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    新疆8種薔薇果中可溶性糖組分含量的特征分析

    2023-02-07 07:00:10王寧周鋼張珊滋王春燕田莉
    食品研究與開發(fā) 2023年3期
    關(guān)鍵詞:單糖薔薇葡萄糖

    王寧,周鋼,張珊滋,王春燕,田莉,3*

    (1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院,新疆 烏魯木齊 830011;3.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830011)

    全世界有200多種薔薇,其中有多種薔薇的果實(shí)可供藥食兩用,其富含氨基酸、總多酚、總有機(jī)酸和糖類等成分[1-2],具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗癌和抗菌等方面的藥理活性[3];在阿拉斯加、匈牙利和土耳其等地,一些口感獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富的薔薇果也被制成果醬,深受兒童喜愛[4]。新疆地處亞歐腹地,獨(dú)特的氣候和地理?xiàng)l件為薔薇提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境[5],新疆薔薇果果型大、肉厚、味甘甜、營(yíng)養(yǎng)豐富,在食品、藥品開發(fā)方面具有巨大潛力[1-2]。植物多糖是植物體內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的生物大分子,主要由葡萄糖、果糖、半乳糖等單糖以一定的比例聚合而成,相對(duì)分子質(zhì)量從幾萬(wàn)到幾百萬(wàn)不等?,F(xiàn)代藥理研究表明,植物多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗輻射等多種藥理作用[6-7],目前,關(guān)于新疆薔薇果中總多糖和單糖的研究鮮見報(bào)道。

    多糖主要采用滴定法和紫外分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-Vis)[8-9]等方法檢測(cè)。滴定法操作簡(jiǎn)單、成本低,但試驗(yàn)條件要求較高且滴定終點(diǎn)不易判別;UV-Vis法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,目前被廣泛應(yīng)用。單糖目前最常用的檢測(cè)方法是高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[10],糖類物質(zhì)經(jīng)衍生化后可連接在紫外可見吸收檢測(cè)器中(ultraviolet-visible detector,UVD)進(jìn)行測(cè)定,但衍生化操作步驟繁瑣且準(zhǔn)確性較低;蒸發(fā)光檢測(cè)器(evaporativelight scattering detector,ELSD)[11]可直接檢測(cè)糖類物質(zhì),但靈敏度、重復(fù)性和精密度較差;示差折光檢測(cè)器(differential refractive index detector,RID)[12]檢測(cè)糖類物質(zhì)具有靈敏度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。因此本試驗(yàn)采用UV-Vis和HPLC-RID測(cè)定新疆8種薔薇果中的總多糖和4種單糖的含量,并采用主成分分析(principal component analysis,PCA)和聚類分析(cluster analysis,CA)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[13],為后續(xù)研發(fā)品種的篩選及質(zhì)量控制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    8種不同品種的完全成熟的新疆薔薇果(表皮為深紅色、萼片干枯)于2020年9月采自新疆烏魯木齊市雅瑪里克山和阿勒泰地區(qū)海拔的山地或灌叢,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)徐海燕教授鑒定為薔薇科薔薇的果實(shí),編號(hào)為 S1~S8,見表 1。

    表1 樣品編號(hào)及采集地點(diǎn)Table 1 Sample number and collection location

    葡萄糖(純度大于99.8%)、果糖(純度大于99.9%)、蔗糖(純度大于98.8%):中國(guó)食品藥品檢定研究院;麥芽糖(純度大于94.4%):廣州碩譜生物科技有限公司;乙腈(色譜純):美國(guó)Honeywell公司;苯酚、硫酸(分析純):天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-20A島津液相色譜儀、RID-10A檢測(cè)器:日本島津公司;722S可見分光光度計(jì):上海菁華科技儀器有限公司;SL-200高速多功能粉碎機(jī):浙江省永康市松青五金廠;XS105電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司;KQ-5200DE數(shù)控超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;TDL-5A離心機(jī):上海菲恰爾分析儀器有限公司;Milli-Q純水機(jī):美國(guó)Millipore公司。

    1.3 方法

    1.3.1 總多糖含量的測(cè)定

    1.3.1.1 供試品提取方法篩選

    精密稱量S3號(hào)干燥樣品粉末(80目)2.000 0 g,平行9份,平均分3組,均加入500 mL蒸餾水,分別采用浸漬24 h、超聲45 min、煎煮45 min三種方法提取總多糖,采用UV-Vis法測(cè)定總多糖含量。

    1.3.1.2 供試品溶液的制備

    分別精密稱取8種新疆薔薇果粉末(80目)2.0000g,按照1.3.1.1所得最佳方法進(jìn)行提取,抽濾,濾液作為供試品溶液,備用。

    1.3.1.3 總多糖顯色條件考察

    以薔薇果中的總多糖作為考察指標(biāo),單因素考察5%苯酚用量 0.6、0.8、1.0、1.2 mL,其它條件為濃硫酸3 mL、50 ℃ 加熱 20 min;濃硫酸用量 3、5、7 mL,其它條件為5%苯酚用量1.0 mL、50℃加熱20 min;加熱溫度 40、50、60、80℃,其它條件為 5%苯酚用量 1.0 mL、濃硫酸 5 mL、加熱 20 min;加熱時(shí)間 10、20、30、40 min,其它條件為5%苯酚用量1.0 mL、濃硫酸5 mL、加熱溫度50℃。

    1.3.1.4 總多糖線性關(guān)系考察

    精密稱取葡萄糖對(duì)照品適量,制備濃度為5.138μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密移取 0、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80、3.20、3.60 mL,加入 2 mL 蒸餾水,按照最佳顯色條件在490 nm處測(cè)定吸光度[14]。以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.1.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察

    將方法“1.3.1.4”的葡萄糖對(duì)照品溶液的吸光度重復(fù)測(cè)定6次,記錄并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)值,考察儀器精密度。

    取S3樣品粉末按照“1.3.1.2”方法,平行制備6份供試品溶液,按“1.3.1.3”方法,測(cè)定吸光度,計(jì)算RSD值,考察重復(fù)性。

    取方法“1.3.1.4”中對(duì)照品溶液,25℃放置,在0、2、4、8、12、24 h 分別測(cè)定吸光度,計(jì)算 RSD 值,考察樣品的穩(wěn)定性。

    1.3.1.6 加樣回收率試驗(yàn)

    精密稱量已知總多糖含量的S3樣品粉末2.0000g,平行9份,按照樣品含量的80%、100%和120%加入葡萄糖對(duì)照品,每組平行3份,按照“1.3.1.2”方法制備供試品溶液,根據(jù)方法“1.3.1.4”中的條件測(cè)定,計(jì)算回收率,考察該方法的準(zhǔn)確度。

    1.3.1.7 新疆薔薇果樣品中總多糖含量測(cè)定

    精密移取“1.3.1.2”方法中的供試品液各0.1 mL,按照方法“1.3.1.4”的條件測(cè)定樣品中總多糖含量。

    1.3.2 新疆薔薇果單糖組分分析

    1.3.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

    精密稱取適量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)照品,分別置于10 mL容量瓶,用40%乙腈溶解配制質(zhì)量濃度分別為 50.28、40.12、20.45、20.98 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

    1.3.2.2 供試品溶液制備

    取方法“1.3.1.2”中的供試品溶液125 mL,水浴蒸干,用5 mL 40%乙腈復(fù)溶,0.45 μm濾膜過(guò)濾,濾液為單糖組分供試品溶液。

    1.3.2.3 色譜條件

    色譜柱CAPCELLPKANH2(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-水,在此基礎(chǔ)上考察流動(dòng)相的比例;流速:1.0 mL/min,柱溫:40℃,檢測(cè)池溫度 40℃,進(jìn)樣15 μL。

    1.3.2.4 線性關(guān)系考察

    分別精密量取“1.3.2.1”方法中的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液,梯度稀釋制備系列濃度各單一對(duì)照品溶液,按方法“1.3.2.3”的條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.3.2.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察

    取“1.3.2.4”方法中的對(duì)照品溶液,按“1.3.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算RSD值,考察儀器的精密度。

    取S3樣品粉末按照方法“1.3.2.2”制備供試品溶液,平行6份,然后按“1.3.2.3”方法測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算RSD值,考察重復(fù)性。

    取方法“1.3.2.4”中的對(duì)照品溶液,25℃放置 0、4、8、12、24、48 h,再按照方法“1.3.2.3”條件進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算RSD值,考察4種單糖的穩(wěn)定性。

    1.3.2.6 加樣回收率

    精密稱量已知含量的S3樣品粉末2.000 0 g,平行6份,按已知含量100%加入果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對(duì)照品,按照方法“1.3.2.2”制備供試品溶液,再按方法“1.3.2.3”的條件測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算各成分的加樣回收率,考察該方法的準(zhǔn)確度。

    1.3.2.7 薔薇果中單糖組分的含量測(cè)定

    將方法“1.3.2.2”中的樣品溶液按照方法“1.3.2.3”進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算各樣品中單糖組分的含量。

    1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

    以薔薇果中總多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的含量為變量,利用Origin 2018軟件對(duì)樣品中的5種成分進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)及聚類分析(cluster analysis,CA)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總多糖提取方法的確定

    總多糖含量結(jié)果:煎煮法總多糖含量為263.48mg/g、超聲法總多糖含量為187.52 mg/g、浸漬法總多糖含量為126.79 mg/g。因此,確定煎煮法為供試品提取方法。

    2.2 總多糖測(cè)定方法的確定

    表2為總多糖測(cè)定方法的單因素考察結(jié)果。

    表2 單因素考察結(jié)果(n=3)Table 2 Results of the single factor examination(n=3)

    由表2可知,以1.0 mL 5%苯酚溶液,5 mL濃硫酸,50℃加熱30min為顯色條件,放至25℃后進(jìn)行測(cè)定,此時(shí)S3樣品最為穩(wěn)定且總多糖含量最高,為263.48mg/g,因此,以此條件為最佳。

    2.3 總多糖含量測(cè)定方法學(xué)考察

    葡萄糖的線性方程為A=26.152C+0.013 4(r=0.999 2),表明葡萄糖含量在 7.65 μg/mL~22.67 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。精密度考察的RSD值為0.96%。表明該儀器精密度良好。重復(fù)性考察的RSD值為0.67%,表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性考察的RSD值為0.91%,表明總多糖在24 h內(nèi)穩(wěn)定。對(duì)樣品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定試驗(yàn),結(jié)果見表3。

    表3 加樣回收率結(jié)果(n=9)Table 3 Results of sample adding recovery(n=9)

    如表3所示,平均加樣回收率為99.87%,RSD值為1.20%,表明本法測(cè)定總多糖含量準(zhǔn)確。

    2.4 單糖組分含量測(cè)定方法學(xué)考察

    2.4.1 專屬性與線性考察

    依據(jù)《中國(guó)藥典》[15],考察流動(dòng)相的比例對(duì)薔薇果中4種單糖成分色譜行為的影響,HPLC-RID色譜分析圖如圖1所示。

    圖1 對(duì)照品和樣品溶液的HPLC-RID色譜分析圖Fig.1 HPLC-RID chromatograms of standard and sample solution

    由圖1A可知,當(dāng)乙腈與水體積比為80∶20時(shí),4種單糖成分的出峰時(shí)間在15 min以內(nèi),果糖和葡萄糖的分離度小于1.5;由圖1B可知,當(dāng)乙腈與水的體積比為70∶30時(shí),待測(cè)物質(zhì)對(duì)稱因子為1.45且麥芽糖無(wú)檢測(cè)峰;乙腈與水的體積比為75∶25時(shí),4種單糖成分的分離度大于1.5,對(duì)稱因子為1.02,理論塔板為3 320,適用于4中單糖類成分檢測(cè)。

    2.4.2 線性考察

    4種單糖成分的線性考察結(jié)果見表4。

    表4 4種單糖回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 4 Regression equations,linear ranges and correlation coefficients of four monosaccharides

    如表4所示,果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖分別在質(zhì)量濃度 5.01 mg/mL~35.09 mg/mL、4.04 mg/mL~28.28 mg/mL、0.25 mg/mL~8.06 mg/mL、0.24 mg/mL~7.73 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r≥0.999 6。

    2.4.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率試驗(yàn)

    果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的精密度考察RSD分別為0.27%、0.25%、0.69%、0.94%,表明儀器精密度良好;重復(fù)性考察的RSD分別為2.17%、2.38%、1.95%、2.72%,表明方法的重復(fù)性良好;穩(wěn)定性考察的RSD分別為2.36%、1.51%、2.41%、2.55%,表明4種單糖在48 h內(nèi)穩(wěn)定;4種單糖成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5。

    表5 4種單糖成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides(n=6)

    續(xù)表5 4種單糖成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Continue table 5 Results of the spiked recovery test for the 4 monosaccharides(n=6)

    由表5可知,平均加樣回收率分別為99.51%、99.24%、100.46%和 102.32%,RSD值分別為1.25%、0.66%、1.21%和2.43%,表明本法測(cè)定4種單糖含量準(zhǔn)確。

    2.5 含量測(cè)定

    新疆8種薔薇果中總多糖含量及4種單糖組分含量結(jié)果見表6。

    表6 新疆8種薔薇果樣品中總多糖和4種單糖組分的含量Table 6 Content of total polysaccharides and four sugars in 8 Xinjiang Rosa fruits samples

    表6結(jié)果顯示,總多糖和4種單糖組分的含量差異較大,含量分布范圍較廣。其中S4號(hào)樣品總多糖含量最高,S3號(hào)樣品果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖含量最高。

    2.6 主成分分析

    主成分分析(PCA)運(yùn)用降維的思維,通過(guò)提取對(duì)應(yīng)特征值大于1的成分,排除重疊信息,減少變量,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分類[16-17]。本文以新疆8種薔薇果中總多糖、果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖5種成分為變量進(jìn)行PCA分析,結(jié)果如表7所示。

    表7 主成分分析方差貢獻(xiàn)率Table 7 Principal component analysis variance contribution rate

    表7結(jié)果表明,提取獲得的主成分為總多糖和果糖,累計(jì)的方差貢獻(xiàn)率為87.85%,前2個(gè)主成分因子的特征值分別為3.38和1.02,表明這2個(gè)主成分可以代表8種藥材中5個(gè)成分87.85%的信息。

    旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣可以表示主成分與其對(duì)應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)[18-19],結(jié)果見表8。

    表8 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣Table 8 Rotated component matrixa

    采用得到的2個(gè)主成分對(duì)8種不同薔薇果進(jìn)行評(píng)分,計(jì)算2個(gè)主成分的單獨(dú)得分,表達(dá)式如下。

    Y1=-0.070X1+0.159X2+0.177X3+0.172X4+0.084X5

    Y2=0.903X1+0.033X2-0.139X3-0.134X4+0.281X5

    以2個(gè)主成分所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重,獲得綜合評(píng)價(jià)函數(shù)為Y=67.511%Y1+20.334%Y2,計(jì)算樣品的綜合得分并進(jìn)行排序,結(jié)果見表9,樣品S3質(zhì)量最好。

    表9 8種薔薇果樣品的主成分因子得分、綜合得分和排序Table 9 Factor scores,comprehensive scores and sorting of principal components of 8 Rosa of fruits kinds of samples

    2.7 聚類分析

    聚類分析(CA)是一個(gè)“物以類聚”的分類過(guò)程,通過(guò)計(jì)算樣品間的歐氏距離,根據(jù)樣品間的相似性進(jìn)行分組[20]。本研究以新疆8種薔薇果中5種成分的含量為變量,以樣品間的歐式距離為區(qū)間分析樣品之間的異同[21]。聚類分析樹狀圖如圖2所示。

    圖2 薔薇果的聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram for clustering analysis of the Rosa of fruits

    由圖2可知,在樹狀圖的距離75處為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸類,可將樣品分成 3 類,S5、S7 和 S8 歸為一類,S1、S2、S4、S6歸為一類,S3歸為一類。此分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)采用UV-Vis和HPLC-RID分析測(cè)定新疆地區(qū)8種薔薇果中總多糖和4種單糖成分的含量,考察不同提取方法以及總多糖和4種單糖組分測(cè)定方法的提取效率,所建立的方法經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的方法學(xué)考察,操作簡(jiǎn)單、精密度好、靈敏度高,適用于果實(shí)類中糖的檢測(cè)。8種薔薇果中波斯單葉薔薇(S3)的綜合評(píng)分最高,其次為寬刺薔薇(S2)、密刺薔薇(S5)和疏花薔薇(S6),研究結(jié)果可為新疆薔薇果的開發(fā)及綜合利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

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