‘陽光’佛手柑特征香氣成分的GC-MS分析及感官評價

蔡尉彤，許 瀅，馮 濤，王化田，宋詩清，姚凌云，孫 敏，柳 倩，于 闖

（上海應用技術(shù)大學香料香精化妝品學部，上海 201418）

佛手柑是蕓香科柑橘屬的香櫞變種，別名佛手香櫞、五指橘、福壽柑、蜜羅柑等，因果實形狀彎曲修長似手指，故稱其為“佛手”。佛手柑以果入藥，是我國常用的中藥材，又因造型獨特成為名貴的觀果、觀葉植物[1]。我國佛手柑的種植歷史已有上百年之久，產(chǎn)地主要分布于閩、粵、云、川、江、浙等地，其中產(chǎn)自浙江金華的金佛手憑借優(yōu)越的地理位置和生長環(huán)境，成為我國佛手品系中的上品，堪稱“果中之仙品”。

目前的研究主要集中在金佛手果實或精油中的揮發(fā)性香氣成分的組成上，主要有萜烯類、醛類、醇類、酮類、酯類、香豆素類等[2]，其中相對含量占比較大的多為萜烯類物質(zhì)中的檸檬烯和γ-松油烯[3-4]，并且金佛手的果皮比果肉更富含香氣物質(zhì)[5]。然而，僅通過GC-MS 分析得到各組分相對含量的大小，并不能確定金佛手的關鍵香氣成分，因為水果或食品飲料中大部分的揮發(fā)性物質(zhì)組分對整體香氣完全或幾乎沒有影響[6]。為進一步得到關鍵香氣物質(zhì)，宋詩清等[7]以香氣活力值（odor activity value，OAV）為變量指標，建立線性回歸模型得到對金佛手整體香氣貢獻程度較大的組分，以及確定其特征香氣組成。楊君等[8]結(jié)合氣相色譜嗅聞技術(shù)（gas chromatography-olfactory，GC-O），更準確地定性驗證得到金佛手的關鍵致香成分及其主體香韻。這也為從揮發(fā)性物質(zhì)組分中篩選得到特征香氣成分提供了更準確的研究方法和思路。

本試驗采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）富集提取揮發(fā)性物質(zhì)成分，通過氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合香氣強度法的嗅聞檢測（GC-MS-O）分析鑒定得到‘陽光’佛手柑的香氣成分，再運用定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法進行感官評定，來驗證‘陽光’佛手柑的特征香氣成分，為金佛手的新品種‘陽光’佛手柑的香氣構(gòu)成提供一定的理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘陽光’佛手柑：產(chǎn)自金華農(nóng)業(yè)科學院Finger Citron研究所；2-辛醇，色譜純，上海源葉生物科技有限公司；C7～C40正構(gòu)烷烴，色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器與設備

8860-5977B 型GC-MSD 聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，上海安譜實驗科技股份有限公司；8860（FID）-ODP3 GC-O 裝置，德國Gerstel公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取

頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）富集揮發(fā)性物質(zhì)組分將冷凍的佛手柑果實直接用剪刀將果實剪碎，稱取2.50 g 的佛手柑樣品并裝入15 mL 頂空瓶中，加入40 μL、內(nèi)標物濃度為100 mg/L 的2-辛醇溶液，將頂空瓶置于60 ℃恒溫水浴鍋中平衡20 min。將老化好的萃取頭插入頂空瓶瓶口的三分之一處，60 ℃下頂空吸附萃取30 min，待完成萃取后拔出，準備進樣到氣相色譜儀的進樣口中。

1.3.2 GC-MS 參數(shù)條件

色譜條件：手動進樣，不分流模式，極性DB-WAX柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；溶劑延遲5 min；進樣口的溫度250 ℃，起始溫度40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 升至100 ℃保持0.5 min，再以5 ℃/min 升至230 ℃，保持20 min；載氣為氦氣，載氣流量1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：運行時間60 min；全掃描模式；電子轟擊電離源（electron impact ion source，EI），電子能量70 eV；MS 離子源溫度為230 ℃（最大值250 ℃），四級桿溫度150 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z50～500 amu；閾值50。

1.3.3 GC-O 檢測方法

氣相色譜-嗅聞系統(tǒng)由GC（配氫火焰離子檢測器FID）和ODP3 嗅辨儀組成。色譜條件及升溫程序同GC-MS，嗅聞采用香氣強度法進行檢測，此方法基于氣味強度的估測[9]，同時還能驗證揮發(fā)性香氣物質(zhì)的相對含量大小[10]。當嗅聞員靠近吸嗅裝置嗅聞時，還需記錄下氣味強度以及該組分的香氣特征描述。氣味強度值越大，就表明該組分對香氣整體的貢獻程度越大，可以初步判斷為特征香氣成分。氣味強度采用五級氣味強度表示法來評定，見表1[11]。

表1 五級氣味強度表示法Table 1 Descriptions of the five-level odor intensities

1.4 揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量分析

1.4.1 定性分析

揮發(fā)性物質(zhì)組分的定性以質(zhì)譜標準譜庫、保留指數(shù)（retention index，RI）的定性為主，通過檢索NIST 標準譜庫（NIST Chemistry WebBook，SRD 69）輸入物質(zhì)組分的CAS 號，找到與實驗所用的極性毛細管柱型號相同的一欄記錄查找得到的保留指數(shù)，再通過計算得到RIs 與查找值進行對比，誤差小于50 即可保留，表示對揮發(fā)性組分進行定性確認。未知化合物的RIs 借助C7～C40的正構(gòu)烷烴在相同的GC-MS 參數(shù)條件下測定得到的保留時間計算得到，計算公式見式（1）[7]。

式中，RTX為揮發(fā)性物質(zhì)組分的保留時間，min；RTZ為與揮發(fā)性組分具有相同碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴的保留時間，min；Z為某一正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；經(jīng)色譜柱分析，組分X的峰正好在正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)Z和Z+1 之間。

1.4.2 定量分析

采用內(nèi)標法進行簡單定量，內(nèi)標物選用濃度為100 mg/L 的2-辛醇溶液，求得每一種揮發(fā)性香氣物質(zhì)組分的相對含量Wi后，通過檢索風味閾值[12]，查找每一揮發(fā)性物質(zhì)在水中的察覺閾值，以求得各揮發(fā)性香氣物質(zhì)組分的香氣活力值OAV，OAV＞1 的物質(zhì)可判斷為主要香氣物質(zhì)。計算公式見式（2）（3）。

式中，Wi為待測揮發(fā)性組分的質(zhì)量濃度，μg/L；Cs 為內(nèi)標物的濃度，μg/L；Vs 為內(nèi)標物加入的體積，μL；m為稱取的佛手柑樣品質(zhì)量，g；APi 為揮發(fā)性組分的峰面積；APs 為內(nèi)標物的峰面積。

式中，Wi為計算出的質(zhì)量濃度，μg/L；DT為揮發(fā)性組分在水中的察覺閾值，μg/L。

1.4.3 QDA 感官評價

定量描述法是評估員通過建立感官描述詞以及對各項感官特性的強度大小進行打分評價的一種檢驗方法，可單獨或結(jié)合用于樣品外觀、香氣、口味等評定[13]。本實驗以GC-O 的嗅聞結(jié)果作為參考來建立感官特性描述詞，2 位評估員來自上海應用技術(shù)大學香料香精化妝品學部，根據(jù)感官評分表2[14]進行打分，通過評分結(jié)果繪制得到類似蜘蛛網(wǎng)的香氣輪廓圖，以此直觀地看出‘陽光’佛手柑的香韻組成特點，從而驗證‘陽光’佛手柑的特征香氣成分[14]。

表2 感官評分表Table 2 sensory evaluation score scale

1.5 數(shù)據(jù)處理

氣相色譜質(zhì)譜的分析采用Nist11 數(shù)據(jù)庫。使用WPS Excel 2017 進行數(shù)據(jù)處理，計算RI 值并與Nist11 數(shù)據(jù)庫中的RI 查找值進行匹配，計算各香氣成分的相對含量、OAV 值大小。以OAV 值為基礎，通過Excel 2017 進行雷達圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘陽光’佛手柑香氣成分分析

采用HS-SPME 技術(shù)富集提取‘陽光’佛手柑中的揮發(fā)性香氣成分，經(jīng)GC-MS 分析與分離，共檢測得到167種揮發(fā)性物質(zhì)組分。如表3 所示，共發(fā)現(xiàn)34 種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中萜烯類化合物19 種，相對含量占比90.49%；醛類化合物5 種，相對含量占比4.15%；芳香族化合物4 種，相對含量占比2.95%；醇類化合物5 種，相對含量占比2.32%；酮類化合物僅有1 種，且相對含量占比較少，未超過1%。這些香氣物質(zhì)組分大多數(shù)都是碳原子數(shù)為10 或15 的萜烯類化合物以及分子結(jié)構(gòu)簡單的含氧類化合物，共同構(gòu)成了‘陽光’佛手柑的香氣。

香氣成分的種類和含量是決定果實香氣或風味口感的關鍵因素，研究金華佛手柑的香氣物質(zhì)成分可提高佛手柑品質(zhì)和培育優(yōu)質(zhì)品種[15]，為金華佛手柑香氣的組成提供理論依據(jù)和參考。果實的香氣來自被分離出的各揮發(fā)性組分，但并不是分離得到的組分含量較大就是香氣組成中的關鍵成分，只有香氣活力值較大的物質(zhì)組分才能對香氣的整體貢獻度有一定影響，即被認定為是特征香氣成分或關鍵致香成分。

2.1.1 萜烯類化合物

由表3 可知，‘陽光’佛手柑中共檢測得到19 種萜烯類化合物，其相對含量之和占總香氣成分含量的90.49%，是‘陽光’佛手柑香氣組成中較為重要的一類物質(zhì)組分。其中相對含量最高的是D-檸檬烯（42.92%），其次是γ-松油烯（34.19%）、β-羅勒烯（3.78%）、異松油烯（2.94%）、月桂烯（1.83%）、β-石竹烯（1.52%）、β-甜沒藥烯（1.41%）以及總占比小于1%的水芹烯、α-蒎烯和3-蒈烯等。這些萜烯類物質(zhì)主要的分子式為C10H16的單萜烯類化合物和C15H24的倍半萜烯β-石竹烯、β-甜沒藥烯、β-金合歡烯。D-檸檬烯具有令人愉快的、新鮮檸檬果香，是柑橘類水果中主要香氣物質(zhì)組分，它的相對含量在‘陽光’佛手柑樣品中占比最高，對佛手柑的整體香氣有著重要貢獻，γ-松油烯通常與α-松油烯組成混合物共同存在，具有柑橘檸檬的香氣以及草本植物的青香，是所有香氣組分中含量較高的一個揮發(fā)性物質(zhì)。D-檸檬烯與γ-松油烯的相對含量占比較高，這一結(jié)果與其他學者的研究相符[3-6]，通常D-檸檬烯在柑橘類植物果實中含量在50%～60%[16]，而本試驗中其相對含量低于50%，這可能與佛手柑的保存時間較長、儲藏溫度較低有關。具有草青香的β-羅勒烯、柑橘果香和松木樣青香的異松油烯，具有淡弱的香膏香脂氣息的月桂烯以及辛甜暖甜的β-石竹烯這些成分的百分含量占比結(jié)果與Wu 等[17]、Singh 等[18]等基本相符?？梢娸^多的萜烯類組分都具有柑橘檸檬樣的果香、甜花香以及草本、松木樣的青香香氣，一些辛香、脂香氣多起修飾作用。

表3 ‘陽光’佛手柑香氣成分以及相對含量Table 3 Aroma components and relative contents of ‘Sunshine’ finger citron

2.1.2 醛類化合物

檢測到的醛類香氣化合物占檢出香氣組分總量的4.15%，分別為檸檬醛（2.34%）、(Z)-檸檬醛（1.34%）以及相對含量小于1%的香茅醛、正壬醛、枯茗醛。兩種檸檬醛通常以混合體的形式共同存在，具有強烈的、似檸檬水果糖的檸檬果香。檸檬醛在一些檸檬樣香氣的天然精油中含量大于70%，是柑橘類香氣組成中的重要成分之一。香茅醛和正壬醛的香氣都是偏向花香香韻的果香，香茅醛具有香茅和玫瑰花香和柑橘檸檬樣果香，而正壬醛C9醛有點脂肪感和皂感香氣，稀釋后有柑橘果香和偏向花朵葉子的青香，C8～C10的直鏈結(jié)構(gòu)是脂肪醛化合物中的代表原料，Xu 等[19]比較了來自四種產(chǎn)地的佛手柑香氣成分差異，發(fā)現(xiàn)正壬醛僅在浙江產(chǎn)地的金佛手中檢測到，這也為浙江金佛手具有偏青香、接近柑橘皮的特征香氣提供依據(jù)?？蒈镃10的脂肪醛，醛香較強并帶有枯茗的特征草青香，雖然含量較小，但可以和草青香氣的萜烯類化合物共同協(xié)調(diào)。

2.1.3 醇類化合物

檢測到的醇類化合物占檢出香氣組分總量的2.32%，分別為α-松油醇（1.02%），以及相對含量在0.25%～0.36%之間的4-松油醇、桉葉油醇、橙花醇和香葉醇，這些醇類化合物的分子式均為C10H18O。α-松油醇與4-松油醇是一對同分異構(gòu)體，都具有似松節(jié)油的油脂氣和松木樣青香，羥基位置的不同使α-松油醇帶有似丁香花的花香，而4-松油烯醇則帶有木香、胡椒樣的辛香以及壤香。橙花醇和香葉醇也是一對Z 型和E 型的異構(gòu)體，都擁有玫瑰花的蜜甜花香，但橙花醇的香氣更加溫和柔美，帶有清新的柑橘、檸檬樣香氣。醇類化合物組分雖然相對含量不高，它們具有的松木青香、玫瑰花香和辛香卻能同萜烯類化合物具有的對應香氣，從而在香氣上很好地融合，豐富和增強整體香氣。其余醇類化合物使佛手柑的整體香氣富有松木和草本植物青香。

2.1.4 芳香族化合物

4-異丙烯基甲苯、苯酚、苯甲酸、對傘花烴為檢測到的芳香族化合物，總含量達2.95%，苯酚香氣不強烈，且苯甲酸多是無味或稍帶脂香，它們對‘陽光’佛手柑的香氣貢獻較少。含量占比大于1%的4-異丙烯基甲苯具有柑橘果香和類似愈創(chuàng)木酚的暖辛香，而對傘花烴具有新鮮的柑橘檸檬樣果香，因其分子結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)，別名為4-異丙基甲苯，因此既可當作單萜烯類化合物也可視為芳香族化合物。對傘花烴一般由D-檸檬烯轉(zhuǎn)變而來，常在柑橘類精油的香氣組分中出現(xiàn)，檸檬烯的結(jié)構(gòu)不如有苯環(huán)穩(wěn)定，易受空氣的氧化而變構(gòu)，最終形成對傘花烴。

2.1.5 酮類化合物

酮類化合物僅有相對含量值為0.93 μg/L 的β-紫羅蘭酮，相對含量占總含量的0.07%，它擁有紫羅蘭的花香以及甜香，β位的取代基同α位相比，使紫羅蘭花香中帶點木香，β-紫羅蘭酮雖然含量較少，但可能會與香葉醇、香茅醛、橙花醇這些帶有花香的成分起協(xié)同作用，使花香香氣更加醇甜。

2.2 ‘陽光’佛手柑特征香氣成分的確定

通過查詢各揮發(fā)性組分的香氣描述[20]，初步推測‘陽光’佛手柑的香氣特征主要有以下幾類：柑橘果香、玫瑰花香、松木青香、淡脂香。為明確關鍵香氣成分，結(jié)合OAV 法分析（表4）。GC-O 嗅聞所用的香氣強度法分析一共發(fā)現(xiàn)18 種物質(zhì)，其余揮發(fā)性組分氣味強度值為0，表示未聞到任何氣味。

由表4 可知，氣味強度值最大的香氣組分為D-檸檬烯和檸檬醛、香葉醇（強度值為4，表示能感受到強烈的氣味），且它們的香氣活力值分別為3 045、1 189、3 652；其次較大的組分有強度值為3 的月桂烯、γ-松油烯、β-羅勒烯以及對傘花烴，香氣活力值分別為21 679、485、1 877、5 159；強度值為2 的香氣組分較多，這些物質(zhì)組分的嗅覺特征不太明顯，如水芹烯與β-石竹烯，都是能感受到一點辛甜和通鼻的氣息，無法很好地區(qū)別開來，強度值為1 的香氣組分嗅覺感覺是稍微能感覺到香氣，如α-蒎烯和α-松油醇，都帶有似松節(jié)油的木青氣和較重的油脂氣，又如橙花醇和β-紫羅蘭酮，都具有甜蜜的花香，因此只感覺熟悉卻又無法確定是哪種香氣化合物，氣味強度值用1 表示能稍微感覺到香氣。

表4 ‘陽光’佛手柑GC-O 嗅聞結(jié)果與OAVTable 4 The sniffering result of ‘Sunshine’ finger citron and OAV

結(jié)合各揮發(fā)性香氣組分的氣味強度值和香氣活力值大小，發(fā)現(xiàn)月桂烯、檸檬醛、γ-松油烯、β-石竹烯與β-羅勒烯等物質(zhì)的氣味強度值與香氣活力值不成正比，并不是香氣活力值越大其氣味強度就越大，這體現(xiàn)了嗅聞檢測時嗅聞員對香氣感受的偏差、檢測方法的局限性以及樣品新鮮程度的影響。因此，‘陽光’佛手柑特征的香氣成分仍主要依靠香氣活力值的大小來判斷，主要為D-檸檬烯、檸檬醛、香葉醇、月桂烯、γ-松油烯、β-羅勒烯和對傘花烴，使‘陽光’佛手柑的整體香氣富有柑橘檸檬樣果香、甜蜜花香、木青氣以及淡淡的香脂氣。

2.3 感官評價結(jié)果

2.3.1 感官特性描述

定量描述分析法可以使研究者得到完整的樣品感官描述，更清晰地區(qū)分不同品牌或生產(chǎn)來源的樣品差異。郭明月等[14]采用QDA 法區(qū)分三款上市藍莓果汁飲料的感官特性，感官描述詞圍繞果汁的色澤、氣味和口感對其進行感官評價，最后通過感官強度的評分完成三款果汁的區(qū)分。

本試驗通過嗅聞結(jié)果建立感官特性描述詞，將佛手柑樣品中各揮發(fā)性成分記錄下的香氣特征進行歸類匯總后，最終確定以下6 個特性描述詞：果香、花香、草木香、酸香和脂香，其中草木香又可以再細分為草青和木青香氣，具體如表5 所示。

表5 ‘陽光’佛手柑的感官特性描述詞及其定義Table 5 The lexicon description of sensory evaluation of ‘Sunshine’ finger citron and their definitions

2.3.2 感官特性強度的評定

2 位評價員按照建立好的感官特性描述詞匯將恢復至室溫的冷凍‘陽光’佛手柑果實掰開，并對其香氣進行嗅聞評價，按照感官特性強度大小1～9 進行打分評價（見表6），并結(jié)合評分結(jié)果繪制‘陽光’佛手柑的香氣輪廓圖（見圖1）。

表6 感官特性強度評分結(jié)果Table 6 The score results of sensory characteristic intensity

圖1 ‘陽光’佛手柑的香氣輪廓圖Fig.1 Aroma component profile of ‘Sunshine’ finger citron

由圖1 可以更直接地看出，‘陽光’佛手柑的主要香韻組成，按照每種香韻的強度，由大到小分別是果香、酸香、花香、草木香、脂香和辛香。盡管在表4 中脂香的月桂烯香氣活力值比D-檸檬烯、檸檬醛這些特征柑橘檸檬樣果香的香氣物質(zhì)OAV 數(shù)值還要高10 倍，且以往研究曾提到月桂烯的特征脂香表現(xiàn)為橘皮香氣[21]，以及佛手果皮上的香氣強度比果肉更大[5,7]，但本試驗的感官評價中脂香香韻評分結(jié)果為1，表示幾乎嗅聞不到，這可能是由于僅選擇了嗅覺感受來評價掰開后佛手果實的感官特性強度，靠近橘皮的脂香氣感受極弱。

此外，圖1 結(jié)合表4 發(fā)現(xiàn)，柑橘檸檬樣果香不僅在香氣輪廓圖中得分最高，嗅聞記錄的氣味強度值較大的組分（如檸檬醛、D-檸檬烯、香葉醇、對傘花烴和β-羅勒烯）也均有似檸檬的果香，可見嗅聞強度值較大的物質(zhì)對整體香氣的貢獻程度也較大[8]。還有一點值得注意的是，將表4 和表6 結(jié)合比較后發(fā)現(xiàn)，評分較高的果香香韻所對應的香氣成分它們的OAV 值均大于1 000，這也驗證了OAV 值越大，對香氣的貢獻程度就越高[7]。

3 結(jié)論

采用HS-SPME 與GC-MS-O 聯(lián)用技術(shù)對‘陽光’佛手柑的揮發(fā)性組分進行分離與鑒定，共鑒定出34 種香氣成分，其中占比最高的是萜烯類化合物19 種，相對含量總和為90.49%，其次是醛類和醇類。根據(jù)QDA 建立嗅覺上的感官特性描述詞，各香韻的相對強度由大到小依次是果香、酸香、花香、草木香、脂香和辛香，進一步驗證了‘陽光’佛手柑的特征香氣成分為D-檸檬烯、檸檬醛、香葉醇、對傘花烴、γ-松油烯、β-羅勒烯以及月桂烯，使‘陽光’佛手柑的整體香氣富有柑橘檸檬果香、甜蜜花香、草木青香和淡淡脂香香氣。

以往的研究中指出，當香氣組分的香氣活力值大于1 時，就可能對果實、飲料及其他食品整體香氣的貢獻程度和影響較大[22]，但香氣活力值小于1 的物質(zhì)組分不代表就沒有作用，可能因為其相對含量的較高而對香氣起到修飾和調(diào)和作用。由此可見，數(shù)據(jù)結(jié)果中香氣活力值大于100 甚至大于1000 的組分對佛手柑香氣的影響之大。

隨著越來越多的研究者開始對風味物質(zhì)的香氣成分進行分析與研究，GC-MS-O 的方法得到了更廣泛的運用，尤其是食品與飲料行業(yè)。GC-O 同GC-MS 相比，可以將分離得到的組分通過嗅聞檢測方法來確定單個組分對整體香氣的貢獻程度，如今在食品風味的分析方面受到更大的重視[10]，運用感官評定的方法能對關鍵香氣成分進行更好的判斷，在今后的研究中感官評定可以從色、香、味多角度出發(fā)，使感官評定更加全面準確。