水稻不育系湘陵628S不同組合感光性差異的遺傳解析

陳賽華 彭 盛 尤儀雯 張路遙 王 凱 薛 明,* 楊遠(yuǎn)柱,* 萬建民

水稻不育系湘陵628S不同組合感光性差異的遺傳解析

陳賽華1彭 盛1尤儀雯1張路遙1王 凱3薛 明1,*楊遠(yuǎn)柱3,*萬建民2

1江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225009;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué) / 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 江蘇省植物基因工程技術(shù)研究中心, 江蘇南京 210095;3袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方水稻品種創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 抗病蟲水稻育種湖南省工程實(shí)驗(yàn)室, 湖南長沙 410128

湘陵628S是優(yōu)質(zhì)矮稈抗倒兩系早稻不育系, 所配組合米質(zhì)優(yōu), 且適宜輕簡化、規(guī)?；蜋C(jī)械化種植, 目前已有40個“陵兩優(yōu)”系列品種通過國家或省級審定, 并大面積推廣應(yīng)用。測配中發(fā)現(xiàn), 湘陵628S與絕大多數(shù)中晚稻親本配組感光性強(qiáng), 在長江流域不能正常抽穗, 限制了其育種應(yīng)用。為了探究湘陵628S及不同雜交組合感光性差異的遺傳機(jī)制, 本研究結(jié)合等位性測驗(yàn)與基因型分析, 對湘陵628S及恢復(fù)系的關(guān)鍵感光基因進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 湘陵628S攜帶有隱性等位基因e和Se-1, 顯性等位基因Hd5E、E和EF-1, 總體表現(xiàn)出弱感光性?；謴?fù)系攜帶的E()基因決定了不同組合的感光性強(qiáng)弱, 所攜帶的()和()基因與感光性沒有直接相關(guān)性。據(jù)此, 我們開發(fā)了2個分子標(biāo)記用于恢復(fù)系E、等位基因型的分子鑒定, 以加快弱/不感光雜交組合的選育。本研究為湘陵628S及其他不育系在雜交育種上的利用提供了重要的理論和技術(shù)指導(dǎo)。

水稻; 不育系; 感光性; 基因; 分子標(biāo)記

發(fā)展雜交水稻對于促進(jìn)糧食增產(chǎn), 保障糧食安全具有舉足輕重的作用。由于雜種優(yōu)勢效應(yīng)的存在, 雜交水稻品種有時會表現(xiàn)出超親晚熟的現(xiàn)象。適當(dāng)延長熟期(或稱抽穗期)可以在不影響輪作的前提下有效促進(jìn)雜交種的產(chǎn)量。然而, 過度的超親晚熟現(xiàn)象則會降低品種的廣適性, 這成為雜交品種選育中的障礙之一[1]。株1S是國內(nèi)應(yīng)用最廣的早秈不育系, 針對株1S植株偏高易倒伏的問題, 采用體細(xì)胞無性系誘變方法對株1S株高進(jìn)行了改良, 育成了優(yōu)質(zhì)矮稈抗倒兩用核不育系湘陵628S, 該不育系最大限度保留了株1S優(yōu)良特性和高配合力, 且株高僅62 cm, 莖基部節(jié)間短, 所配組合植株矮壯, 耐肥抗倒, 很好的解決了雜交早稻生產(chǎn)問題[2]。但是, 不同于親本株1S, 湘陵628S與絕大多數(shù)中晚稻父本配組都呈現(xiàn)出強(qiáng)感光性, 在長江流域不能正常抽穗, 這限制了湘陵628S的育種應(yīng)用。

水稻抽穗期(heading date, HD)由基本營養(yǎng)生長性、感光性和感溫性3個因素共同決定, 其中感光性是反映水稻品種地區(qū)和季節(jié)適應(yīng)性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。早期研究表明, 水稻的感光性受到復(fù)雜的遺傳調(diào)控, 包括主效感光基因E、和微效感光基因、和等[3-4]。這些感光基因位點(diǎn)的功能基因大多已經(jīng)被克隆并進(jìn)行了深入的研究, 其中包括E位點(diǎn)的基因[5]、位點(diǎn)的基因[6]、位點(diǎn)的[7-8]、位點(diǎn)的[9-10]和位點(diǎn)的[11]等。與其他感光基因不同,表現(xiàn)出短日照下促進(jìn)、長日照下延遲抽穗的現(xiàn)象[6]。的這種雙重功能可能與它和、/或形成互作復(fù)合物有關(guān)[12-16]。自然界中存在感光基因的不同單倍型, 這些單倍型的組合引起豐富的感光性變化, 從而使得水稻品種在不同光周期環(huán)境下呈現(xiàn)出抽穗期的變化。、和的不同組合與水稻品種在不同光周期條件下的抽穗期與產(chǎn)量顯著相關(guān), 因此被認(rèn)為是關(guān)鍵的感光基因[12,17-19]。然而, 湘陵628S不同雜交組合的感光性差異是否與這些感光基因或基因組合有關(guān)仍不清楚。

本研究以湘陵628S及其不同感光性的“陵兩優(yōu)”組合為研究對象, 首先通過等位性測驗(yàn)對湘陵628S的感光基因基因型進(jìn)行測定。并對湘陵628S和不同強(qiáng)、弱感光雜交組合中的父本進(jìn)行和的基因型測定, 分析感光性強(qiáng)弱與不同基因型或基因型組合之間的相互關(guān)系。本研究不僅可以為湘陵628S在育種上的利用提供指導(dǎo), 也為如何破除其他雜交稻品種選育過程中出現(xiàn)的超親晚熟現(xiàn)象提供育種改良策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

、E、E、E、和是水稻中已報道的關(guān)鍵的抽穗期調(diào)控基因位點(diǎn), 其中影響基本營養(yǎng)生長性, 其余均可通過影響感光性來調(diào)控抽穗。為了評估湘陵628S中各等位基因的作用強(qiáng)弱, 本研究選用11個測驗(yàn)系材料, 它們可以相互組配成7對含有單一等位基因差異的測驗(yàn)系組合, 對6個基因座位上的等位基因(其中與等位)進(jìn)行等位基因效應(yīng)測定(表1)。本研究測定的F1材料均以湘陵628S (簡稱S)為母本, 測驗(yàn)系材料為父本雜交獲得。本研究待測定的不同雜交組合親本材料包括兩系不育系湘陵628S、株1S; 陵兩優(yōu)強(qiáng)感光組合的恢復(fù)系親本蜀恢527、恩恢58、輻恢838、R182、先恢207和R1377, 陵兩優(yōu)弱感光組合的恢復(fù)系親本HY032、H421、H211、ZR02、華恢1063和華恢564。

1.2 田間試驗(yàn)

供試材料包括湘陵628S、7對測驗(yàn)系材料及組配的F1。夏季播種于江蘇省南京市長日照條件下, 播種日期為5月12日, 移栽日期為6月12日。每個材料種植2行, 株距為13.3 cm, 行距26.3 cm, 每行10株。水肥管理按照水稻常規(guī)栽培條件實(shí)施。

1.3 抽穗期調(diào)查

為了精確調(diào)查材料的表型, 分單株調(diào)查抽穗期。以每株植株的主穗抽出劍葉1～2 cm作為當(dāng)天抽穗的標(biāo)準(zhǔn), 記錄下抽穗日期。計算抽穗日期距離播種日期的天數(shù)(d), 記為抽穗期。每個材料分單株調(diào)查2行。抽穗期的調(diào)查數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示, 其中每組樣品不少于10個重復(fù)。

表1 試驗(yàn)采用的7對測驗(yàn)系材料的基因型

*: 大寫字母代表顯性等位基因型, 小寫字母代表隱性等位基因型, 上標(biāo)表示強(qiáng)弱不同的等位基因型。Nip為日本晴Nipponbare的縮寫。

*: uppercase letters represent dominant alleles, lowercase letters represent recessive alleles, and superscripts represent alleles with different intensity. Nip is the abbreviation of Nipponbare.

1.4 數(shù)據(jù)分析

等位測驗(yàn)法是根據(jù)前人研究的基礎(chǔ)稍作修改[20]。分別調(diào)查了7對測驗(yàn)系的抽穗期差異, 比較湘陵628S與各測驗(yàn)系雜交后F1的抽穗期差異。基因的效應(yīng)分析是通過比較雜交前后的抽穗期差異來確定的。如湘陵628S中帶有顯性等位基因, 則在雜交后可以完全或部分掩蓋原成對測驗(yàn)系中的基因效應(yīng)差異, 表現(xiàn)為不同雜交組合F1之間抽穗期差異縮短, 反之則雜交F1之間與測驗(yàn)系之間的抽穗期差異保持一致。本研究中涉及的材料之間的兩兩比較, 均采用T測驗(yàn)檢測差異顯著性,<0.05為顯著,<0.01為極顯著。

1.5 基因克隆與測序

將不同雜交組合中的恢復(fù)系材料種植在光照培養(yǎng)箱中(30℃ 16 h光照/25℃ 8 h黑夜), 培養(yǎng)到感光期(～30 d), 采用CTAB法提取DNA。同步采用TRIzol試劑盒提取RNA, 隨即利用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以DNA為模板, 采用Ghd7-exon1和Ghd7-exon2引物對擴(kuò)增的基因組外顯子序列。以cDNA為模板, 采用Hd1- FLcDNA引物擴(kuò)增基因的全長cDNA序列。以cDNA為模板, 采用DTH8-FLcDNA引物擴(kuò)增基因的全長cDNA序列。引物序列見表2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送南京擎科生物有限公司進(jìn)行測序, 測序結(jié)果采用Contig軟件進(jìn)行拼接與比對分析。E1D與SeI引物是用于檢測與等位基因型的分子標(biāo)記(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘陵628S所配組合呈現(xiàn)感光性的分化

湘陵628S與不同類型父本配組, 所配組合呈現(xiàn)出明顯的感光性分化(表3), 與中晚稻父本所配組合在長江中下游長日照條件下不能正常抽穗。我們推測, 在不同“陵兩優(yōu)”組合中, 湘陵628S與不同恢復(fù)系之間的感光性遺傳差異可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的根本原因。

表2 本研究采用的引物序列

表3 部分“陵兩優(yōu)”早稻組合(已審定)和強(qiáng)感光組合

2.2 湘陵628S呈現(xiàn)出較弱的感光性

為了探究不同“陵兩優(yōu)”組合的感光性差異, 我們首先對湘陵628S自身的光周期敏感性進(jìn)行了分析。在海南陵水自然短日照條件下(natural short day, NSD), 2016—2019年湘陵628S的平均抽穗期為(81.2±2.64) d (圖1-A)。在江蘇南京自然長日照條件下(natural long day, NLD), 2016—2019年湘陵628S的平均抽穗期為(81.75±2.20) d; 相比于NSD條件下, NLD下湘陵628S的抽穗期未出現(xiàn)延遲的現(xiàn)象, 甚至個別年份稍有提前, 這說明湘陵628S本身具有較弱的光周期敏感性。

圖1 湘陵628S的感光性表現(xiàn)及等位性測驗(yàn)結(jié)果

A: 湘陵628S在自然長、短日照下的抽穗期; B～H: 不同測驗(yàn)系及其與湘陵628S雜交F1的抽穗期。橫坐標(biāo)代表不同測驗(yàn)系材料及其與湘陵628S雜交的F1, 其中測驗(yàn)系名稱同表1, 縱坐標(biāo)代表抽穗期。S表示湘陵628S, S/測驗(yàn)系表示湘陵628S與測驗(yàn)系的F1材料。**表示成對測驗(yàn)系之間或成對F1之間存在極顯著差異,< 0.01。

A: heading date (HD) of Xiangling 628S under natural long-day and short-day conditions. B–H: heading date of different test lines and their hybrids with Xiangling 628S. The abscissa represents different test lines (the same as test lines in Table 1) and their hybrids with Xiangling 628S, the vertical coordinate represents the days of heading date. S means Xiangling 628S, S/test line means F1derived from Xiangling 628S crossed with each test line. ** indicates significant differences between each pair of test lines or each pair of F1lines at< 0.01.

2.3 湘陵628S的感光性遺傳解析

為了進(jìn)一步分析湘陵628S弱感光性的形成機(jī)制, 我們利用含有E、E、E、和不同等位基因的測驗(yàn)系對湘陵628S進(jìn)行感光性遺傳解析(表4和圖1-B～H)。

2.3.1 湘陵628S攜帶隱性E和等位基因 感光性為復(fù)雜的數(shù)量性狀, 由眾多感光基因參與調(diào)節(jié)。到目前為止,E和是公認(rèn)的主效感光基因, 是影響水稻感光性的主要決定因子。在E基因位點(diǎn)主要存在3類復(fù)等位基因, 即顯性基因E、弱顯性E和隱性非感光基因e。測驗(yàn)系EG1 (EESe-1Se- 1Ef-1Ef-1)和EG0 (eeSe-1Se-1Ef-1Ef-1)僅存在E等位基因間的差異, 前者較后者延遲抽穗約20 d, 這說明顯性E在長日照下能顯著延遲抽穗。當(dāng)湘陵628S與EG1、EG0分別雜交后, F1代抽穗期仍存在極顯著差異, 相差近33 d (圖1-B), 這說明湘陵628S攜帶有隱性的等位基因e?；蛭稽c(diǎn)主要存在3類復(fù)等位基因, 即顯性感光基因Se-1和Se-1和隱性非感光基因Se-1, 感光性Se-1>Se-1>Se-1。測驗(yàn)系LR (EESe-1Se-1Ef-1Ef-1)和ER (EESe-1Se- 1Ef-1Ef-1)僅存在等位基因間的差異, 攜帶Se-1的LR抽穗期較攜帶Se-1的ER延遲22 d (圖1-C)。組合LR/S較ER/S延遲約13 d, 說明湘陵628S含有隱性的等位基因, 基因型可能為Se-1或Se-1。已知與等位, 我們采用的近等基因系Nipponbare (EESe-1Se-1Ef-1Ef-1)與NIL () (EESe-1Se- 1Ef-1Ef-1)進(jìn)一步證實(shí)湘陵628S中等位基因的效應(yīng)。Nipponbare (Nip)和NIL ()抽穗期相差約7 d,當(dāng)湘陵628S與Nip和NIL ()分別雜交后, F1抽穗期仍相差9 d (圖1-D), 這說明湘陵628S含有隱性等位基因。綜合這2組測驗(yàn)系, 可以判斷湘陵628S含有隱性等位基因Se-1, 感光性弱。

表4 測驗(yàn)系及其與湘陵628S的雜交F1抽穗期和基因型測定結(jié)果

*本研究測定的湘陵628S基因型采用粗體突出表示。測驗(yàn)系材料同表1。

*:the genotypes of Xiangling 628S tested in this study are highlighted in bold. The test lines are the same as those given in Table 1.

2.3.2 湘陵628S攜帶顯性E、E和等位基因 測驗(yàn)系EG2 (eeEEeeSe-1Se-1Ef-1Ef-1)和EG3 (eeeeEESe-1Se-1Ef-1Ef-1)相比于EG0 (eeSe-1Se-1Ef-1Ef-1)分別攜帶顯性的E和E等位基因, 它們在長日照下可分別延遲開花5 d和14 d左右。組合S/EG2、S/EG3與S/EG0的抽穗期均無顯著差異, 并且雜交F1的抽穗期均與湘陵628S相當(dāng),這說明湘陵628S攜帶有E,E顯性等位基因(圖1-F～G)?；蛑饕嬖?種基因型,Hd5、和5, 其中Hd5與均為顯性感光等位基因, 前者感光性更甚, 而為隱性等位基因, 感光性弱。Nipponbare攜帶顯性等位基因, 而NIL ()則攜帶強(qiáng)等位基因Hd5。當(dāng)分別與湘陵628S雜交后, F1代無差異, 說明湘陵628S攜帶強(qiáng)顯性等位基因Hd5(圖1-H)

2.3.3 湘陵628S攜帶有弱顯性等位基因Ef-1Ef-1顯性早熟基因因子在長日照、短日照下均可提早抽穗, 是通過影響基本營養(yǎng)生長性而影響抽穗期的主要基因。已知在基因主要存在3種復(fù)等位基因, 即顯性基因Ef-1和隱性基因, 早熟效應(yīng)為Ef-1>Ef-1>ef-1。測驗(yàn)系T65Ebm (eeSe- 1Se-1Ef-1Ef-1)攜帶有顯性等位基因, T65m(eeSe-1Se-1ef-1ef-1)攜帶有隱性等位基因, 前者較后者抽穗期提前約21 d。組合S/T65Ebm相比于S/T65m仍顯著提前, 但差距縮減至7 d左右(圖1-E), 由于S/T65Ebm (HD～81.2 d)相比于T65Ebm (HD～ 75.75 d)出現(xiàn)了抽穗的延遲, 推測湘陵628S攜帶有弱顯性等位基因Ef-1,Ef-1Ef-1效應(yīng)弱于, 因此表現(xiàn)出抽穗的延遲。當(dāng)湘陵628S與含有隱性基因的T65m (eeSe-1Se-1ef-1ef-1)雜交后, S/T65m (HD～88 d,Ef-1ef-1)較湘陵628S (HD～81 d,Ef-1Ef-1)延遲抽穗約7 d左右, 這說明Ef-1可能存在一定的劑量效應(yīng)。由此推斷, 雜交配組時恢復(fù)系若含有隱性基因, 則可能會引起雜交種的基本營養(yǎng)生長性減弱, 表現(xiàn)為抽穗期稍有延遲, 但不影響感光性。

2.4 湘陵628S不同組合感光性強(qiáng)弱分化與感光基因的相關(guān)分析

由于628S攜帶有隱性的主效感光基因e與Se-1, 測配父本如果包含有顯性的E或等位基因, 則有可能引起雜交組合的抽穗期延遲, 表現(xiàn)出強(qiáng)的光周期敏感性, 反之則不然。為了證實(shí)我們的猜想, 我們對湘陵628S及其不同“陵兩優(yōu)”組合中恢復(fù)系的和基因(分別對應(yīng)于E和)進(jìn)行了測序, 并分析不同基因型與雜交組合感光性強(qiáng)弱的相關(guān)性。

2.4.1 湘陵628S不同組合感光性強(qiáng)弱與E等位基因緊密相關(guān) 對湘陵628S的不育供體株1S、湘陵628S和不同“陵兩優(yōu)”組合的恢復(fù)系進(jìn)行基因的擴(kuò)增時發(fā)現(xiàn), 包括株1S和湘陵628S在內(nèi)的部分材料無法有效擴(kuò)增出基因, 推測這些材料中可能存在基因的缺失。為了進(jìn)一步對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證, 在基因區(qū)設(shè)計了6對引物M1～M6。以起始密碼子ATG為基因起始, 終止密碼子TAA為基因終止, M1位于基因上游約5.7 kb, M5、M6分別位于基因下游約1.0 kb和8.3 kb, M2～M4覆蓋整個基因區(qū)域(圖2-A)。經(jīng)擴(kuò)增檢測后發(fā)現(xiàn), 在株1S、湘陵628S、HY032、H421、H211、ZR02和華恢1063中均無法有效擴(kuò)增出M2～M5的相應(yīng)片段, 說明這些材料中基因缺失(圖2-C)。以上結(jié)果與我們的重測序結(jié)果相一致, 凡是不能有效擴(kuò)增基因的材料, 在基因區(qū)域均無測序結(jié)果覆蓋。對蜀恢527等含有基因的6個恢復(fù)系進(jìn)行基因組測序后發(fā)現(xiàn), 這些材料中僅存在2種單倍型(Haplotype, 以下簡稱Hap)。除R1377含有Hap2以外, 其他材料中含有一致的Hap1 (圖2-B)。相比于日本晴而言, Hap1有4處氨基酸的替換, Hap2有5處氨基酸的替換, 兩者均沒有產(chǎn)生移碼突變。已知日本晴中攜帶顯性的E()等位基因, 因此, 我們推測以上6個恢復(fù)系中均含有完整功能的基因。比較不同“陵兩優(yōu)”組合的感光性發(fā)現(xiàn), 所有強(qiáng)感光的組合的恢復(fù)系都含有完整基因, 而所有弱/不感光的組合中恢復(fù)系都缺失基因, 這說明不同“陵兩優(yōu)”組合的感光性差異與基因密切關(guān)聯(lián), 恢復(fù)系中顯性的會顯著增強(qiáng)雜交組合的感光性, 最終表現(xiàn)出雜交組合在長日照下抽穗期的顯著延遲。

圖2 不同“陵兩優(yōu)”組合親本Ghd7的測定

A:基因的結(jié)構(gòu)示意圖。白色框?yàn)榉欠g區(qū), 灰色框?yàn)橥怙@子區(qū)(外顯子1為1～444 bp、外顯子2為2090～2419 bp), 橫線為基因上、下游區(qū)和內(nèi)含子區(qū)。M1～M6代表用于擴(kuò)增片段的標(biāo)記位置。B:基因不同單倍型, 參考基因組為日本晴, 其中突出堿基為差異堿基, 最下方標(biāo)注差異堿基引起的氨基酸變化?；謴?fù)系材料同表3, 其中蜀恢527、恩恢58、輻恢838、R182和先恢207均為Hap1; R1377為Hap2。C: M1～M6標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。

A: the structural diagram ofgene. The white box represents the untranslated region, the gray box represents the exon region (exon 1 is from 1 to 444 bp and exon 2 is from 2090 to 2419 bp), and the lines represent the upstream, downstream or intron regions. M1–M6 represents the positions of markers. B: the different haplotypes ofgene. The reference sequence is Nipponbare. Each base varied among these materials was highlighted. Their locations corresponding to the reference genome and the resulting amino acid changes were indicated at the bottom. Restorer lines are the same as in Table 3. Shuhui 527, Enhui 58, Fuhui 838, R182, and Xianhui 207 belonged to Hap1, and R1377 belonged to Hap2. C: the electrophoresis detection results of M1–M6 products.

2.4.2 湘陵628S不同組合感光性強(qiáng)弱與和不直接相關(guān) 對湘陵628S的不育供體株1S、湘陵628S和不同雜交組合中的恢復(fù)系材料也進(jìn)行了基因的擴(kuò)增。結(jié)果表明, 相比于參考基因組日本晴的序列, 湘陵628S存在36 bp的片段插入與一個G-A的單堿基差異, 造成12個氨基酸的增加與一個氨基酸的替換(圖3-A)。根據(jù)等位性測驗(yàn)結(jié)果可知, 湘陵628S中含有隱性等位基因Se-1(圖1-C, D; 表4), 感光性低甚至感光功能喪失。湘陵628S的()基因型與不育供體株1S中完全一致, 說明湘陵628S保留了株1S的弱感光性()等位基因。在所有檢測的恢復(fù)系中一共存在4種單倍型。其中Hap1與湘陵628S一致, Hap2在湘陵628S的基礎(chǔ)上增加了C-G的變異; Hap3在Hap2的基礎(chǔ)上增加了4 bp的缺失; Hap4同樣包含36 bp的插入與一個G-A的單堿基差異, 還包括多處錯義突變、插入突變與移碼突變。無論何種單倍型, 由于都存在與湘陵628S相同的突變, 推測這些雜交組合父本均攜帶不感光的等位基因。表2中弱/不感光組合恢復(fù)系中存在Hap1、Hap2、Hap3, 強(qiáng)感光組合的恢復(fù)系中存在Hap2、Hap3、Hap4, 不同單倍型在強(qiáng)弱組合中隨機(jī)分布, 據(jù)此推測, 不同“陵兩優(yōu)”感光性的差異與恢復(fù)系的基因型無直接相關(guān)?？紤]到、與三個基因形成的復(fù)合物對于感光性起到?jīng)Q定性作用, 我們同步也測定了基因的單倍型(圖3-B)。相比于日本晴的, 湘陵628S的存在一處3 bp的插入、一處9 bp的缺失和7個氨基酸的替換, 沒有發(fā)生移碼, 這與測定的湘陵628S含有強(qiáng)Hd5等位基因的結(jié)論相吻合。有意思的是, 作為湘陵628S的不育供體, 株1S含有與湘陵628S顯著差異的等位基因。株1S攜帶有Hap2單倍型, 該單倍型相比于湘陵628S存在1 bp的缺失, 會造成移碼突變。相比于湘陵628S, 株1S配組時無明顯感光性特性, 對父本選擇的限制低。據(jù)此我們推測, 湘陵628S選育的過程中,的功能獲得型導(dǎo)入(來源于系譜親本ZR02)可能是其配組F1感光性增強(qiáng)的原因之一。

圖3 不同“陵兩優(yōu)”組合親本Hd1和DTH8的測定

A:基因的結(jié)構(gòu)與單倍型分析; B:基因的結(jié)構(gòu)與單倍型分析; 白色框?yàn)榉欠g區(qū), 灰色框?yàn)橥怙@子區(qū)(的外顯子1為1～828 bp、外顯子2為829～1188 bp;含1個1～894 bp的外顯子), 折線為內(nèi)含子區(qū)。數(shù)字代表對應(yīng)于日本晴cDNA的位置。AA為相比于日本晴產(chǎn)生的氨基酸變化。Frame shift表示引起移碼突變。藍(lán)色和橙色分別標(biāo)注不同單倍型與日本晴相同和不同之處。當(dāng)基因型被分成不同單倍型時, 強(qiáng)感光組合中的父本采用粗體進(jìn)行突出表示。

A: the structure and haplotype analysis ofgene; B: the structure and haplotype analysis ofgene. The white boxes represent the untranslated regions, the gray boxes represent the exon regions (has two exons, exon 1 is 1–828 bp, exon 2 is 829–1188 bp;has an 894 bp exon), and the broken line indicates the intron region. The numbers mean the positions corresponding to the Nipponbare cDNA. AA shows the changes in amino acids. Frame Shift means a frameshift caused by the insertions or deletions. The same or different sequences of HAP1-4 compared to Nipponbare are highlighted in blue or in orange. The parents within the strong photosensitive hybrids are highlighted in bold when the genotypes are classified into different haplotypes.

2.5 用于快速選育弱/不感光“陵兩優(yōu)”組合的分子標(biāo)記開發(fā)

為了精準(zhǔn)高效選配非感光或弱感光“陵兩優(yōu)”系列早秈或晚秈品種, 我們基于E()和()基因序列開發(fā)了2個功能分子標(biāo)記, 用于鑒定篩選含有這2個隱性等位基因的恢復(fù)系。其中標(biāo)記E1D用于檢測, 凡是不能夠有效擴(kuò)增2573 bp左右大小DNA片段的材料均為缺失型, 反之則為存在完整的類型(圖4-A)。E1D標(biāo)記可以快速篩選缺失型的水稻恢復(fù)系, 而對于包含完整基因區(qū)域的材料, 可以通過擴(kuò)增產(chǎn)物的測序來進(jìn)一步確定的基因型。標(biāo)記SeI用于檢測的36 bp插入, 凡是恢復(fù)系中含有該插入片段的, 其擴(kuò)增產(chǎn)物長度相比于對照日本晴多36 bp, 為不感光型等位基因(圖4-B)。以上標(biāo)記可以用于選擇弱感光性恢復(fù)系, 高效培育生育期適宜的“陵兩優(yōu)”組合。

圖4 功能分子標(biāo)記的開發(fā)與鑒定

A: E1D標(biāo)記用于鑒定E()基因的缺失, M表示DNA ladder; B: SeI標(biāo)記用于鑒定()基因存在的36 bp插入。圖中Zhu 1S為Xiangling 628S的不育供體株, 恢復(fù)系材料同表3。

A: E1D marker can be used to identify the deletion atE() locus, M: DNA ladder; B: SeI marker can be used to identify the 36 bp insertion at the() locus. Zhu 1S is the sterile donor of Xiangling 628S and the restorer lines are the same as those given in Table 3.

3 討論

3.1 恢復(fù)系的E1 (Ghd7)是決定不同“陵兩優(yōu)”組合感光性強(qiáng)弱的關(guān)鍵基因

湘陵628S與不同測驗(yàn)系配組, S/EG1 (HD, 116)表現(xiàn)出明顯的超親晚熟現(xiàn)象, 而S/EG0 (HD, 84)則抽穗期與湘陵628S相當(dāng), 這說明雜交父本中若含有顯性的E等位基因, 則會顯著提高雜交組合的感光性, 表現(xiàn)出抽穗期的延遲。這一推論在其他雜交組合中也同樣可以觀察到。測驗(yàn)系ER和LR、NIL (hd1)與Nip、Nip與NIL (Hd5)均攜帶有顯性的E等位基因, 在湘陵628S與這些測驗(yàn)系雜交時, 雜交F1的抽穗期從97 d (S/ER)到112 d (S/NIL (Hd5))不等, 均相比于湘陵628S感光性增強(qiáng), 抽穗延遲。測序分析表明, 凡父本恢復(fù)系中攜帶有顯性E()等位基因, 則雜交組合的感光性強(qiáng), 而父本中攜帶隱性e()等位基因的雜交組合為弱感光性, 這進(jìn)一步證實(shí), 父本的E()基因是決定不同雜交組合感光性強(qiáng)弱的關(guān)鍵。

3.2 恢復(fù)系的Se-1 (Hd1)是影響不同組合感光性強(qiáng)弱的潛在基因

等位性測驗(yàn)結(jié)果顯示,湘陵628S攜帶有弱感光等位基因Se-1, 一旦父本中含有強(qiáng)感光性的等位基因, 則雜交F1的感光性會顯著增強(qiáng)。然而, 在湘陵628S與含有Se-1的EG0、EG2和EG3雜交后, S/EG0 (HD～84 d)、S/EG2 (HD～82)和S/EG3 (HD～83)均沒有顯著的延遲抽穗, 推測可能與這些測驗(yàn)系中均含有隱性等位基因e有關(guān), 這與前人報道的()的感光性依賴于E相一致[14]。在對不同雜交組合恢復(fù)系的()等位基因測序后發(fā)現(xiàn), 所有恢復(fù)系都包含與湘陵628S相同的序列特征(36 bp的插入與G-A的單堿基變異), 并且不同的單倍型在強(qiáng)、弱感光組合中隨機(jī)分布, 這說明父本中不同的單倍型都可能是弱感光型, 不同“陵兩優(yōu)”組合的感光性差異與基因不直接相關(guān)。即便如此, 當(dāng)雜種F1的E被有功能的等位基因互補(bǔ)后, 感光性強(qiáng)的等位基因仍可能延遲雜交F1的抽穗期, 因此, 恢復(fù)系()是影響不同組合感光性強(qiáng)弱的潛在基因, 應(yīng)避免與含有Se-1強(qiáng)等位基因型的恢復(fù)系雜交。

已有研究表明湘陵628S攜帶有功能的等位基因[21]。本研究利用等位性測驗(yàn)證實(shí)湘陵628S攜帶弱感光的Se-1等位基因, 盡管湘陵628S中的相比于日本晴的沒有發(fā)生移碼突變, 但我們?nèi)酝茢嗥鋽y帶的單倍型, 包括36 bp插入與G-A單堿基變異, 是屬于弱感光性型, 其內(nèi)在的機(jī)制仍值得進(jìn)一步深入研究。

3.3 不育系的Hd5 (DTH8)可作為湘陵628S改良的候選基因,而恢復(fù)系的Ef-1、E2、E3在決定不同組合感光性強(qiáng)弱中不起主要作用

等位性測驗(yàn)結(jié)果表明, 湘陵628S攜帶強(qiáng)感光等位基因, 理論上無論與何種等位基因配對, 均對感光性變化不起作用。然而, 由于()基因被報道在形成感光復(fù)合物//中不可或缺, 因此它對于E()基因發(fā)揮功能至關(guān)重要。經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn), 在3個測定的感光基因中, 株1S僅基因與湘陵628S存在差異。株1S攜帶隱性的基因, 由于1 bp的缺失, 其編碼的DTH8蛋白會發(fā)生移碼, 蛋白功能喪失。已知在感光性方面, 不育供體株1S相比于湘陵628S對父本的選擇限制低, 兩者之間的差異可能與基因的功能有關(guān)。因此,可以作為湘陵628S改良的候選基因。通過CRISPR等現(xiàn)代技術(shù)手段可以定點(diǎn)突變湘陵628S中的基因, 從而改善感光性在雜交配組中的影響。

測驗(yàn)系EG2 (HD, 76 d)和EG3 (HD, 86 d)比EG0 (HD, 71 d)分別延遲抽穗5 d和15 d, 說明E和E的感光性較E弱。當(dāng)湘陵628S與EG2, EG3雜交時, S/EG2、S/EG3的抽穗期分別82 d和83 d, 與湘陵628S (HD, 81 d)相當(dāng)。由此推測, 湘陵628S本身攜帶有顯性的E、E等位基因, 當(dāng)它與其他材料雜交時, 父本中的顯性的E、E不會增強(qiáng)雜交組合的感光性。

顯性可以顯著促進(jìn)抽穗。當(dāng)湘陵628S與攜帶隱性的T65m (eeSe-1Se-1ef-1ef-1)雜交后, S/T65m (HD～89 d)比湘陵628S (HD～81 d)延遲抽穗8 d, 這說明父本中攜帶的隱性會引起基本營養(yǎng)生長性的改變, 導(dǎo)致抽穗延遲, 但是總體對雜種F1的影響較小。

抽穗期由遺傳因素與外界共同協(xié)調(diào)起作用, 含有Se-1Se-1或ee的材料由于較弱的感光性, 生育期短, 因此在人工馴化中被保留下來作為早稻, 而相比之下, 晚稻中該2個基因之一極有可能為顯性, 因此, 湘陵628S與一些晚稻組配群體時出現(xiàn)晚熟的現(xiàn)象主要是受E與基因的影響。在組合選育中, 如何高效選擇具有適宜感光特性的恢復(fù)系進(jìn)行雜交是亟待解決的問題。我們針對E和基因開發(fā)了2個功能性分子標(biāo)記, 其中E1D可用于篩選含有()基因缺失的材料, SeI用于篩選含有隱性()等位基因的材料(圖4-B)。通過這2個分子標(biāo)記快速鑒定恢復(fù)系, 能夠?qū)ο媪?28S雜交組合的感光性強(qiáng)弱進(jìn)行預(yù)評估。如果存在性狀優(yōu)良但含有顯性或的恢復(fù)系材料, 我們也可以通過對進(jìn)行基因編輯敲除或回交選育來改良湘陵628S, 從而拓寬其父本的選擇范圍。

4 結(jié)論

湘陵628S攜帶有隱性的E和等位基因和顯性的Hd5E、E和EF-1等位基因, 其E()基因存在缺失,()為弱感光性單倍型,()基因?yàn)閺?qiáng)感光性單倍型。不同“陵兩優(yōu)”組合的感光性強(qiáng)弱與其恢復(fù)系中的E()基因密切相關(guān), 而與()、()基因無直接相關(guān)。所有強(qiáng)感光組合的恢復(fù)系材料均含有完整的基因, 而所有弱感光的組合的恢復(fù)系材料均缺失基因。湘陵628S與其不育供體株1S的E()和()基因型一致, 但()基因存在顯著差異, 其中湘陵628S攜帶強(qiáng)感光等位基因, 而株1S攜帶有功能缺失的等位基因。

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Genetic analysis of photosensitivity divergence among hybrids derived from rice sterile line Xiangling 628S

CHEN Sai-Hua1, PENG Sheng1, YOU Yi-Wen1, ZHANG Lu-Yao1, WANG Kai3, XUE Ming1,*, YANG Yuan-Zhu3,*, and WAN Jian-Min2

1Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education / Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology, Agricultural College of Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;2State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Jiangsu Plant Gene Engineering Research Center / Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China;3Key Laboratory of Southern Rice Innovation & Improvement, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hunan Engineering Laboratory of Disease and Pest Resistant Rice Breeding / Yuan Longping High-Tech Agriculture Co., Ltd., Changsha 410128, Hunan, China

Xiangling 628S is a high quality thermosensitive male sterile line of two-line hybrid rice, whose hybrids have high-quality rice and is suit for light-cultivation, large-scale, and mechanized planting, and 40 new hybrid rice varieties have been approved and widely used. However, its hybrids had strong photosensitivity when it crossed with a large majority of mid-late cultivars, and headed late or even not heading under long-day (LD) conditions, which limited its application in the Yangtze River area. To explore the genetic mechanism of photosensitivity divergence among different hybrids, several key photosensitive loci in Xiangling 628S and its restorer lines were analyzed by allelism tests combined with sequence analysis. The results showed that Xiangling 628S had recessiveee,Se-1Se-1and dominantHd5Hd5,EE,EE, andEF-1EF-1, showing weak photosensitivity. The photosensitivity divergence in different hybrids was closely correlated withE() locus in restorer lines, but not with() and(). Finally, we developed two functional molecular markers for genetic identification ofEandloci in restorer lines, which would speed up the selection of weak/non-sensitive hybrids of Xiangling 628S. Our study provides important theoretical guidance and technical supports for the utilization of Xiangling 628S in breeding, as well as hybrid breeding with other sterile lines.

rice; sterile line; photosensitive; genes; molecular marker

10.3724/SP.J.1006.2023.22015

本研究由江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目(基于qTT12的水稻耐高溫種質(zhì)資源創(chuàng)制) (CX(21)3100)和湖南省科技創(chuàng)新計劃項(xiàng)目(2021NK1001)資助。

This study was supported by the Jiangsu Agricultural Science and Technology Innovation Fund “Development of Rice Germplasms with Heat-tolerance Based on qTT12 (CX(21)3100)” and Science and Technology Innovation Program of Hunan Province (2021NK1001).

薛明, E-mail: 007747@yzu.edu.cn; 楊遠(yuǎn)柱, E-mail: yangyuanzhu@lpht.com.cn

E-mail: chensaihua@yzu.edu.cn

2022-03-12;

2022-05-05;

2022-05-13.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220512.1510.006.html

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