泌乳期母兔乳中微生物多樣性變化規(guī)律研究

于志凱 王國(guó)洲,2 來(lái)寧潔 吳峰洋 夏 苗 郭萬(wàn)華 劉亞娟 陳寶江*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071001；2.國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，保定 071001；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，保定 071001；4.山東省聊城市東阿縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，聊城 252200)

初生仔兔腸道菌群的構(gòu)建對(duì)其成活及后期發(fā)育至關(guān)重要，健康的腸道菌群可以提高仔兔的生長(zhǎng)性能、促進(jìn)免疫系統(tǒng)成熟和發(fā)育[1]，腸道菌群代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸還可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)腸道外其他器官的代謝[2]。而非健康狀態(tài)下即腸道菌群紊亂是造成仔兔腹瀉的主要原因之一，據(jù)家兔病情統(tǒng)計(jì)，在平均死亡率為24%的兔群中，超75%為腹瀉所致[3]。子代出生后腸道微生物開始定植[4]，母乳作為子代哺乳期最主要的食物，對(duì)于子代腸道功能發(fā)育與腸道免疫系統(tǒng)的成熟關(guān)系重大[5]。母乳中含有抗體、溶菌酶、生長(zhǎng)因子、抗菌肽和母乳低聚糖等多種生物活性物質(zhì)和免疫因子，能夠促進(jìn)子代免疫系統(tǒng)的發(fā)育，抵抗病原體的侵襲[6-7]。研究顯示，雙歧桿菌和乳酸桿菌可以通過(guò)母乳喂養(yǎng)垂直傳遞給子代，利用母乳低聚糖在子代腸道內(nèi)增殖[4,8]。母乳微生物通過(guò)乳汁直接影響子代腸道微生物組成，從而對(duì)子代健康形成長(zhǎng)久影響，因此，研究哺乳期內(nèi)母乳中微生物變化規(guī)律，構(gòu)建乳汁菌群結(jié)構(gòu)模型是研究子代腸道菌群結(jié)構(gòu)的重要環(huán)節(jié)。

以前關(guān)于哺乳期母乳菌群變化的研究大多集中于人及反芻動(dòng)物。迄今為止，在人初乳中發(fā)現(xiàn)了154種細(xì)菌，在過(guò)渡乳中發(fā)現(xiàn)了127種細(xì)菌[9-10]，乳中微生物受遺傳、分娩方式、環(huán)境差異等多種因素影響[11-12]，核心菌屬差異明顯。Murphy等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人乳在由初乳向常乳過(guò)渡過(guò)程中，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，厭氧菌在常乳中的豐度提高。Niyazbekova等[14]研究表明，山羊不同泌乳階段顯著影響乳中微生物群落和多樣性，初乳中富含新鞘氨菌、短桿菌、乳酸桿菌等，而常乳中類桿菌、消化鏈球菌、梭狀芽孢桿菌占比較高。Doyle等[15]研究指出，泌乳期不同顯著影響牛乳微生物群落組成，泌乳中期牛乳中擬桿菌屬、糞桿菌屬、彎曲桿菌屬和紅細(xì)菌的比例較高，而到泌乳后期，放線菌成為牛乳中的優(yōu)勢(shì)菌。迄今為止，關(guān)于哺乳期內(nèi)家兔乳菌群變化規(guī)律的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以伊拉肉兔為研究對(duì)象，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，探索母兔不同泌乳階段乳中菌群變化規(guī)律，以期填補(bǔ)兔乳微生物群落結(jié)構(gòu)研究的空白，為進(jìn)一步闡明仔兔腸道菌群來(lái)源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

從同批人工授精的3胎次伊拉妊娠母兔中選取12只體況良好、同天分娩，產(chǎn)仔數(shù)≥7的母兔，通過(guò)調(diào)整寄養(yǎng)使每只母兔哺喂7只仔兔。試驗(yàn)于母兔分娩后開始，至仔兔35日齡斷奶結(jié)束。試驗(yàn)期間按程序進(jìn)行清潔和消毒，保持兔舍通風(fēng)、衛(wèi)生和干燥，母兔哺乳期內(nèi)不使用任何藥物，每天飼喂2次，保持充足飲水。哺乳期母兔所喂基礎(chǔ)飼糧參照De Blas等[16]推薦的兔營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.2 樣品采集及16S rDNA測(cè)序

每只母兔分別于泌乳第0天(分娩后0.5 h內(nèi)，L0)、第3天(L3)采集初乳，泌乳第7天(L7)采集過(guò)渡乳，泌乳第21天(L21)、第35天(L35)采集常乳，收集前用75%酒精對(duì)乳房及周圍進(jìn)行擦拭消毒，棄去第1滴乳汁以后，用無(wú)菌棉簽蘸取母兔乳汁，置于10 mL無(wú)菌離心管中，-80 ℃保存?？侱NA提取、PCR擴(kuò)增和Illumina MiSeq測(cè)序及結(jié)果分析由上海派森諾生物科技有限公司協(xié)助完成。樣品采用OMEGA Mag-Bind soil DNA kit (200)(M5635-02)(Omega Bio-Tek，美國(guó))試劑盒提取總DNA，提取后的DNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分子大小判斷，利用NanoDrop 1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))檢測(cè)DNA的濃度和純度，采用引物338F(5’-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGTWTCATTA-3’)對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，于Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序得到的PE reads進(jìn)行去引物、質(zhì)量過(guò)濾和拼接。利用QIIME軟件對(duì)有效序列在100%序列相似度下進(jìn)行聚類，得到擴(kuò)增子序列變體(ASV)，并與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)ASV分類學(xué)信息?；讷@得的ASV信息，對(duì)乳中微生物進(jìn)行alpha多樣性分析、beta多樣性分析、物種組成分析。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010初步整理后，運(yùn)用R軟件的ggplot2程序進(jìn)行繪圖。利用GraphPad Prism V8.0軟件對(duì)alpha多樣性指數(shù)和微生物相對(duì)豐度進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASV信息統(tǒng)計(jì)與聚類分析

高通量測(cè)序下機(jī)序列經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾、去噪拼接后，60個(gè)兔乳樣本共產(chǎn)生352 7531條高質(zhì)量序列，每個(gè)樣本平均序列為58 792條，序列長(zhǎng)度分布在26～442 bp。物種累積曲線可用于判斷樣本量是否足夠并估計(jì)群落豐富度，由圖1-A可知，隨著樣本量增大，曲線上升速度趨于平緩，表明測(cè)序深度足夠、樣品量足以反映物種組成?；?00%相似度對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行聚類分析，韋恩圖(圖1-B)顯示，L0特征ASV數(shù)量為2 361個(gè)，L3特征ASV數(shù)量為3 105個(gè)，L7特征ASV數(shù)量為7 558個(gè)，L21特征ASV數(shù)量為2 653個(gè)，L35特征ASV數(shù)量為2 933個(gè)，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有的ASV數(shù)量為302個(gè)。

圖1 乳中微生物物種累積曲線(A)和韋恩圖(B)Fig.1 Species accumulation curve (A) and Venn diagram (B) of milk microbiota

2.2 alpha多樣性分析

本試驗(yàn)以Chao1和Observed_species指數(shù)表征豐富度，以Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性，以Goods_coverage指數(shù)表征覆蓋度。由圖2-A可知，各泌乳時(shí)間點(diǎn)的Goods_coverage指數(shù)均在0.92以上，提示測(cè)序結(jié)果可以代表樣本真實(shí)情況。由圖2-B、圖2-C可知，L7的Chao1和Observed-species指數(shù)顯著低于L3、L35(P<0.05)，極顯著低于L0、L21(P<0.01)；由圖2-D、圖2-E可知，L7的Shannon指數(shù)顯著低于L0(P<0.05)，極顯著低于L21(P<0.01)，L3極顯著低于L21(P<0.01)；而對(duì)于Simpson指數(shù)，只有L7顯著低于L21(P<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)間差異均不顯著(P>0.05)。

2.3 beta多樣性分析

根據(jù)Bray_Curtis距離，運(yùn)用主坐標(biāo)分析(PCoA)來(lái)評(píng)估樣品菌群的beta多樣性，由圖3可知，第1主坐標(biāo)(PCo1)、第2主坐標(biāo)(PCo2)分別解釋了總差異性的34.9%、11.6%；5個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)樣本聚類效果較好；L0、L21、L35間樣品聚類在一起，但L3、L7與L0、L21、L35之間出現(xiàn)了明顯分離。

“*”：P<0.05；“**”：P<0.01；“***”：P<0.001。圖4、圖5同 the same as Fig.4 and Fig.5。圖2 兔乳菌群的alpha多樣性Fig.2 Alpha diversity of rabbit’s milk microbiota

圖3 兔乳菌群主坐標(biāo)分析圖Fig.3 PCoA plot of rabbit’s milk microbiota

2.4 菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平結(jié)構(gòu)分析

由圖4-A可知，在門水平上，泌乳母兔乳汁中優(yōu)勢(shì)菌群主要為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)。對(duì)門水平上相對(duì)豐度較高的5個(gè)菌門進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如圖4-B所示，隨著泌乳的進(jìn)行，厚壁菌門相對(duì)豐度先降低后升高，其中L7最低，極顯著低于L0、L35(P<0.01)；L7的變形菌門相對(duì)豐度極顯著高于L0、L3(P<0.01)；擬桿菌門相對(duì)豐度表現(xiàn)為L(zhǎng)7極顯著低于L3、L21(P<0.01)，顯著低于L0(P<0.05)，且以L21最高，顯著高于L35(P<0.05)；隨著泌乳的進(jìn)行，疣微菌門(Verrucomicrobia)相對(duì)豐度先降低后升高，其中L7極顯著低于L0、L21、L35(P<0.01)，L3顯著低于L21(P<0.05)，極顯著低于L35(P<0.01)；放線菌門(Actinobacteria)相對(duì)豐度表現(xiàn)為L(zhǎng)7極顯著高于L0、L3、L21(P<0.01)，L0顯著低于L35(P<0.05)。

2.4.2 屬水平結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步探索不同泌乳階段乳中菌群結(jié)構(gòu)變化，在各階段進(jìn)行屬水平結(jié)構(gòu)分析。由圖5-A可知，在屬水平上泌乳0、3、21、35 d母兔乳中優(yōu)勢(shì)菌群主要為艾克曼菌屬(Akkermansia)、布勞特氏菌屬(Blautia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和考拉菌屬(Phascolarctobacterium)，而泌乳7 d母兔乳中優(yōu)勢(shì)菌群主要為放線桿菌屬(Actinobacillus)。對(duì)屬水平上相對(duì)豐度較高的6個(gè)菌屬進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果(圖5-B)顯示，L7的艾克曼菌屬相對(duì)豐度極顯著低于L0、L21、L35(P<0.01)，L3顯著低于L0、L21(P<0.05)，極顯著低于L35(P<0.01)；隨著泌乳的進(jìn)行，布勞特氏菌屬相對(duì)豐度先降低后升高，其中L0、L3、L35極顯著高于L7(P<0.01)，L21顯著高于L7(P<0.05)；L7的乳桿菌屬、考拉菌屬相對(duì)豐度極顯著低于L0、L21、L35(P<0.01)，L3顯著低于L0、L35(P<0.05)；放線桿菌屬相對(duì)豐度隨著泌乳的進(jìn)行呈先升高后降低趨勢(shì)，在L7時(shí)最高，極顯著高于L0、L21、L35(P<0.01)，L3極顯著高于L0(P<0.01)；不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)相對(duì)豐度隨泌乳進(jìn)行先降低后升高，L0顯著高于L7(P<0.05)，顯著低于L21(P<0.05)，L3極顯著低于L21(P<0.01)，同時(shí)L7極顯著低于L21、L35(P<0.01)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Proteobacteria：變形菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Actinobacteria：放線菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Chloroflexi：綠菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Chlamydiae：衣原體門；Others：其他。圖4 兔乳微生物在門水平上的組成(A)和差異菌群相對(duì)豐度(B)Fig.4 Composition of rabbit’s milk microbiota at phylum level (A) and relative abundance of differential microbiota (B)

3 討 論

母乳中富含微生物，通常認(rèn)為這些微生物參與并影響子代腸道菌群的建立過(guò)程，對(duì)子代的健康有著長(zhǎng)久影響[17]。但泌乳期內(nèi)乳中微生物群落結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化仍存在分歧，有研究表明，人類母乳中微生物高度多樣化，但泌乳期內(nèi)乳汁微生物群落結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定[18]。而另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，不同泌乳階段乳中微生物群落結(jié)構(gòu)組成有顯著差異，且其組成受環(huán)境及母體健康狀況的影響[19]。本研究以alpha和beta多樣性共同表征微生物總體多樣性和群落的生物異質(zhì)性，結(jié)果顯示，隨著泌乳的進(jìn)行，母兔乳中微生物多樣性先降低后升高，以泌乳7 d為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，多樣性最低，這一變化與兔乳中蛋白質(zhì)、乳糖含量變化[20-21]一致。有研究表明，兔初乳向常乳轉(zhuǎn)變的過(guò)程中有一個(gè)過(guò)渡期，初乳中較高含量的干物質(zhì)、脂肪和能量隨泌乳的進(jìn)行逐漸降低，并在泌乳7 d時(shí)過(guò)渡完成，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)趨于穩(wěn)定[20]。本試驗(yàn)中兔乳微生物多樣性在泌乳7 d時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)折的原因可能是隨著泌乳進(jìn)行，兔初乳和過(guò)渡乳中的營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生改變，在過(guò)渡完成后常乳營(yíng)養(yǎng)成分趨于穩(wěn)定，恰恰是乳中營(yíng)養(yǎng)成分的改變影響了菌群的組成和活性[22]。

Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)山羊乳中優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，而關(guān)于哺乳期內(nèi)兔乳中微生物組成的報(bào)道很少。本研究表明，哺乳期母兔乳中優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁桿菌門、擬桿菌門和變形菌門，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，盡管厚壁桿菌門、擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度在整個(gè)哺乳期內(nèi)有所波動(dòng)，但總比例保持在72%～88%，表明這些微生物相互競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位[24]。厚壁菌門可以分解飼糧中的纖維，供機(jī)體利用[25]。擬桿菌門能夠分解母乳和飼糧中的多糖和蛋白質(zhì)，促進(jìn)子代腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育[26-27]。變形菌門最主要的作用是進(jìn)入幼齡動(dòng)物腸道，通過(guò)消耗氧氣創(chuàng)造厭氧環(huán)境，促進(jìn)專性厭氧菌的定植，為幼齡動(dòng)物生長(zhǎng)提供能量[28-29]。但有資料顯示，仔兔腸道中變形菌門的比例極低[30]，這說(shuō)明菌群在子代腸道的定植是一個(gè)選擇性的過(guò)程，乳中只有某些特定菌才能在子代腸道中定植。但對(duì)于母乳微生物群如何定植于新生兒腸道以及選擇性定植機(jī)制需要進(jìn)一步研究。放線菌門是動(dòng)物腸道內(nèi)的重要生理菌群，能夠代謝多糖和寡糖[31]，同時(shí)，放線菌門是兔口腔代表菌[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，初乳中放線菌門的相對(duì)豐度較低，隨著泌乳的進(jìn)行而逐漸升高，在第7天時(shí)達(dá)最大值，這可能是隨著哺乳期的進(jìn)行，仔兔口腔內(nèi)的放線菌門逆行回流至母兔乳腺，釋放至乳中[5]。

Akkermansia：艾克曼菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)桿菌屬；Actinobacillus：放線桿菌屬；Pusillimonas：極小單胞菌屬；Ochrobactrum：蒼白桿菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Corynebacterium：棒狀桿菌屬；Burkholderia：伯克氏菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Dorea：多爾氏菌屬；Clostridiaceae_Clostridium：梭菌科_梭菌屬；Staphylococcaceae_Staphylococcus：葡萄球菌科_葡萄球菌屬；Pasteurella：巴氏桿菌屬；Facklamia：費(fèi)克藍(lán)姆氏菌屬；Others：其他。圖5 兔乳微生物在屬水平上的組成(A)和差異菌群相對(duì)豐度(B)Fig.5 Composition of rabbit’s milk microbiota at genus level (A) and relative abundance of differential microbiota (B)

母兔乳中的主要菌屬是艾克曼菌屬、布勞特氏菌屬、乳桿菌屬、考拉桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬，這與豬乳微生物群落結(jié)構(gòu)(以瘤胃球菌屬、鏈球菌屬、未分類梭狀芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、棒狀桿菌屬和未分類毛螺菌屬為主要菌屬)明顯不同[33]，造成這一差異的原因可能是兔與豬屬于不同科屬動(dòng)物，豬飼糧以精料為主，需要消化大量淀粉，兔則為草食動(dòng)物，主要特點(diǎn)是能夠充分利用高纖維飼糧。同時(shí)，豬和兔乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量不同，有研究表明兔乳中的干物質(zhì)、脂肪、蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于豬乳，而乳糖含量則低于豬乳[34-36]。本研究在兔乳中檢測(cè)到腸道相關(guān)微生物，如阿克曼菌屬、布勞特氏菌屬和考拉菌屬。艾克曼菌屬可以通過(guò)糖苷水解酶分解寡糖供機(jī)體利用[37]，與放線菌門競(jìng)爭(zhēng)乳中寡糖，在本試驗(yàn)中，隨放線菌門相對(duì)豐度升高，艾克曼菌屬的相對(duì)豐度降低。布勞特氏菌屬是腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬，在維持腸道環(huán)境平衡和預(yù)防炎癥方面具有重要意義，本試驗(yàn)中，在泌乳期內(nèi)，布勞特氏菌屬相對(duì)豐度先降低后升高，與Chen等[33]研究結(jié)果趨勢(shì)一致。乳桿菌屬作為兔乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬，不僅可促進(jìn)仔兔腸道菌群的定植，還可保障母體健康，有研究表明乳中乳桿菌屬可以預(yù)防乳房炎，抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)和感染[38-39]?？祭鷮偈且环N嚴(yán)格厭氧菌，主要存在于腸道中，其可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，并與宿主的代謝狀況有關(guān)[40-41]，兔腸道中的考拉菌屬可能是通過(guò)腸-乳途徑進(jìn)入兔乳中。腸-乳途徑是一種內(nèi)源性途徑，樹突狀細(xì)胞通過(guò)這種途徑在腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接處引入開口，通過(guò)樹突獲取兔腸道中考拉菌屬，隨后樹狀細(xì)胞通過(guò)淋巴和血液循環(huán)，最終到達(dá)乳腺導(dǎo)管，釋放到母兔乳中。Maertens等[20]研究發(fā)現(xiàn)，哺乳母兔乳中乳糖含量先降低后升高，與本試驗(yàn)中不動(dòng)桿菌屬相對(duì)豐度的變化規(guī)律一致，這可能是因?yàn)橥萌橹胁粍?dòng)桿菌屬可以利用乳糖進(jìn)行生長(zhǎng)[34]。

4 結(jié) 論

① 泌乳期母兔乳中微生物多樣性隨泌乳的進(jìn)行先降低后升高，泌乳第7天是轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

② 母兔乳中優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，其變化主要出現(xiàn)在過(guò)渡乳階段；優(yōu)勢(shì)菌屬為艾克曼菌屬、布勞特氏菌屬、乳桿菌屬、考拉菌屬和不動(dòng)桿菌屬，其變化主要出現(xiàn)在初乳和過(guò)渡乳階段。