形覺剝奪性近視的視網膜調控機制研究進展△

馮嬌嬌 宋繼科 畢宏生

形覺剝奪性近視(FDM)是近視研究的主要動物模型之一,通過使視網膜成像障礙(失去對比度及空間頻率),從而導致眼軸增長形成近視[1]。形覺剝奪學說認為眼軸伸長是一種在神經和生物活性物質調控下的眼球主動重塑的過程,主要是玻璃體的伸長,并伴有視網膜、脈絡膜和鞏膜變薄[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),在視覺發(fā)育期間,任何使視網膜成像障礙的條件均會引起FDM,由于先天性白內障[4]、角膜炎[5]、上瞼下垂[6]以及視網膜神經節(jié)細胞軸突的持續(xù)髓鞘化[7]導致的形覺剝奪引發(fā)的近視,其機制可能與在動物體上觀察到的FDM的機制類似。因此,本文將總結近年來與FDM視網膜發(fā)病機制相關的神經遞質和離子以及最新的FDM相關的視網膜組學的研究進展,從而就FDM發(fā)生的視網膜調控機制做一綜述,以期為FDM視網膜調控機制的進一步研究提供新見解,為藥物治療近視探索潛在干預靶點提供新思路。

1 FDM動物模型研究進展

1977年,Wiesel等[8]通過縫合恒河猴幼猴眼瞼,最早建立了FDM模型。不久后,又通過縫合樹鼩[9]、雛雞[10]、貓[11]、兔[12]、鼠[13]的眼瞼成功誘發(fā)了FDM,以及新生獼猴由于角膜混濁也造成了眼軸伸長[14]。隨后的研究中使用塑料護目鏡[15]、乳膠面罩[16]、基于尼龍搭扣[2]或頭戴式底座將半透明彌散片固定在眼部來誘導FDM[17]。由于眼球結構和正視化機制與人類近視相似,豚鼠被廣泛用于目前的近視研究[18]。近視的程度和眼球伸長率因物種而異。在10 d的形覺剝奪后,模型雞眼近視屈光度可達到-17 D[19],而靈長類動物在17周的形覺剝奪后近視屈光度為-5～-6 D[20],這可能是由于實驗方法的差異、形覺剝奪的持續(xù)時間、動物模型之間固有的眼部解剖等的差異。盡管如此,FDM在如此廣泛的動物中發(fā)生的事實表明,從進化的角度來看,導致FDM的眼部生長調節(jié)的視覺依賴機制是普遍存在的,并且該機制在物種間可能是保守的[21]。

2 FDM的視網膜調控機制

1991年,Schaeffel等[22]最先提出FDM是一種“開環(huán)”病,近視是由于缺乏來自形覺剝奪的視網膜的視覺反饋和沒有定義的屈光終點而導致眼部生長不受限制的結果。值得注意的是, FDM是一種分級現(xiàn)象,軸性近視的程度與視網膜圖像對比度的降低程度呈正相關。即使是視網膜成像質量的輕微失真也可能導致一定程度的近視[23]。剝奪視網膜圖像的亮度或高敏銳度視覺會產生軸性近視,清晰、高對比度的視網膜圖像對于眼部的正常生長至關重要[1]。

導致眼球過度伸長最初的生物化學信號級聯(lián)發(fā)生在視網膜,但視網膜神經網絡對異常視覺輸入改變眼部生長的機制尚不清楚。動物模型研究表明,視網膜成像模糊會引發(fā)信號級聯(lián)反應,從而導致視網膜和視網膜色素上皮(RPE)發(fā)生大量細胞和生物化學變化[24],視網膜神經元會分泌大量的生長調節(jié)神經遞質,如多巴胺(DA)、視黃酸(RA)、血管活性腸肽(VIP)和黑視蛋白等,從而向脈絡膜以及鞏膜發(fā)出信號導致眼球整體生長和屈光狀態(tài)發(fā)生變化。視網膜是該視覺信號的重要組成部分,因為它是視覺感知的第一層光敏神經元。此外,研究表明,切斷雛雞[25]和豚鼠[26]的視神經并不能阻止它們FDM的發(fā)展。這表明,眼球生長的視覺調節(jié)主要發(fā)生在視網膜。

2.1 視網膜DA機制

DA是包括人類在內的所有脊椎動物視網膜中的主要兒茶酚胺。 DA由酪氨酸經酪氨酸羥化酶轉化為左旋多巴,再經左旋多巴脫羧酶的作用轉化而成,細胞質中的DA由囊泡單胺轉運體轉運至突觸小泡,釋放后與DA受體結合啟動信號轉導?；谒鼈冊诎屑毎姓{節(jié)環(huán)磷酸腺苷產生的能力,DA受體分為D1樣家族和D2樣家族(分別為D1R和D2R),它們的刺激會增加或減少細胞內環(huán)磷酸腺苷水平,并相應地上調或下調蛋白激酶A[27]。 DA由多巴胺能無長突細胞和網間細胞合成和釋放,這些細胞占無長突細胞群的比例低于1%[28]。 DA的釋放受到光照水平的強烈影響,具有晝夜節(jié)律,白天釋放較高,夜間釋放較低[29]。 DA被認為在光適應中通過控制細胞耦合和調節(jié)視網膜的晝夜節(jié)律發(fā)揮神經調控作用[30]。在FDM實驗誘導的眼部生長和屈光狀態(tài)的改變中, DA途徑代謝產物的變化以及多巴胺能藥物對實驗誘導的近視影響表明了 DA在眼部生長調節(jié)中的作用。目前,常用的檢測視網膜中DA水平的方法是高效液相色譜法(HPLC),這種方法只能檢測到總的DA水平,因此,以高空間分辨率直接觀察視網膜中的DA對于了解其分子與FDM發(fā)展過程中的生物化學機制至關重要。 Ren等[31]研發(fā)了一種基于表面增強拉曼散射的納米探針,該探針已應用于FDM豚鼠的活細胞和視網膜組織中的DA成像,并進一步研究了FDM小鼠視網膜的DA水平,結果表明,經過2周形覺剝奪后,FDM豚鼠和FDM小鼠視網膜中的DA水平均下降,這與近視的發(fā)展有關。

大量的藥理學研究支持DA在FDM發(fā)生發(fā)展中的作用[32-36]。Thomson等[32]研究發(fā)現(xiàn),每天在雞玻璃體內注射DA或多巴胺能激動劑可以劑量依賴性地抑制FDM的發(fā)展。進一步研究表明,通過局部滴眼液給藥也可以抑制雛雞FDM的發(fā)展[33]。Landis等[34]評估了全身性 L-3,4-二羥基苯丙氨酸注射對 C57BL/6J小鼠FDM的影響,結果表明,內源性增加DA合成和釋放可預防小鼠發(fā)生FDM。為了研究DA受體在FDM發(fā)生發(fā)展中的作用,Zhang等[35]將D1R (SKF38393)和 D2R(喹吡羅)的激動劑及相應的拮抗劑(SCH23390 和舒必利)對FDM豚鼠進行球周注射,具有電化學檢測功能的HPLC定量測量了視網膜和玻璃體中DA水平及其代謝產物 4-二羥基苯乙酸水平,結果表明,在FDM豚鼠視網膜中D1R激活受到抑制,而D2R激活增強。Huang等[36]研究通過在C57BL/6小鼠腹腔內注射D2R全激動劑喹吡羅和D2R部分激動劑阿立哌唑后發(fā)現(xiàn),喹吡羅在低劑量時能抑制FDM的發(fā)展,而在高劑量時則促進FDM的發(fā)展,這種雙向效應被D2R的特異性所驗證。 D2R部分激動劑阿立哌唑在高劑量時減弱了FDM的發(fā)展,但在低劑量時并沒有此作用。因此, D2R介導的信號轉導能力的降低有助于近視的發(fā)展。

如上所述,無論以何種方式增加內源性DA的合成和釋放均可抑制FDM,且D1R在FDM中的抑制與D2R的激活也已被其相應的激動劑和拮抗劑所證實。

2.2 視網膜RA機制

RA是維生素A的衍生物,是視網膜光感受器細胞中視蛋白結合物視黃醛的最終代謝產物,主要由RPE細胞合成[37]。目前,RA發(fā)揮作用的經典途徑主要以全反式的形式,全反式視黃酸(atRA)是RA的一種活性形式。全反式視黃醇經視黃醇脫氫酶氧化生成全反式視黃醛,再經細胞質視黃醛脫氫酶氧化成atRA。核RA受體(RAR)和RA的X受體的二聚體與atRA結合,隨后與DNA結合并影響轉錄。合成后,atRA可以與許多RA結合蛋白中的一種結合,以促進細胞內或細胞外轉運或由細胞色素P450亞家族26代謝[38]。

早期大量研究已證實,FDM雛雞[39]、FDM豚鼠[40]和FDM絨猴[41]視網膜中RA和視黃醛脫氫酶2水平升高,并且在從FDM中恢復期間,視網膜RA水平受到抑制[40]。Huang等[42]利用HPLC測量RA水平,并通過蛋白質印跡和實時PCR測定形覺剝奪2周后豚鼠視網膜中RA結合蛋白I(CRABP-I)和RAR-β的表達,結果發(fā)現(xiàn),視網膜RA水平迅速升高,CRABP-I和RAR-β表達緊隨RA增多之后也增多。毛玉梅等[43]研究發(fā)現(xiàn),形覺剝奪4周后,豚鼠視網膜RPE細胞內視黃醇脫氫酶5(RDH5)基因在轉錄和蛋白水平的表達均下調,其可能機制是在近視發(fā)展過程中體內RA含量增多,呈負反饋地調節(jié)RDH5基因的表達。Zhang等[44]研究發(fā)現(xiàn),atRA能增加人RPE細胞表達轉化生長因子-β2(TGF-β2),而且atRA通過磷脂酶C信號通路而非腺苷酸環(huán)化酶信號通路刺激RPE細胞分泌TGF-β2,磷脂酶 C 抑制劑(U73122)可抑制atRA并促進近視發(fā)展。另外,RA是目前研究中唯一在FDM動物模型中于視網膜、脈絡膜及鞏膜中均發(fā)生變化的信號分子[24,45]。

總之,視網膜和脈絡膜RA合成的變化以及RA對鞏膜生長的影響表明,RA在FDM調節(jié)中具有重要作用,它既可能是從視網膜到鞏膜信號級聯(lián)的一部分,也可能是鞏膜細胞外變化的效應器,需要進一步的研究來闡明參與調節(jié)視網膜和脈絡膜RA合成及其對鞏膜調節(jié)的分子機制。

2.3 視網膜VIP機制

VIP是一種28個氨基酸的神經肽,屬于胰高血糖素/分泌素超家族,這種配體與VIP受體2(VIPR2)結合并激活VIPR2,進而增加心肌的收縮能力和糖原分解,以及其他生理活動[46]。VIPR2廣泛存在于角膜、視網膜、RPE、脈絡膜和鞏膜,VIPR2功能障礙可能促進近視的發(fā)展[47]。有研究表明,FDM猴[48]、FDM雞[49]和FDM豚鼠[50]的視網膜中VIP基因和蛋白表達水平增加。這些結果表明,VIP-VIPR2 信號通路的激活可能導致近視。Zhao等[51]在FDM小鼠模型中發(fā)現(xiàn),形覺剝奪眼視網膜雙極細胞VIP基因的表達呈現(xiàn)早期顯著下調的趨勢,這與先前的大多數(shù)研究不同。進一步的藥理學實驗發(fā)現(xiàn),與載體對照相比,應用選擇性VIPR2拮抗劑PG99-465會促進近視發(fā)展,而選擇性VIPR2激動劑RO25-1553則會抑制近視進展,且在VIPR2基因敲除小鼠中屈光度顯著偏向近視。以上研究均證實了VIP-VIPR2信號通路在FDM中的重要作用。

VIP基因在FDM模型視網膜中的表達不一致可能是由于先前的研究集中在視網膜總mRNA及蛋白水平的變化上,而Zhao等[51]的研究是利用單細胞RNA測序技術發(fā)現(xiàn)了在雙極細胞中VIP基因的表達在FDM早期下調,且實驗動物物種和形覺剝奪持續(xù)時間也有所不同。這些不同的結果表明,VIP-VIRP2對近視的調節(jié)是復雜的,還需要更多的研究來闡明它在FDM發(fā)生發(fā)展過程中的具體機制。

2.4 視網膜黑視蛋白機制

黑視蛋白是脊椎動物中由視蛋白4(opn4)基因編碼的G蛋白偶聯(lián)視蛋白,與其他視蛋白不同,黑視蛋白不參與視網膜外層光感受器的光轉導,但對光敏感[52]。最近,已有研究發(fā)現(xiàn),內層視網膜中的固有光敏視網膜神經節(jié)細胞(ipRGC)中含有黑視蛋白,并且與晝夜節(jié)律的調節(jié)密切相關[53]。Liu等[54]使用黑視蛋白抗體通過定量蛋白質印跡分析測試了FDM小鼠視網膜中的黑視蛋白水平發(fā)現(xiàn),形覺剝奪眼ipRGC的黑視蛋白表達水平及其介導的光反應幅度均出現(xiàn)顯著上調,而ipRGC消融或將黑視蛋白敲除,以及將小鼠飼養(yǎng)于480 nm波長光(黑視蛋白的最大激發(fā)波長)缺如的環(huán)境中造成黑視蛋白激活程度下調后,形覺剝奪誘導近視的效應顯著減小。然而,Chakraborty等[55]利用黑視蛋白基因敲除(opn4-/-)的小鼠研究了黑視蛋白對正常屈光發(fā)育和FDM的影響,結果發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,在正常環(huán)境中飼養(yǎng)的opn4-/-小鼠在4周后近視更明顯,而在形覺剝奪3周后,opn4-/-小鼠的近視程度比opn4+/+小鼠更大。 兩項研究結果不一致的原因可能在于一些方法學的差異,例如用于消融ipRGCs的技術,形覺剝奪的時間以及對照組的處理方式等。

以上研究結果表明,黑視蛋白信號通路在小鼠正常屈光發(fā)育和FDM進展中均有潛在作用,然而其具體機制尚未闡明。并且,目前的研究僅局限在小鼠這個實驗模型中,仍需進一步研究黑視蛋白在其他FDM實驗動物模型中的作用,以期進一步探究其具體的調控機制。

2.5 視網膜離子驅動外排機制

Crewther[56]提出了導致近視的視網膜離子驅動外排(RIDE)理論,該理論認為形覺剝奪會擾亂光感受器和視網膜下空間之間的離子和液體交換速率,同時影響神經遞質傳遞、組織滲透壓調節(jié)和代謝通路。有研究通過電子顯微鏡和相對鈉離子和氯離子豐度對雛雞形覺剝奪視網膜及脈絡膜組織進行超微結構觀察表明,雛雞眼2周的形覺剝奪會導致異常的眼球延長,伴隨視網膜厚度和脈絡膜厚度減少30%;該研究指出,脈絡膜變薄可能是由于血管和淋巴管的管腔收縮,以及脈絡膜毛細血管的小血管密度顯著降低[57]。而去除形覺剝奪會導致整個視網膜和脈絡膜的血管外水腫,從最大水腫程度中恢復的過程是從視網膜開始的,然后再發(fā)生于脈絡膜[58]。形覺剝奪2周后雛雞脈絡膜、RPE和光感受器外段(OS)的鈉離子豐度和氯離子豐度明顯高于對側眼的相同區(qū)域。然而,脈絡膜中鈉離子豐度和氯離子豐度的變化大于RPE和OS,RPE、OS和脈絡膜的鈉離子和氯離子豐度在去除形覺剝奪48 h內均能恢復到正常范圍,但氯離子比鈉離子恢復得更快。因此,外部視網膜和RPE顯示出高滲透壓的跡象[58]。Crewther等[59]應用能量色散X射線微量分析發(fā)現(xiàn),形覺剝奪2周后,雛雞視網膜中鉀離子豐度升高,包括OS、視網膜下空間和RPE中,以及整個視網膜和脈絡膜的鈉離子和氯離子均升高,該結果與以上研究結果一致。這些結果證明,表征FDM的生物特征和超微結構變化與外層視網膜/RPE中鉀離子豐度顯著升高以及視網膜所有層中鈉離子和氯離子的高豐度有關。Yang等[60]在FDM豚鼠中的研究發(fā)現(xiàn),形覺剝奪4周后,豚鼠視網膜中的鉀離子濃度顯著升高,進一步證實了Crewther等[59]的研究結果。Giummarra等[61]利用基因集富集分析發(fā)現(xiàn),早在雛雞形覺剝奪后6 h和72 h,線粒體能量代謝、神經傳遞和隨后參與離子穩(wěn)態(tài)的基因通路變化與軸向伸長和屈光變化緊密相關。FDM早期恢復期間膽汁酸代謝的抑制突出了維持近視中能量代謝的重要性。這些發(fā)現(xiàn)也為RIDE理論中視網膜和脈絡膜變薄、軸向伸長和高滲離子分布模式提供了證據。

以上研究均已證實玻璃體、視網膜、RPE與脈絡膜之間液體流動與離子交換在FDM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,因此,抑制液體通過視網膜/RPE的正常流出會導致玻璃體體積增加、軸向伸長并誘發(fā)屈光狀態(tài)變化,從而導致近視。

2.6 FDM視網膜相關組學研究

早期的研究已經確定了幾個基因和視網膜物質在FDM發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[31,42,48-51],然而這些研究僅能解釋發(fā)生形覺剝奪時視網膜的微觀結構或局部改變,無法從全局的角度觀察視網膜的整體改變。近年來,通過轉錄組學[62]、蛋白質組學[63]和非小編碼RNA(miRNA)組學[64]研究發(fā)現(xiàn),形覺剝奪誘導的眼軸伸長其潛在生長調節(jié)因子顯著增多,這些研究通過富集分析揭示了可能構成眼部生長調節(jié)新的生物化學信號通路。Vocale等[62]使用RNA轉錄組測序技術研究發(fā)現(xiàn),形覺剝奪7 d后雛雞視網膜γ-氨基丁酸和甘氨酸介導的氯離子轉運途徑的抑制是唯一顯著改變的生物化學途徑,這個發(fā)現(xiàn)在一定程度上支持 RIDE 理論。近視可引起視網膜變性,Zeng等[65]建立了豚鼠FDM誘發(fā)的早期視網膜變性模型,并利用RNA轉錄組測序技術研究了其作用機制,形覺剝奪15周后,FDM 視網膜中有152個基因表達上調,12個基因表達下調。京都基因和基因組數(shù)據庫(KEGG)富集分析顯示,FDM眼中酪氨酸代謝、ABC轉運蛋白和炎癥通路上調,而緊密連接、脂質和糖胺聚糖生物合成下調[65]。Yang等[66]利用氣相色譜-飛行時間質譜儀對FDM豚鼠視網膜進行代謝組學研究發(fā)現(xiàn),形覺剝奪3 d和2周后分別有11種和16種代謝物水平發(fā)生變化,表明FDM的發(fā)展與視網膜脂質生物合成下降、三羧酸循環(huán)周轉以及葡萄糖積累的增加有關。Zhu等[63]利用同位素標記相對和絕對定量質譜技術(iTRAQ-MS)和所有理論光譜的順序窗口采集質譜技術(SWATH-MS)的定量蛋白質組學技術,在FDM動物模型患眼和10.0 g·L-1阿托品治療的患眼之間篩選出12種表達上調的蛋白質和17種表達下調的蛋白質,通過差異通路篩選了阿托品治療FDM的潛在生物學途徑包括真核起始因子2(EIF2)信號、糖酵解和DA的調節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),在轉錄后水平下調靶基因的內源性miRNA與近視或其他眼部疾病中的眼部生長調控有關[64,67]。Mei等[64]從FDM小鼠的視網膜組織中篩選出了24個表達上調的miRNA,KEGG通路富集分析顯示,軸突引導和TGF-β信號通路顯著富集,另外,miR-466h-5p和miR-466j在一些與突觸傳遞相關的生物學過程中顯著富集。為了對FDM小鼠的miRNA表達譜進行全面的生物信息學分析,Liu等[67]對兩個原始微陣列數(shù)據集(GSE58124和GSE84220)中差異表達的miRNA進行了功能富集分析和蛋白質相互作用分析,結果發(fā)現(xiàn),FDM小鼠視網膜組織中,mmu-miR-1936和mmu-miR-338-5p表達均上調。因此,這些差異miRNA可能通過干擾其富集的途徑或FDM進展中的生物學過程而發(fā)揮作用。

以上研究表明,在大規(guī)模組學研究中使用內外視網膜揭示了形覺剝奪啟動的相似生物學機制。為了提高對形覺剝奪視網膜局部調控機制的理解,未來的研究需要整合在可比較的實驗條件下收集的多個水平的組學數(shù)據。在相同動物模型中收集同步轉錄組學和蛋白質組學測量的研究也有助于闡明在這些研究類型中發(fā)現(xiàn)的倍數(shù)變化不一致是由于方法學因素(如表達譜分析的時間)還是翻譯后事件。鑒于最近出現(xiàn)的下一代轉錄組學和蛋白質組學技術[68],例如單細胞原位蛋白質組學[69]、空間轉錄組學[70]等技術,未來的研究將會在重復性、敏感性和覆蓋率方面產生更高質量的數(shù)據集。這些研究將為繼續(xù)利用動物模型研究人類近視發(fā)生的生物學基礎和開發(fā)新的治療方法提供強有力的上游數(shù)據支持。

3 結束語

通過對FDM實驗動物模型的研究,已經確定了如DA、 RA、 VIP、黑視蛋白等視網膜神經遞質和RIDE機制在FDM的視網膜調控中發(fā)揮重要的作用。隨著視網膜相關組學的進一步研究表明,形覺剝奪可觸發(fā)視網膜信號級聯(lián)反應,進而促進眼球生長,這一過程涉及一個復雜的網絡信號通路,解決這一問題的方法是將近視分子水平研究發(fā)展到下一個層次,例如將空間轉錄組學與單細胞原位蛋白質組學相結合,從而確定蛋白質功能和調控基因表達的關系,這將是未來的研究方向。隨著對實驗模型研究的不斷深入,可以更全面地了解形覺剝奪導致眼球生長的機制,包括涉及的神經回路、細胞和分子生物學機制,從而有助于推動新的、更有效的近視治療方法的研發(fā)。