急性期骨科鈦合金板表面金黃色葡萄球菌細菌生物膜的結構演變

陳明禮，陳宗霖，楊榮源，薛觀錡，黃淼，鈕朋

(1.福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院骨科，福建 漳州 363000；2.福建醫(yī)科大學，福建 福州 350000；3.南陽市第二人民醫(yī)院骨科，河南 南陽 473000)

金黃色葡萄球菌廣泛分布于人體體表，其與許多骨科內植物感染相關[1]。國外文獻報道每年骨科關節(jié)置換術中膝關節(jié)假體周圍感染發(fā)生率為0.5%～2.0%，翻修感染率為2.0%～4.0%[2-3]，髖關節(jié)假體周圍感染發(fā)生率為0.3%～1.0%[4]，而多處假體置換的感染率更高[5]，多以金黃色葡萄球菌感染為主[6-7]，這也是關節(jié)翻修主要的原因之一[8]。骨科術后內植物相關感染是骨科醫(yī)師十分棘手的事，主要原因在于植入物表面細菌生物膜的形成，生物膜由細菌及其自身產(chǎn)生的細胞外多糖基質組成[9]，是一種復雜的微生物群落，處于低代謝狀態(tài)，適應外界環(huán)境能力強，使存活其中的細菌免受宿主免疫攻擊和抗生素制劑的影響，較浮游菌相比表現(xiàn)出更強的耐藥性，使感染難以控制，而這樣的環(huán)境會促使耐藥菌株出現(xiàn)[10-11]。臨床表明生物膜難以去除常需要聯(lián)合抗生素并多次手術病灶清除，甚至取出內固定裝置等綜合治療[12-13]，對患者造成極大痛苦，使治療難度增大，醫(yī)療成本升高[14]。臨床對急性期生物膜的研究較少，因此研究內植物表面金黃色葡萄球菌生物膜形態(tài)結構演化意義重大，對臨床內植物相關感染治療有一定指導意義。

臨床上4周之內的骨科內植物相關感染稱為急性感染，主要是以保留假體為主的清創(chuàng)聯(lián)合抗感染的綜合治療[12]，但手術時機和方式主要取決術者臨床經(jīng)驗。迄今為止，對于骨科內植物相關感染治療還沒有統(tǒng)一的治療標準，這使得外科醫(yī)生很難準確把握手術時機和達到確切的治療效果。因此，筆者制作急性期內不同時相點的金黃色葡萄球菌生物膜體外模型，觀察生物膜形態(tài)演變，使臨床醫(yī)生對假體細菌生物膜的理解更加深入，更好的做出臨床決策。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器 材料：金黃色葡萄球菌標準菌株(ACTT25923，人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院微生物室提供)；骨科內植物鈦合金板(Ti6Al4V，直徑12.7 mm，厚度4.7 mm，深圳斯瑪儀器有限公司)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)和異硫氰酸熒光素標記的刀豆蛋白A(FITC-ConA)熒光染色劑(美國Sigma公司)，胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB；廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；美國Corning公司)，戊二醛固定液(南京森貝伽生物科技有限公司)，乙醇溶液(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司)。

儀器：激光共聚焦顯微鏡(FV l000，日本OLYMPUS公司)，Quanta 450掃描電子顯微鏡(美國FEI公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，普通瓊脂培養(yǎng)皿(青島日水生物科技有限公司)，24孔組織培養(yǎng)板(青島日水生物科技有限公司)，共聚焦顯微鏡專業(yè)皿(美國Sigma公司)，K850臨界點干燥儀(美國FEI公司)，超聲清洗機(深圳潔盟清洗設備有限公司)，旋渦震蕩儀(美國Scientific Industries公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 制作細菌生物膜體外模型 參照Unnanuntana造模方法[15]，取少量斜面保種金黃色葡萄球菌標準菌株接種于10 mL TSB中，置恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中過夜復蘇，再取微量菌液4區(qū)劃線法接種于血平板培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得菌落。取單個菌落溶解于玻璃瓶中，使比濁儀顯示濁度為0.5，取1 mL菌液溶解于149 mL無菌PBS培養(yǎng)基中，使菌液達到最終濃度1×106CFU/mL備用。將鈦合金板清洗、干燥、滅菌預處理后放入24孔板中，每孔加入1 mL濃度為1×106CFU/mL菌懸液，置37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔24 h用無菌TSB液體換液1次，分別培養(yǎng)1、2、3、4周形成相應時間的細菌生物膜。

1.2.2 實驗分組 實驗共需120枚鈦合金板，建立4個培養(yǎng)不同時期的生物膜，每個時相點各30枚。將各時相點培養(yǎng)好的生物膜中隨機挑選10枚用于掃描電鏡觀察，10枚用于激光共聚焦顯微鏡觀察，10枚用于活菌計數(shù)。

1.3 觀察指標

1.3.1 激光共聚焦顯微鏡觀察細菌生物膜結構 分別在鈦合金板表面建立1、2、3、4周的生物膜體外模型，將各時相點培養(yǎng)好的生物膜中隨機各選取10枚鈦合金板，經(jīng)FITC-ConA避光染色30 min后PI避光染色15 min，染色后用PBS清洗，待干燥后置于觀察皿中，激光共聚焦顯微鏡下觀察(FITC-ConA與生物膜中的胞外多聚物結合激光共聚焦顯微鏡觀察呈綠色熒光，PI與菌體內的DNA結合激光共聚焦顯微鏡觀察呈紅色熒光，兩者重疊呈橙色熒光)熒光數(shù)量、亮度、分布方式來分析生物膜及膜中活菌、死菌形成變化；沿三維坐標系，Z軸逐層水平掃描，Z軸距離為生物膜厚度(μm)。

1.3.2 掃描電鏡觀察細菌生物膜結構 將各時相點培養(yǎng)好的生物膜中各隨機取10枚鈦合金板，25 g/L戊二醛固定2 h，分別經(jīng)濃度為30%、50%、70%、80%、90%和100%乙醇脫水。完成后置于K850臨界點干燥儀處理，后置于Q 150R S/E/ES樣品制備系統(tǒng)噴金，在掃描顯微鏡下逐個觀察不同時相點細菌生物膜多聚物的數(shù)量、形態(tài)、空間分布及微環(huán)境結構，并選取典型結構的視野拍照記錄。

1.3.3 活菌計數(shù) 將各時相點培養(yǎng)好的生物膜中各隨機取10枚，PBS沖洗后放于10 mL PBS的培養(yǎng)瓶中，置于超聲清洗機及旋渦震蕩儀作用后，洗脫液進行稀釋，取100 μL滴加于普通營養(yǎng)瓊脂平板中央，三角推棒均勻涂布，置于37℃、50 g/L CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后行活菌計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。采用單因素方差分析，各組間比較采用LSD檢驗，檢驗水平設為0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各時相點生物膜的共聚焦掃描圖像 1周時綠色熒光少、較弱、稀疏的局限于紅色熒光周圍，紅色熒光較多明顯，表明早期胞外多聚物量少，散在分布于菌體周邊(見圖1a)；2周時綠色熒光明顯增多，亮度增強，紅色熒光也增多，局部熒光相連，表明生物膜胞外多糖聚合物增多，細菌存留生物膜的數(shù)量也增多，生物膜互相連接(見圖1b)；3周時綠色熒光增加，變密，紅色熒光較暗淡，表明生物膜進一步增加，局部聚集，不均勻分布(見圖1c)；4周時綠色熒光大量分布連成片狀，表面高低起伏，表明大量生物膜形成，結構緊密，表面不均一狀(見圖1d)。

a 1周時生物膜共聚焦掃描結構圖

b 2周時生物膜共聚焦掃描結構圖

c 3周時生物膜共聚焦掃描結構圖

d 4周時生物膜共聚焦掃描結構圖

a 1周時的細菌生物膜 b 2周時的細菌生物膜 c 3周時的細菌生物膜 d 4周時的細菌生物膜

2.2 各時相點細菌生物膜的掃描電鏡圖像 1周時生物膜胞外多糖聚合物較少，局限菌體之間，細菌之間少量孔道形成；2周時細菌胞外多聚物增多，微孔道增多；3周時胞外多聚物進一步增多，細菌多聚物融合成團塊狀；4周時形成大量胞外多聚物，生物膜具有一定厚度，呈蜂巢狀，膜內孔道分明，相互交通，局部生物膜解聚游離(見圖2)。

2.3 各時相點細菌生物膜的厚度及生物膜中的活菌計數(shù) 培養(yǎng)1、2、3、4周的金黃色葡萄球菌細菌生物膜厚度逐漸增厚，各組之間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。培養(yǎng)1、2、3、4周的金黃色葡萄球菌細菌生物膜內的活菌總體趨于穩(wěn)定，各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 不同時相點各組的細菌生物膜厚度及活菌數(shù)統(tǒng)計結果

3 討 論

金黃色葡萄球菌是人體表面常駐菌群，也是骨科假體周圍感染最主要的細菌[11]。骨科內植物材料大多是鈦合金，因此實驗選用金黃色葡萄球菌來培養(yǎng)細菌生物膜，以鈦合金板作為載體。假體周圍感染是骨科災難性并發(fā)癥，主要原因是假體表面細菌生物膜的形成，臨床對于1個月內的假體周圍感染，一般定為急性感染，治療以保留假體的病灶清除[13]為主。而急性期不同時間段的細菌生物膜演變對于手術時機選擇以及術后感染再發(fā)率預判有指導作用。因此實驗時間間隔為1周。

實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)1周后生物膜整體以細菌為主，細菌胞外多糖聚合物少，呈點狀，內部空間結構簡單；2周時細菌胞外多糖聚合物增多，菌群直接通過細絲狀多聚物相連接，菌體清晰可見，這和很多文獻報道的幾小時形成細菌生物膜有很多區(qū)別[16-17]，考慮是由于不同種類細菌的生物膜的形成能力不同。同種細菌在不同的環(huán)境下生物膜的形成能力也有區(qū)別，野生菌種和實驗室的菌種在生物膜形成能力上也存在差異。實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1周時細菌外膜上的凸起(圖2a黃色箭頭)就是生物膜的組成成分，共聚焦顯微鏡觀察到凸起是生物膜形成早期最主要的特征，且掃描電鏡也觀察到培養(yǎng)1周時細菌外膜的凸起就是胞外多糖聚合物，2周時形成更多胞外多糖聚合物(圖2b黃色箭頭)，此時細菌及胞外多糖聚合物共同組成生物膜，胞外多糖聚合物合成少，由此可以推測保留假體治療成功率較高。實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3周時生物膜厚度增加，胞外多糖聚合物進一步增多，呈層狀空間結構，包裹大多數(shù)菌體，此時觀察到局部細菌解聚現(xiàn)象(圖2c紅色箭頭)，這與Takahashi等報道相一致[18]，表明此時治療難度增大，感染治療成功率較低。到了4周形成大量胞外多糖聚合物，包裹菌體，此時生物膜層次分明，內部孔道繁多(圖2d藍色箭頭)，此時的感染則難以控制。相關文獻表明不同時期的生物膜，胞外多糖聚合物對內部細菌保護作用不同，文獻報道對于培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌細菌生物膜0.5%碘伏能殺滅浮游狀態(tài)的細菌，而對于培養(yǎng)更長時間的金黃色葡萄球菌生物膜碘伏殺菌作用減弱[19-20]，表明了不同時期胞外多糖聚合物形成的屏障保護作用不同。臨床上有研究報道，急性期保留假體治療成功率高低不等，低的為44%[21]，而高的為71%[22]，推測導致這一波動的原因主要是不同時期生物膜成熟程度的區(qū)別。研究發(fā)現(xiàn)低劑量抗生素的作用會導致生物膜內耐藥菌體的形成[23]，是由于生物膜底層環(huán)境惡劣，生物膜內的細菌營養(yǎng)供應不足，細菌代謝廢物的堆積，使得內部細菌處于低代謝狀態(tài)，這些與細菌形成耐藥性密切相關[24-25]。內部孔道結構使低代謝的細菌得以存活并且相互之間可以信息交流[26]，使內部細菌伺機而動。當環(huán)境發(fā)生變化，生物膜開始解聚，處于休眠狀態(tài)的細菌復蘇并重新游離出來，使臨床患者癥狀反復發(fā)作[27]。生物膜結構類似“人類社區(qū)分布”，生物膜外觀類似房屋高低不同，呈現(xiàn)不均一性，各區(qū)域厚度不統(tǒng)一，生物膜內的細菌好比是房屋內的居民，一定范圍內的生物膜中細菌總數(shù)趨于穩(wěn)定[28]。另外細菌生物膜有早期生物膜和晚期生物膜，早期生物膜中細菌比例高，晚期生物膜胞外多糖聚合物比例高，結構化程度高，功能完善，抗外界干擾越強，消滅困難。

臨床上保留假體的清創(chuàng)治療的手術時機尚無統(tǒng)一定論，但一般是盡早給予施行手術。文獻報道，對于4周內的假體相關感染，可以給予保留假體的清創(chuàng)治療，但成功率大小不一[29]。Grammatopoulos等[30]回顧18年的保留假體清創(chuàng)病例，發(fā)現(xiàn)4周內和4周后保留假體清創(chuàng)差異無統(tǒng)計學意義，說明4周內和4周后的細菌生物膜變化不大。本實驗研究發(fā)現(xiàn)對于金黃色葡萄球菌生物膜有早期生物膜和晚期生物膜區(qū)別，而且3周是臨界值。

綜上所述，金黃色葡萄球菌生物膜是一個逐漸成熟的過程，到3周時形成較穩(wěn)定生物膜，主要表現(xiàn)是形成大量的細菌胞外多糖聚合物包裹細菌并形成空間結構化，內部環(huán)境有序化的過程，這也是早期生物膜和晚期生物膜的區(qū)別。根據(jù)本研究結果推薦內置物感染越早清創(chuàng)越好，對于3周以內的金黃色葡萄球菌感染保留假體清創(chuàng)成功率較高。

本實驗不足之處：本實驗為體外研究實驗，與體內環(huán)境相差較大，文章只選取臨床假體相關感染最為常見的金黃色葡萄球菌種作為研究對象，缺少其他細菌及混合菌感染相關研究，也缺少在動物實驗及臨床上對于保留假體清創(chuàng)的詳細比較研究。相關內容還有待于后續(xù)研究進一步驗證。