膚、黏膜等組織再生方面具有決定性作用[52-53]，3D打印血管技術(shù)的研究進(jìn)展推動(dòng)了預(yù)血管化組織植入物的制造，在口腔頜面部組織再生修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊的研究前景及潛在的應(yīng)用價(jià)值。但一些方法尚未投入臨床試驗(yàn)，且存在制造成本較高、打印步驟較復(fù)雜等缺點(diǎn)，仍需要不斷創(chuàng)新和進(jìn)步。