丁香酚對解淀粉芽孢桿菌氣液界面生物膜的抑制作用

楊 露，覃書漫，李志洪，楊 倩，張志清，陳安均，黎杉珊，侯曉艷，申光輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 四川 雅安 625014)

生物膜是細(xì)菌附著于生物或非生物表面，被自身分泌的胞外多糖、蛋白質(zhì)、胞外DNA等胞外基質(zhì)大分子包裹形成的有組織的細(xì)菌群體[1]。由于受到生物膜基質(zhì)的保護(hù)，膜內(nèi)菌體對外部環(huán)境中抑菌和殺菌物質(zhì)的耐受能力比游離菌體高幾十至上千倍[2]。根據(jù)形成界面特性差異，生物膜分為固液界面形成的潛底型生物膜和氣液界面形成的表皮型生物膜[3]。芽孢桿菌屬細(xì)菌廣泛存在于各類環(huán)境中，極易在合適條件下形成表皮型生物膜，比潛底型生物膜的成膜速度更快，成膜量更高，對食品生產(chǎn)的危害更大。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是芽孢桿菌屬常見細(xì)菌種類，盡管國內(nèi)外鮮見解淀粉芽孢桿菌對人體致病性及其直接危害的報道，但相關(guān)菌株的污染可導(dǎo)致食品的腐敗變質(zhì)[4]，形成生物胺等有害代謝產(chǎn)物[5]，間接危害人體健康；因此，對解淀粉芽孢桿菌表皮型生物膜的控制具有重要研究意義。

食品工業(yè)中應(yīng)用于生物膜控制的傳統(tǒng)方法包括物理、化學(xué)方法等，但易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等問題。天然抗生物膜活性物質(zhì)較傳統(tǒng)方法具有綠色、安全的優(yōu)勢，受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注[6]。丁香酚是丁香精油等植物精油中的苯丙烷類小分子化合物[7]，具有良好的抑菌及抗生物膜活性[8]。Far等[9]研究表明，丁香酚對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為3.125%～0.010%。Ashrafudoulla等[10]研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%～0.6%的丁香酚可顯著降低副溶血弧菌生物膜形成量。然而，有關(guān)丁香酚抑制腐敗解淀粉芽孢桿菌生物膜形成及其作用機(jī)理的研究較少。

細(xì)菌生物膜的形成受菌株特性、黏附界面特性及環(huán)境因素影響[11]。其中，細(xì)菌運(yùn)動能力[12]和表面理化特性[13]對細(xì)菌早期成膜階段在界面的黏附過程具有重要影響。本研究主要考察丁香酚對腐敗解淀粉芽孢桿菌生物膜形成的抑制及成熟生物膜的清除效果，并重點從細(xì)菌運(yùn)動能力、細(xì)胞表面特性變化對腐敗菌成膜早期界面黏附過程影響的角度，探討丁香酚抗解淀粉芽孢桿菌生物膜形成的作用機(jī)理，以期為控制腐敗芽孢桿菌生物膜形成提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌DY1a，分離自腐敗豆桿制品，保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院。丁香酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)，合肥巴斯夫生物科技有限公司；2, 3, 5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Satorius CP225D型電子天平，德國賽多利斯公司；SW- CJ- 2FD型超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP- 160型智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；Sorvall ST16R型冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash型熒光酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司；Milli- Q型超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；Nano ZS90型納米粒度電位儀，英國馬爾文帕納科公司；Eclipse E100型普通光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司；KH- 300DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；759S型紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；ZEISS Sigma 500型場發(fā)射掃描電鏡，德國卡爾蔡司公司。

1.3 實驗方法

1.3.1培養(yǎng)基配制

LB培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0、瓊脂15.0，pH值7.4～7.6。

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 34.0、大豆木瓜蛋白酶消化物 6.0、NaCl 10.0、KH2PO45.0、葡萄糖 5.0，pH值7.1～7.5。

胰蛋白胨大豆肉湯豆?jié){(TSBS)培養(yǎng)基A液：豆?jié){粉50.0 g/L，自然pH值，溶解于1/2最終體積的培養(yǎng)基中。TSBS培養(yǎng)基B液(g/L)：胰蛋白胨 17.0、大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0、NaCl 5.0、KH2PO42.5、葡萄糖 2.5，溶解于1/2最終體積的培養(yǎng)基中。滅菌后將A液與B液混合，自然pH值。

PCA培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 5.0、酵母浸粉 2.5、葡萄糖 1.0、瓊脂 15.0，自然pH值。

泳動瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10.0、NaCl 5.0、 葡萄糖 5.0、瓊脂3.0，自然pH值。

叢集瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10.0、NaCl 5.0、 葡萄糖 5.0、瓊脂5.0，自然pH值。

1.3.2最低生物膜抑制質(zhì)量濃度測定

1) 細(xì)菌菌懸液制備。參考汪倫記等[14]的方法，從斜面上挑取菌體接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。菌懸液4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用無菌PBS緩沖液(pH值7.4)洗滌3次后，用無菌PBS緩沖液(pH值7.4)調(diào)整菌體OD600 nm至0.10 (5×108CFU/mL)。

2) 最低生物膜抑制質(zhì)量濃度(MBIC)測定。取0.5 mL丁香酚與3 mL吐溫20混合振蕩乳化，按二倍稀釋法使用滅菌TSBS液體培養(yǎng)基稀釋丁香酚至不同質(zhì)量濃度。向50 mL的無菌燒杯中依次加入5 mL菌懸液、5 mL滅菌TSBS液體培養(yǎng)基、10 mL不同丁香酚質(zhì)量濃度(3.00、1.50、0.75 mg/mL)的丁香酚- 吐溫20- TSBS乳化液，獲得丁香酚質(zhì)量濃度分別為1.500、0.750、0.375 mg/mL的腐敗菌培養(yǎng)液(腐敗菌菌體最終濃度約為106CFU/mL)，以等體積分?jǐn)?shù)吐溫20(1.8%)為對照。燒杯使用無菌封口膜密封，置于37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察生物膜形成情況并拍照。不同處理均重復(fù)3次。使用接種環(huán)輕挑培養(yǎng)基氣液界面，目視觀察是否有穩(wěn)定生物膜形成，并結(jié)合生物膜干重法綜合判斷，將無生物膜形成的丁香酚質(zhì)量濃度確定為MBIC。將氣液表面形成的生物膜小心挑取轉(zhuǎn)移至干燥至恒重的定性濾紙表面，55 ℃干燥至恒重，稱量生物膜干質(zhì)量。

1.3.3生物膜微觀形貌觀察

將滅菌載玻片(1.97 cm×2.56 cm)斜放入裝有20 mL含不同質(zhì)量濃度丁香酚的TSBS培養(yǎng)基的燒杯中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。緩慢取出載玻片，并用無菌PBS緩沖液(pH值7.4)洗滌附著在載玻片上的生物膜，以去除游離菌體細(xì)胞，在超凈臺自然晾干后，噴金處理，使用掃描電鏡觀察生物膜表面微觀形貌的變化。

1.3.4生物膜內(nèi)活菌數(shù)測定

參照J(rèn)ha等[15]的方法測定生物膜內(nèi)活菌數(shù)。將分布載玻片特定面積(1.97 cm×2.56 cm)上的生物膜用無菌PBS緩沖液(pH值7.4)輕輕沖洗去除非黏附性的菌體，將生物膜黏附于滅菌棉簽頭上，轉(zhuǎn)移至3 mL無菌水試管中，300 W超聲處理30 min，渦旋振蕩20 s，依次進(jìn)行梯度稀釋，吸取20 μL不同稀釋梯度的稀釋液到PCA平板表面并涂布均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3.5生物膜清除能力測定

參考Mohsenipour等[16]的TTC法測定不同質(zhì)量濃度的丁香酚對形成48 h的生物膜的清除率。向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入1.5 mL TSBS培養(yǎng)基，并接入0.5 mL細(xì)胞濃度106CFU/mL的菌懸液，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。用無菌PBS緩沖液(pH值7.4)輕洗生物膜2次，再向各孔加入1.5 mL 無菌PBS緩沖液(pH值7.4)稀釋后的丁香酚溶液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，棄去丁香酚稀釋液，加入1.5 mL 1.0 mg/mL TTC溶液，置于37 ℃避光反應(yīng)3 h，測定各孔在490 nm的吸光度，按式(1)計算生物膜清除率。

(1)

式(1)中，A1、A2分別為對照組和處理組吸光度。

1.3.6細(xì)菌運(yùn)動性測定

分別配制丁香酚質(zhì)量濃度為1.500、0.750、0.375 mg/mL的泳動瓊脂培養(yǎng)基和叢集瓊脂培養(yǎng)基，及106CFU/mL的菌懸液(制備方式同1.3.2)。待泳動瓊脂培養(yǎng)基凝固后，風(fēng)干培養(yǎng)基表面的水分。泳動能力測定：將5 μL過夜培養(yǎng)稀釋后的菌液滴在平板中心，待瓊脂吸干后，移至37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。叢集能力測定：制備好瓊脂培養(yǎng)基后，用無菌牙簽蘸取純化后的芽孢單菌落，刺入?yún)布傊囵B(yǎng)基(未刺到底)，移至37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組，每個質(zhì)量濃度至少設(shè)置3組平行，培養(yǎng)完成后，記錄細(xì)菌生長情況，測量細(xì)菌泳動和叢集圈直徑大小，細(xì)菌泳動和叢集能力的抑制率計算見式(2)。

(2)

式(2)中，S1為對照組泳動或叢集圈面積，cm2；S2為處理組泳動或叢集圈面積，cm2。

1.3.7細(xì)菌表面特性測定

1) 細(xì)胞表面疏水性測定。采用改良的微生物黏附碳?xì)浠衔锓y定腐敗菌細(xì)胞表面疏水性[17]。取3 mLOD600 nm為0.50的菌懸液，加入9 mL用無菌PBS緩沖液(pH值7.4)稀釋的不同質(zhì)量濃度的丁香酚- 吐溫20乳液，混勻后37 ℃下孵育4 h，再加入300 μL正十六烷與二甲苯混合有機(jī)溶劑(體積比1∶1)，渦旋混合2 min，室溫下靜置15 min使兩相分離，取下層水相，采用血球板計數(shù)法測定細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量，以未添加丁香酚的菌懸液為對照。細(xì)菌表面疏水率按式(3)計算。

(3)

式(3)中，C0為添加有機(jī)溶劑前菌懸液細(xì)胞濃度，個/mL；C1為加有機(jī)溶劑處理后下層水相細(xì)胞濃度，個/mL。

2) 細(xì)胞表面Zeta電位測定。參考寧亞維等[18]的方法，測定腐敗菌細(xì)胞表面Zeta電位值。取5 mLOD600 nm為0.20的菌懸液與5 mL不同質(zhì)量濃度的丁香酚- 吐溫20乳液混合于50 mL離心管中，在37 ℃、160 r/min振蕩孵育2 h，超聲分散10 min，測定Zeta電位。

3)細(xì)菌自聚集性測定。參考Wang等[19]的方法分析細(xì)菌自聚集性。向15 mL試管內(nèi)加入3 mLOD600 nm為0.25的菌懸液、9 mL用無菌PBS緩沖液(pH值7.4)稀釋的不同質(zhì)量濃度丁香酚- 吐溫20乳液，渦旋10 s后從液面以下2 cm處吸取200 μL菌液于96孔無菌聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用酶標(biāo)儀測定600 nm的吸光度，然后將試管37 ℃水浴孵育6 h，測吸光度，按式(4)計算細(xì)菌自聚集率。

細(xì)菌自聚集率=(A1-A2)/A1×100%。

(4)

式(4)中，A1、A2分別為孵育前后的吸光度。

1.3.8生物膜基質(zhì)及胞外溶液中多糖與蛋白質(zhì)含量測定

多糖和蛋白質(zhì)測定分別采用苯酚- 硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法。生物膜基質(zhì)中多糖與蛋白質(zhì)含量測定：按照1.3.1培養(yǎng)生物膜，將氣液界面形成的生物膜轉(zhuǎn)移到10 mL離心管，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2% EDTA溶液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% NaCl)，37 ℃震蕩提取12 h，待生物膜完全溶解，4 ℃、4 000 r/min離心30 min，取上清液測定多糖和蛋白質(zhì)含量。膜下胞外溶液中多糖與蛋白質(zhì)含量測定：將表面(氣液界面)的生物膜輕輕挑開，用移液槍吸取生物膜下的菌懸液2 mL，10 000 r/min離心10 min，取上清液后，采用相同方法分別測定胞外溶液多糖和蛋白質(zhì)含量。多糖和蛋白質(zhì)含量計算分別見式(5)、式(6)。

(5)

式(5)中，ρ1為多糖含量，mg/cm2或mg/mL；m1為樣品測定液多糖質(zhì)量，mg；V1為樣品定容體積，mL；V2為樣品測定液體積，mL；S為燒杯中生物膜總面積(cm2)或燒杯中胞外溶液總體積(mL)；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

(6)

式(6)中，ρ2為蛋白質(zhì)含量，μg/cm2或mg/mL；A1為測定液的吸光度；A2為空白組的吸光度；A3為標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度；ρ為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度，g/L；B為稀釋倍數(shù)；S為燒杯中生物膜總面積(cm2)或燒杯中胞外溶液總體積(mL)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較檢驗(P<0.05)，Origin Pro 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌生物膜形成能力的影響

豆?jié){、吐溫20及不同質(zhì)量濃度丁香酚對解淀粉芽孢桿菌氣液界面形成的生物膜的影響見圖1、圖2。由圖1可知，與TSB培養(yǎng)基相比，添加豆?jié){的TSBS培養(yǎng)基表面形成的生物膜厚度明顯增加，燒杯側(cè)壁黏附菌體數(shù)量增多，表明添加豆?jié){可促進(jìn)解淀粉芽孢桿菌在TSB培養(yǎng)基中形成生物膜。與TSBS培養(yǎng)基相比，TSBS- 吐溫20培養(yǎng)基表面形成的生物膜無明顯變化，表明添加體積分?jǐn)?shù)1.8%吐溫20對解淀粉芽孢桿菌生物膜的形成幾乎無影響，吐溫20可用作丁香酚的乳化劑。添加丁香酚的TSBS培養(yǎng)基表面生物膜形成量明顯減少，其中添加1.500 mg/mL丁香酚的TSBS培養(yǎng)基表面無生物膜形成，因此丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜的MBIC為1.500 mg/mL。

圖1 培養(yǎng)基添加不同成分對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜的影響Fig.1 Effects of different components added to culture medium on biofilm of B. amyloliquefaciens DY1a

由圖2可知，隨著丁香酚質(zhì)量濃度逐漸提高，解淀粉芽孢桿菌DY1a的生物膜形成量逐漸減小，當(dāng)添加的丁香酚質(zhì)量濃度達(dá)到MBIC時，無生物膜形成，表明丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜的形成有明顯的抑制效果，且抑制強(qiáng)度呈較強(qiáng)的質(zhì)量濃度依賴性。

2.2 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌生物膜微觀形態(tài)的影響

不同字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖2 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜的影響Fig.2 Effect of eugenol on biofilm of B. amyloliquefaciens DY1a

丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜微觀形態(tài)的影響見圖3。由圖3可知，在培養(yǎng)48 h后，丁香酚對細(xì)菌氣液交界面生物膜的形成量和表面特征產(chǎn)生了顯著影響。未添加丁香酚的培養(yǎng)體系氣液交界面形成了較厚的生物膜聚合物，整體呈現(xiàn)褶皺狀態(tài)，1/2 MBIC、1/4 MBIC丁香酚處理組玻片表面較為光滑平整，生物膜變薄。MBIC組僅含有少量游離菌體。隨著丁香酚質(zhì)量濃度提高，生物膜形成量均較對照組明顯減少。

圖3 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜微觀形態(tài)的影響Fig.3 Effect of eugenol on biofilm microstructureof B. amyloliquefaciens DY1a

2.3 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)的影響

丁香酚可以通過殺死解淀粉芽孢桿菌抑制生物膜的形成，通過平板計數(shù)法可以量化生物膜內(nèi)活細(xì)菌的數(shù)量。丁香酚對解淀粉芽孢桿菌生物膜內(nèi)活菌數(shù)的影響見圖4。由圖4可以看出，在解淀粉芽孢桿菌生物膜形成過程中，不同質(zhì)量濃度的丁香酚對生物膜內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05)。隨著丁香酚質(zhì)量濃度的提高，膜內(nèi)的活菌數(shù)逐漸減少。在丁香酚質(zhì)量濃度為1/2 MBIC時，解淀粉芽孢桿菌生物膜內(nèi)的活菌數(shù)為7.81 lg CFU/cm2；1/4 MBIC時，生物膜內(nèi)的活菌數(shù)為8.51 lg CFU/cm2；而未添加丁香酚的對照組(8.73 lg CFU/cm2)，其生物膜內(nèi)活菌數(shù)顯著高于丁香酚添加組(P<0.05)。由于丁香酚質(zhì)量濃度為MBIC時，完全抑制了氣液界面生物膜的形成，故其生物膜內(nèi)活菌數(shù)未測定。

2.4 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌生物膜清除能力的影響

不同字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖4 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜內(nèi)活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of eugenol on living bacteria embedded in biofilm of B. amyloliquefaciens DY1a

TTC法可對生物膜形成情況進(jìn)行間接定量檢測，TTC可以被活細(xì)胞線粒體中與輔酶Ⅱ相關(guān)的脫氫酶還原成橘黃色的水溶性甲瓚，而生物膜內(nèi)活細(xì)胞釋放的甲瓚可通過比色法評估。丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a生物膜的清除能力見圖5。由圖 5可知，不同質(zhì)量濃度的丁香酚對培養(yǎng)48 h的成熟生物膜表現(xiàn)出了不同的清除率。當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度為MBIC時，生物膜清除率為28.85%，隨著丁香酚質(zhì)量濃度從1/4 MBIC增加到MBIC時，解淀粉芽孢桿菌生物膜的清除率顯著提高了18.32%(P<0.05)。

不同字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖5 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a成熟生物膜的清除效果Fig.5 Eradicating effect of eugenol on mature biofilm of B. amyloliquefaciens DY1a

2.5 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌細(xì)菌運(yùn)動性的影響

泳動運(yùn)動(swimming motility)和叢集運(yùn)動(swarming motility)都是依賴鞭毛使細(xì)菌能夠找到并促進(jìn)其在理想位點黏附的運(yùn)動方式。泳動和叢集運(yùn)動使細(xì)菌能夠趨利避害，適應(yīng)生存環(huán)境的快速變化，在細(xì)菌生存和定殖中起著關(guān)鍵作用[20]。泳動運(yùn)動一般表現(xiàn)為細(xì)菌個體在液體環(huán)境中由鞭毛推動的易位行為，而叢集運(yùn)動是細(xì)菌群體在黏性環(huán)境中由鞭毛推動的群集交流運(yùn)動。丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a泳動和叢集運(yùn)動的影響見表1、圖6。由 表1 及圖6可知，丁香酚對腐敗菌泳動和叢集能力具有顯著性抑制作用。隨著丁香酚質(zhì)量濃度增加，泳動培養(yǎng)基平板表面形成的泳動圈直徑和面積逐漸減小，添加MBIC的丁香酚可完全抑制腐敗菌DY1a的泳動運(yùn)動。與泳動運(yùn)動結(jié)果類似，隨著培養(yǎng)基丁香酚質(zhì)量濃度的增加，腐敗菌從集圈直徑和面積逐漸減少，其中添加MBIC的丁香酚對腐敗菌叢集運(yùn)動的抑制率可達(dá)97.50%。

圖6 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a泳動和叢集運(yùn)動的影響Fig.6 Effect of eugenol on swimming and swarming motility of B. amyloliquefaciens DY1a

表1 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a泳動和叢集運(yùn)動的抑制率Tab.1 Inhibition ratio of eugenol on swimming and swarming motility of B. amyloliquefaciens DY1a

2.6 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞表面特性的影響

細(xì)菌之間及其與界面間的初始相互作用在很大程度上取決于細(xì)菌的表面性質(zhì)[21]，包括表面疏水性和表面電荷。丁香酚對解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞表面特性的影響見圖7。由圖7(a)可知，丁香酚對細(xì)胞表面疏水性有顯著影響(P<0.05)，當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度從1/4 MBIC增加到MBIC時，細(xì)胞表面疏水性從38.49%逐漸減少到19.88%，而未添加丁香酚的對照組其表面細(xì)胞疏水性(47.90%)顯著高于丁香酚添加組(P<0.05)。

不同字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖7 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a細(xì)胞表面特性的影響Fig.7 Effect of eugenol on cell surface properties of B. amyloliquefaciens DY1a

Zeta電位大小可反映細(xì)胞表面凈電荷多少，可作為細(xì)菌之間相互排斥或吸引力強(qiáng)度的度量。不同處理組細(xì)菌Zeta電位均為負(fù)值，這可能與細(xì)胞表面存在的羧基、磷酸鹽等電負(fù)性基團(tuán)有關(guān)[22]。由圖7(b)可知，未添加丁香酚的對照組表面Zeta電位絕對值為41.00 mV，經(jīng)丁香酚處理后細(xì)胞表面Zeta電位絕對值降低，隨著丁香酚質(zhì)量濃度從1/4 MBIC增加到MBIC，細(xì)胞表面Zeta電位絕對值由37.40 mV降至33.33 mV，且丁香酚對細(xì)胞表面電位絕對值的影響大小與質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。

細(xì)菌自聚集是促成生物膜群落的形狀和成熟的重要因素之一，較強(qiáng)的自聚集有助于形成更加結(jié)實致密的生物膜[23]。由圖7(c)可知，添加丁香酚顯著減弱了細(xì)菌的自聚集性(P<0.05)，當(dāng)丁香酚添加質(zhì)量濃度從1/4 MBIC增加到MBIC時，細(xì)菌自聚集性從36.73%逐漸減小到15.93%。根據(jù)熱力學(xué)理論，細(xì)胞表面疏水性的減弱會降低細(xì)胞間表面張力，并增強(qiáng)細(xì)胞與周圍液體培養(yǎng)基之間的張力[24]，使細(xì)胞懸浮液保持均勻分散所需的能量減少，更易保持懸浮狀態(tài)，進(jìn)而表現(xiàn)出自聚集能力的降低。

2.7 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌胞外多糖與蛋白質(zhì)含量的影響

不同字母表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。圖8 丁香酚對解淀粉芽孢桿菌DY1a多糖和蛋白質(zhì)含量的影響Fig.8 Effects of eugenol on polysaccharide and proteincontents of B. amyloliquefaciens DY1a

胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)是生物膜細(xì)胞的骨架，使得生物膜具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并保護(hù)膜內(nèi)微生物，EPS由胞外多糖、蛋白質(zhì)等成分組成，生物膜的EPS含量以多糖和蛋白含量進(jìn)行表征。丁香酚對生物膜中和胞外多糖和蛋白質(zhì)的含量有顯著影響(圖8)。由圖8(a)可知，當(dāng)丁香酚質(zhì)量濃度從1/4 MBIC增加到1/2 MBIC時，生物膜中的多糖和蛋白質(zhì)含量隨著丁香酚質(zhì)量濃度的增加而逐漸減少，而未添加丁香酚的對照組生物膜中的多糖和蛋白質(zhì)含量顯著高于丁香酚添加組。添加MBIC質(zhì)量濃度的丁香酚完全抑制了氣液界面生物膜的形成，該質(zhì)量濃度下生物膜中多糖和蛋白質(zhì)含量未測定。此外，細(xì)菌胞外多糖和蛋白質(zhì)不僅是生物膜基質(zhì)的重要組成成分，同時與菌體在生物膜形成的早期初始黏附階段和界面的黏附過程有關(guān)。因此，本研究進(jìn)一步分析了未成膜的浮游菌體向培養(yǎng)環(huán)境中分泌的胞外多糖和蛋白質(zhì)含量。由圖8(b)可知，添加丁香酚的培養(yǎng)體系胞外溶液中多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度顯著低于未添加丁香酚的對照組，表明丁香酚顯著抑制了浮游菌體分泌至周圍液體培養(yǎng)環(huán)境中的胞外多糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。結(jié)果表明：丁香酚可抑制生物膜基質(zhì)多糖和蛋白質(zhì)的合成與分泌，進(jìn)一步影響了細(xì)菌初始黏附過程，導(dǎo)致成熟生物膜形成的延遲或缺失。

3 討 論

細(xì)菌生物膜的形成包括可逆黏附、不可逆黏附、早期生物膜的形成、成熟生物膜的結(jié)構(gòu)化以及主動播散5個階段[25]。浮游菌體通過集群性聚集不可逆地黏附于成膜界面是生物膜形成早期的重要行為，受細(xì)胞趨化運(yùn)動能力、細(xì)胞間相互黏附力及胞外多糖等生物膜基質(zhì)大分子合成及分泌等因素的影響。氣液界面形成的生物膜與細(xì)菌趨氧生長特性有關(guān)[26]。Nitai等[27]通過自制拍照系統(tǒng)對液體培養(yǎng)基中芽孢桿菌氣液界面生物膜早期靜態(tài)生長期進(jìn)行了延時觀察，發(fā)現(xiàn)生物膜形成早期會在氣液界面中部出現(xiàn)大量細(xì)胞聚集體，并通過群集性產(chǎn)生漩渦運(yùn)動加速生物膜形成過程，認(rèn)為這種集群運(yùn)動現(xiàn)象依賴于鞭毛。因此，氣液界面生物膜形成過程中，界面下的浮游菌體通過集群運(yùn)動移動至氣液界面形成聚集體更為關(guān)鍵。本研究結(jié)果表明：1.500 mg/mL的丁香酚分別顯著抑制了解淀粉芽孢桿菌100.00%和97.50%的泳動和叢集運(yùn)動能力，并進(jìn)一步降低了菌體的自聚集能力。Fekrirad等[28]研究發(fā)現(xiàn)：1.25 μg/mL和2.50 μg/mL的丁香酚可顯著抑制粘質(zhì)沙雷菌的叢集運(yùn)動，并且通過下調(diào)鞭毛運(yùn)動的相關(guān)基因(bsmA、bsmB、fthD、fimC)的表達(dá)抑制生物膜的形成。Liu等[29]發(fā)現(xiàn)，丁香酚對單增李斯特菌CMCC54004生物膜也具有良好的抑制效果，1.28 mg/mL的丁香酚分別抑制100.0%的泳動運(yùn)動和50.3%的叢集運(yùn)動能力。

細(xì)胞表面疏水性與細(xì)菌黏附和表面定殖高度相關(guān)，細(xì)菌黏附能力隨著細(xì)胞表面疏水性的增加而增加[30]。本研究結(jié)果表明：添加0.375～1.500 mg/mL的丁香酚使解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞表面電負(fù)性降低8.78%～18.70%，疏水性下降19.65%～58.50%。細(xì)胞表面疏水性強(qiáng)弱與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)、脂多糖等有關(guān)。在不少精油抗生物膜研究中也發(fā)現(xiàn)，生物膜形成的減少伴隨著細(xì)菌表面疏水性下降及負(fù)電荷減少，Araby等[31]研究發(fā)現(xiàn)，5～25 μL/mL迷迭香精油可與菌體表面蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞表面暴露在外的疏水性基團(tuán)減少，親水性基團(tuán)增加，疏水性降低13.4%～58.2%。Ashrafudoulla等[10]發(fā)現(xiàn)丁香酚能抑制耐藥副溶血性弧菌生物膜的形成，0.6%的丁香酚能顯著降低32%～41%的細(xì)菌表面疏水性。正常生理條件下，細(xì)菌細(xì)胞表面分布帶有電負(fù)性基團(tuán)的脂多糖、糖蛋白等分子而呈較強(qiáng)的電負(fù)性[32]。丁香酚分子中存在游離羥基[33]，當(dāng)丁香酚與細(xì)菌表面相互作用時，吸引帶正電的基團(tuán)產(chǎn)生重排現(xiàn)象，從而導(dǎo)致解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞表面電負(fù)性降低，疏水性下降。

丁香酚對解淀粉芽孢桿菌生物膜外培養(yǎng)基及生物膜內(nèi)基質(zhì)的胞外多糖和蛋白質(zhì)合成均有干擾抑制作用，0.750 mg/mL丁香酚分別顯著抑制了生物膜基質(zhì)和胞外溶液中的胞外多糖(94.8%和67.3%)和蛋白質(zhì)(46.7%和36.9%)含量。Ashrafudoulla等[10]也有類似發(fā)現(xiàn)，添加0.6%丁香酚可使副溶血性弧菌ATCC27969和NIFS29的胞外多糖含量分別降低78%和71%，表明丁香酚不僅可以影響浮游菌體早期黏附聚集過程，同時干擾了生物膜內(nèi)部處于非運(yùn)動狀態(tài)細(xì)胞合成生物膜基質(zhì)大分子的能力。另外，1/2 MBIC丁香酚的添加改變了生物膜表面形貌，靠近空氣面表面褶皺明顯減少，變得較為光滑。此外，在丁香酚質(zhì)量濃度為1/2 MBIC和1/4 MBIC條件下，丁香酚對叢集能力的抑制效果優(yōu)于對泳動能力，主要是因為叢集運(yùn)動不僅受到鞭毛的影響，還受表面濕度的影響[32]，胞外多糖可作為濕潤劑為瓊脂中游動的細(xì)菌提供一層薄薄的液體潤滑，促進(jìn)叢集運(yùn)動的延伸遷移，因此丁香酚在抑制鞭毛運(yùn)動的同時，還可能抑制了胞外多糖的分泌，雙重作用抑制了叢集運(yùn)動。

本研究從細(xì)菌運(yùn)動及菌體表面特性變化的視角解釋了丁香酚對解淀粉芽孢桿菌生物膜的抑制作用。氣液界面生物膜的形成相較于固液界面生物膜更為復(fù)雜。目前關(guān)于丁香酚抑制解淀粉芽孢桿菌氣液界面生物膜機(jī)制的理論研究相對較少。因此，通過轉(zhuǎn)錄組、代謝組等組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步揭示丁香酚對解淀粉芽孢桿菌氣液界面生物膜形成相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理十分必要。此外，雖然解淀粉芽孢桿菌是導(dǎo)致豆制品變質(zhì)的主要腐敗菌，但并未將丁香酚應(yīng)用到豆制品的保鮮防腐實驗中進(jìn)行驗證，因此丁香酚在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果有待進(jìn)一步驗證。

4 結(jié) 論

丁香酚對豆制品腐敗菌解淀粉芽孢桿菌DY1a氣液界面生物膜具有良好的抑制和清除活性， MBIC為1.500 mg/mL，在該質(zhì)量濃度下對成熟生物膜的清除率為28.85%。丁香酚通過干擾與生物膜形成早期細(xì)胞黏附和聚集過程相關(guān)的運(yùn)動能力，減弱細(xì)胞表面疏水性和負(fù)電位，抑制胞外多糖和蛋白質(zhì)合成，最終抑制或延緩生物膜的形成。丁香酚在豆制品等食品加工中芽孢桿菌生物膜的污染控制方面可能具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。