復(fù)合酶法提取對(duì)黑果腺肋花楸不溶性膳食纖維結(jié)構(gòu)及功能特性的影響

秦續(xù)緣，程志強(qiáng)，于寒松

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118）

黑果腺肋花楸原產(chǎn)于北美，因其營養(yǎng)價(jià)值高而備受關(guān)注。20世紀(jì)90年代，我國引入黑果腺肋花楸，并相繼在遼寧、吉林、黑龍江等省市發(fā)展種植。王鵬等[1]研究表明，黑果腺肋花楸的果實(shí)富含還原糖、有機(jī)酸、花青素、黃酮和維生素等營養(yǎng)成分，而且黑果腺肋花楸還可用于釀造果酒、釀制保健醋、生產(chǎn)固體果茶。隨著人們對(duì)黑果腺肋花楸果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值認(rèn)識(shí)的提高，其加工產(chǎn)品也有了較好的發(fā)展前景。由于黑果腺肋花楸被大量開發(fā)和使用，產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物——黑果腺肋花楸果渣，而這些果渣不宜儲(chǔ)存和運(yùn)輸，大部分被丟棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，黑果腺肋花楸果渣中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如膳食纖維、花青素、蛋白質(zhì)、黃酮醇、多酚類化合物等[2]。因此，對(duì)黑果腺肋花楸果渣的有效利用不僅可以減輕對(duì)環(huán)境的影響，還可以提高黑果腺肋花楸副產(chǎn)物的附加值。

國際食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC）將纖維定義為具有超過10個(gè)單體單元的聚合物，并且其不會(huì)被人體小腸中的消化酶分解。膳食纖維（dietary fiber，DF）是指從植物細(xì)胞壁中提取的一系列非消化性營養(yǎng)物質(zhì)，它們?cè)谌梭w小腸中不易被消化和吸收，在大腸中能完全或部分發(fā)酵，主要有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠、樹膠、低聚糖和其他多糖。根據(jù)其在水中的溶解性，膳食纖維通常分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[3]。IDF 能使食物快速在消化系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)增加糞便體積，有益于便秘人群[4]。流行病學(xué)研究表明，高膳食纖維攝入量可以降低某些疾?。ㄈ缧难芗膊?、結(jié)腸癌和直腸癌）的發(fā)病率。糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、乳腺癌、憩室炎、痔瘡等多種疾病以及肥胖也均與纖維攝入量密切相關(guān)[5]。

目前，復(fù)合酶法、化學(xué)法、酶化學(xué)法、超聲輔助法和微波輔助法提取IDF的途徑多種多樣，不同的加工條件可能會(huì)改變IDF的成分和結(jié)構(gòu)特征，從而影響IDF的功能和理化活性[6]。IDF的生理功能取決于其纖維基質(zhì)結(jié)構(gòu)、理化性能和功能性能以及粒度[7]。本文采用復(fù)合酶法提取黑果腺肋花楸中IDF，并進(jìn)一步比較提取的IDF功能活性和理化活性，以期為黑果腺肋花楸衍生膳食纖維的研究提供思路，為黑果腺肋花楸的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸：采自長(zhǎng)白山；大豆油：市售；淀粉葡萄糖苷酶（100 000 U/g）、中性蛋白酶 60 000 U/g）、高峰α-淀粉酶（40 000 U/g）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 7890）、離心機(jī)（KL04-A）：美國 Agilent公司；破壁機(jī)（XBLL-S01）：中國西貝樂公司；掃描電鏡（SSX-550）、傅里葉紅外光譜儀（model IR Prestige-21）、示差檢測(cè)器（RI-10A）：日本Shimadzu公司；鼓風(fēng)干燥箱（葉拓101系列）：上海葉拓儀器儀表有限公司；酶標(biāo)儀（HBS-1096B）：美國Molecular Devices公司；色差分析儀（CR-5）：美能達(dá)投資有限公司；磁力攪拌器（ZNCL-G）：鄭州予華儀器制造有限公司。

1.3 IDF的提取

1.3.1 黑果腺肋花楸的初步處理

將黑果腺肋花楸去梗，用破壁機(jī)打碎、過濾，分離果渣和果汁，在25℃室溫下，將樣品于95%乙醇中攪拌2 d，以去除游離糖。抽濾后在干燥箱（60℃）中干燥24 h。將干燥樣品進(jìn)行研磨，80目篩篩分，得到黑果腺肋花楸果渣（Aronia melanocarpa pomace，AMP），然后將黑果腺肋花楸果渣保存在干燥器中備用。

1.3.2 復(fù)合酶法提取IDF

IDF 的提取參考 Wang 等[6]、Hua 等[8]的方法，稍作修改。取5 g果渣粉（試樣樣品差＜0.005 g）置于1 000 mL錐形瓶中，加入蒸餾水250 mL。向試樣液中加入0.5 mL高峰α-淀粉酶液，置于95℃恒溫振蕩水浴中持續(xù)振搖35 min，打開鋁箔，用刮勺輕輕地將附著于錐形瓶?jī)?nèi)壁的膠狀物刮下，并用少量水沖洗瓶壁。之后試樣液置于60℃水浴中，加入1.5 mL中性蛋白酶溶解液，蓋鋁箔，持續(xù)振搖30 min，用6 mol/L NaOH或6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.50±0.02，加入2 mL淀粉葡萄糖苷酶酶解，繼續(xù)于60℃水浴中持續(xù)振搖30 min，提取液于5 000 r/min離心15 min，提取的殘余物用蒸餾水漂洗2次并冷凍干燥以獲得IDF。

1.4 膳食纖維微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)

為探究酶對(duì)膳食纖維結(jié)構(gòu)的影響，使用掃描電鏡對(duì)膳食纖維樣品的微觀結(jié)構(gòu)和形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟：樣品臺(tái)用無水乙醇擦洗，之后將樣品覆蓋在導(dǎo)電膠體上，輕輕敲打樣品臺(tái)，使樣品單層鋪于樣品臺(tái)表面，噴金處理后置于掃描電鏡觀察臺(tái)，并在1 000倍和4 000倍的放大倍數(shù)下觀察微觀結(jié)構(gòu)[9]。

1.5 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

取干燥好的樣品粉末，采用溴化鉀壓片法制備樣品，獲得厚約1 mm、直徑約為10 mm的薄片。在4 000 cm-1～400 cm-1對(duì)壓片進(jìn)行掃描，獲得樣品的紅外吸收光譜[10]。

1.6 單糖組成的測(cè)定

采用Dionex ICS-5000+系統(tǒng)，以Carbo PACTM PA20（2.0 mm×150 mm）陰離子交換柱為分析柱，脈沖安培檢測(cè)器為檢測(cè)器，利用梯度洗脫方法進(jìn)行測(cè)定。稱量10 mg樣品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L三氟乙酸10 mL，120℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取酸水解溶液至試管中氮?dú)獯蹈?，加?0 mL水渦旋混勻，吸取100 μL酸水解溶液加入900 μL去離子水，12 000 r/min離心5 min。將上清液進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.7 功能性質(zhì)的測(cè)定

1.7.1 持水性（water holding capacity，WHC）的測(cè)定

根據(jù)Yu等[11]的方法進(jìn)行持水性的測(cè)定。將1.0 g IDF樣品加入至25 mL蒸餾水中，靜置24 h。5 000 r/min離心10 min，立即倒掉上清液，提取殘留物，并測(cè)量其質(zhì)量。持水性的計(jì)算公式如下。

WHC/（g/g）=（W2-W1）/W1

式中：W1為 IDF 樣品質(zhì)量，g；W2為殘留物質(zhì)量，g。

1.7.2 持油性（oil holding capacity，OHC）的測(cè)定

在室溫（25℃）條件下，將1 g樣品加入至25 mL大豆油中，靜置24 h。5 000 r/min離心10 min后立即倒掉上清液，提取沉淀物，然后立即測(cè)量其質(zhì)量。持油性的計(jì)算公式如下。

OHC/（g/g）=（O2-O1）/O1

式中：O1為 IDF 樣品質(zhì)量，g；O2為殘留物質(zhì)量，g。

1.7.3 水膨脹能力（waterswellingcapacity，WSC）的測(cè)定

參考He等[12]的方法檢測(cè)樣品的水膨脹能力，稍作修改。具體方法：稱取0.5 g樣品，倒入25 mL量筒中，與20 mL蒸餾水充分混合均勻，在室溫（25℃）下靜置24 h。記錄靜置前和靜置后體積，樣品的WSC表示樣品水膨脹后的體積變化，其計(jì)算公式如下。

WSC/（mL/g）=（V1-V）/0.5

式中：V1為靜置后的體積，mL；V為靜置前的體積，mL；0.5 為樣品質(zhì)量，g。

1.7.4 亞硝酸根離子吸附能力（nitrite ion adsorption capacity，NIAC）的測(cè)定

將0.1 g樣品與5 mL 10 μg/mL NaNO2溶液混合，并分別將pH值調(diào)節(jié)至7.0和2.0以模擬小腸和胃環(huán)境。然后將混合溶液在37℃水浴鍋中靜置3 h，4 800 r/min離心10 min，取0.4 mL上清液于試管中。根據(jù)劉靜娜等[13]的方法，進(jìn)行反應(yīng)，之后使用色差儀進(jìn)行測(cè)定。亞硝酸根離子吸附能力的計(jì)算公式如下。

NIAC/（mg/g）=（C1-C2）×0.005/Μ

式中：C1、C2分別為吸附前、后上清液中NaNO2的濃度，mg/L；M 為樣品質(zhì)量，0.1 g；0.005 為 NaNO2溶液的體積，L。

1.7.5 葡萄糖吸附能力（glucose adsorption capacity，GAC）的測(cè)定

參考Wu等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定，稍作修改。具體方法：取1 g樣品加入至100 mL的50、100、150 mmol/L葡萄糖溶液中，然后在37℃水浴鍋中攪拌6 h。將混合物5 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL于離心管中。根據(jù)Wang等[15]的方法，使用二硝基水楊酸鹽顯色試劑測(cè)定上清液中葡萄糖水平來計(jì)算樣品葡萄糖吸附量（GAC），計(jì)算公式如下。

GAC/（mmol/g）=（C3-C4）×0.1/Μ

式中：C3、C4分別為吸附前、后上清液中葡萄糖水平，mmol/L；M 為樣品質(zhì)量，1 g；0.1 為葡萄糖溶液體積，L。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定3次并利用Origin 2018軟件處理數(shù)據(jù)、作圖；采用SPSS 20軟件進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMP和IDF的微觀結(jié)構(gòu)

利用掃描電鏡觀測(cè)復(fù)合酶法提取黑果腺肋花楸不溶性膳食纖維顯微結(jié)構(gòu)。圖1為AMP和IDF的掃描電鏡圖。

圖1 AMP和IDF的電鏡圖Fig.1 Electron micrograph of AMP and IDF

膳食纖維的功能特性和結(jié)構(gòu)特性，主要由其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)決定[14]。由圖1可知，AMP表面較為平整且大顆粒較多，可能是由于蛋白質(zhì)和脂肪含量過高，其與纖維以結(jié)合形式或游離形式存在，并進(jìn)一步聚集成團(tuán)，相比之下IDF的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的變化，結(jié)構(gòu)出現(xiàn)層次，顆粒數(shù)量也有所減少，并且在相同放大倍數(shù)下，粒徑較APM小，這可以解釋IDF比AMP具有更強(qiáng)的持水性、持油性、亞硝酸根離子吸附和葡萄糖的吸附能力[16]。掃描電鏡結(jié)果表明，提取方法可能會(huì)改變黑果腺肋花楸膳食纖維的功能特性。

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖2為傅里葉紅外光譜，可以分析不同官能團(tuán)的光譜特征。

圖2 IDF和AMP的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of IDF and AMP

由圖2可知，IDF和AMP在吸收峰上沒有明顯變化，均在3 400 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)較寬的吸收峰，是典型的纖維素和半纖維素的O-H伸縮振動(dòng)帶，說明分子間存在氫鍵作用力；在2 900 cm-1附近出現(xiàn)的較弱吸收峰，主要為糖類甲基和亞甲基上的C-H基團(tuán)伸縮振動(dòng)吸收峰[17]。IDF在1 652 cm-1的吸收峰可能是苯環(huán)的特征吸收峰，在1 048 cm-1處出現(xiàn)的較強(qiáng)吸收峰，是纖維素和半纖維素中醚鍵（C-O-C）的伸縮振動(dòng)吸收峰[18]，這些區(qū)域的吸收峰均來自IDF的特征吸收峰。IDF的峰形沒有明顯變化，表明提取后主要成分沒有變化，IDF的活性成分在處理過程中沒有被破壞。

2.3 單糖組成分析

IDF的單糖組成如圖3所示。

圖3 IDF的單糖組成Fig.3 Composition of IDF monosaccharides

由圖3可知，IDF含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸7種單糖。其中單糖含量最高的是木糖（45.3%），說明黑果腺肋花楸膳食纖維中含有較多的木聚糖半纖維素，而木糖是無熱量甜味劑，市場(chǎng)上可以將木糖應(yīng)用于無糖食品的開發(fā)，適合肥胖和糖尿病患者食用。阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖的含量也相對(duì)較高。其中阿拉伯糖（低熱量甜味劑）能夠抑制小腸中蔗糖酶活性、延緩血糖升高、降低血清中葡萄糖含量。半乳糖醛酸多數(shù)為甲酯，是果膠酸的組成單位，也是果膠的主要成分，而IDF中的半乳糖醛酸含量較高，也表明復(fù)合酶法可以使部分可溶性膳食纖維轉(zhuǎn)化為不溶性膳食纖維，從而提高不溶性膳食纖維的得率。

2.4 功能性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

2.4.1 持水性、持油性和水膨脹能力測(cè)定結(jié)果

IDF和AMP的持水性、持油性和水膨脹能力結(jié)果如表1所示。

表1 IDF和AMP的持水性、持油性和水膨脹能力Table 1 Water holding capacity，oil holding capacity and water swelling capacity for IDF and AMP

持水性是指受到外力作用時(shí)保持原有水分的能力，膳食纖維的持水性不僅影響滋味、香氣、營養(yǎng)成分、顏色等食用品質(zhì)，而且還直接影響膳食纖維制品的成品率，較低的持水性會(huì)給膳食纖維產(chǎn)品帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。而持水性越高，膳食纖維的生理活性越好。膳食纖維的持水性、持油性與親水部位的化學(xué)性質(zhì)、數(shù)量以及IDF的表面積、密度和結(jié)構(gòu)有關(guān)[19]。由表1可知，IDF的WHC 為（3.59±0.10）g/g，較AMP有所增加，表明復(fù)合酶法提取使AMP的分子形態(tài)發(fā)生改變，暴露出更多極性基團(tuán)等可與水分子結(jié)合的位點(diǎn)，提高了IDF的持水能力，同時(shí)，與IDF的微觀結(jié)構(gòu)也密切相關(guān)。

IDF的持油性在各種食品應(yīng)用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如加工食品的過程中防止脂肪流失；人體食用后其吸附大量脂肪后排出體外。膳食纖維與油脂的結(jié)合能力取決于IDF的表面性質(zhì)和纖維顆粒的疏水性[20]。IDF 的持油性顯著強(qiáng)于 AMP（P＜0.05），持油性分別為（3.28±0.11）g/g和（1.52±0.14）g/g。這可能是由于提取過程中的復(fù)合酶提高了IDF和油脂之間的接觸面積，使其對(duì)油的保持能力增強(qiáng)。

在壓強(qiáng)、溫度保持恒定的情況下，待測(cè)樣品不斷吸水，體積不斷增加即為膨脹性。水膨脹性是衡量膳食纖維功能特性的重要指標(biāo)之一。黑果腺肋花楸IDF具有較高的膨脹能力，可歸因于其纖維密度低，且通過紅外光譜可以看出其支鏈含有極性基團(tuán)和糖醛酸基團(tuán)。由表 1可知，IDF的水膨脹能力為（3.15±0.08）mL/g，顯著高于AMP的水膨脹能力（P＜0.05）。結(jié)果表明，復(fù)合酶法提取可以使黑果腺肋花楸的功能特性增加，而這些功能特性在食品中有良好的應(yīng)用前景。

2.4.2 亞硝酸根離子吸附能力測(cè)定結(jié)果

IDF和AMP的亞硝酸根離子吸附能力如圖4所示。

圖4 IDF和AMP的亞硝酸根離子吸附能力Fig.4 Nitrite ion adsorption capacity of IDF and AMP

硝酸鹽和亞硝酸鹽廣泛存在于人體環(huán)境中，是自然界中最常見的含氮類化合物。人體內(nèi)硝酸鹽在胃酸作用下可被還原為亞硝酸鹽、N-亞硝基化合物的前體物質(zhì)。內(nèi)源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽被列入2A類致癌物清單[21]。從圖4可以看出，IDF在pH2.0環(huán)境下的NIAC比pH7.0環(huán)境下有所增加，說明膳食纖維對(duì)NO2-的吸附發(fā)生在胃中，腸中基本不吸附NO2-。pH2.0時(shí)，IDF的亞硝根離子吸附能力（51.20±0.12）mg/g顯著高于 AMP 的（40.10±0.23）mg/g（P＜0.05），表明復(fù)合復(fù)合酶法提取的膳食纖維對(duì)NO2-表現(xiàn)出更好的吸附作用，但仍低于采用微波方法提取的葡萄柚子的IDF亞硝酸根離子吸附量[（219.43±0.02）mg/g][17]，因此，研究不同提取方法之間吸附能力的差異具有重要意義。而Dong等[22]研究表明，膳食纖維對(duì)亞硝酸鹽吸附效果是通過分子上的-OH和NO2-形成“膳食纖維-NO2-”絡(luò)合物來實(shí)現(xiàn)NO2-的去除，堿性條件下該絡(luò)合物解離，并隨糞便排出。

2.4.3 葡萄糖吸附能力測(cè)定結(jié)果

圖5為IDF和AMP的葡萄糖吸附能力。

圖5 IDF和AMP的葡萄糖吸附能力Fig.5 Glucose adsorption capacity of IDF and AMP

研究發(fā)現(xiàn)，IDF含量較高的食物，如綠藻、竹筍等，可以延緩或減少消化道對(duì)葡萄糖的吸收，具有較好的降血糖能力[23]。因此，吸附葡萄糖也是IDF的一個(gè)重要功能性質(zhì)。由圖5可知，IDF和AMP對(duì)葡萄糖均有吸附效果，并且吸附量隨葡萄糖濃度的增加而增加，IDF的吸附效果分別為（1.54±0.12）、（1.97±0.13）mmol/g和（2.88±0.15）mmol/g，對(duì)比發(fā)現(xiàn)酶解作用使吸附葡萄糖的能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），這可能是因?yàn)閺?fù)合酶對(duì)部分細(xì)胞壁的降解作用，使纖維結(jié)構(gòu)變得疏松、溶脹，暴露出更多的功能基團(tuán)，溶質(zhì)分子更容易進(jìn)入纖維內(nèi)部，膳食纖維與葡萄糖分子間和分子內(nèi)作用力（如范德華力和氫鍵等）的相互作用增強(qiáng)，能夠吸附更多的葡萄糖分子。結(jié)果表明，IDF能夠吸附葡萄糖從而減少或降低葡萄糖在體內(nèi)的吸收速率，因此，其可以有效緩解糖尿病人對(duì)葡萄糖的吸收速率，控制血糖的上升。

3 結(jié)論

本研究采用復(fù)合酶法提取黑果腺肋花楸膳食纖維，并對(duì)其組成和功能特性進(jìn)行表征。結(jié)果表明，提取方法不僅影響IDF的結(jié)構(gòu)特征，還影響其功能特性。采用復(fù)合酶法提取的黑果腺肋花楸IDF的質(zhì)量有了很大的提高，在功能食品工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力，值得進(jìn)一步研究。綜上，對(duì)黑果腺肋花楸IDF的單糖組成進(jìn)行研究，不僅反映了復(fù)合酶法對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響，也從多糖結(jié)構(gòu)的角度揭示黑果腺肋花楸膳食纖維具有保健功能特征，為活性物質(zhì)資源的開發(fā)、利用提供新的重要信息。