新橙皮苷二氫查耳酮體內(nèi)降血糖活性

陶福英，禤日翔，戴梓茹*，范和良*，韋佳杏，王培，覃媚，祁岑，郝俊光，

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院欽州市食品風(fēng)味分析與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535011）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種多病因引起的慢性代謝性疾病，其特征是持續(xù)的高血糖水平[1]，糖尿病會(huì)引發(fā)多種并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致殘疾、死亡等[2-3]。在過去的幾十年里，已經(jīng)開發(fā)出了越來越多的藥物用來緩解糖尿病，但這些藥物有一定的副作用。植物來源的化合物正在成為對(duì)抗糖尿病等代謝疾病的有利替代品[4]。

新橙皮苷二氫查耳酮（neohesperidin dihydrochalcone，NHDC）是從天然柑橘植物中提取到的新橙皮苷氫化而成的黃酮類衍生物，屬于甜味劑，甜度是葡萄糖的1 500倍～1 800倍[5]。俞?；莸萚6]發(fā)現(xiàn)NHDC具有強(qiáng)烈的甜味和極佳的屏蔽苦味的功效，能降低人體對(duì)飲料或醫(yī)藥中苦味的敏感程度，因而在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。Takii等[7]在研究酚苷類物質(zhì)降血糖活性中已經(jīng)初步證明了NHDC能夠降低小鼠的血糖含量，但關(guān)于NHDC降血糖活性的研究并沒有新的進(jìn)展。雖然關(guān)于NHDC降血糖方面的研究較少，但與其具有相似結(jié)構(gòu)的橙皮苷等柑橘類黃酮的降血糖活性一直是研究熱點(diǎn)，例如橙皮苷能夠通過改善葡萄糖代謝相關(guān)酶的活性[8-11]、刺激β細(xì)胞胰島素分泌[12]、增強(qiáng)胰島素敏感作用[13]等發(fā)揮降血糖作用，柑橘黃酮能夠通過抑制糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的活性來促進(jìn)糖原合成，從而起到調(diào)節(jié)血糖的作用[14]。

斑馬魚是發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)、藥理學(xué)等研究領(lǐng)域的理想脊椎動(dòng)物[15]。研究表明斑馬魚血糖調(diào)控機(jī)制與哺乳動(dòng)物高度一致[16-17]，斑馬魚產(chǎn)卵量大，生長周期短，在同樣使用葡萄糖浸泡法的情況下，成年斑馬魚造模時(shí)間長（＞14 d），而受精120 h后的斑馬魚幼魚卻能快速建立糖尿病模型（＜5 d），大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，有效提高了整體實(shí)驗(yàn)效率，并且幼魚體內(nèi)與糖代謝相關(guān)的胰島等器官已發(fā)育完全，能夠作為評(píng)價(jià)天然化合物抗糖尿病研究的動(dòng)物模型?；谏鲜鲅芯浚疚囊杂佐~糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，參照文獻(xiàn)[16，18]的方法建立斑馬魚幼魚高血糖模型，在建立高血糖模型的同時(shí)，擬用NHDC進(jìn)行干預(yù)，通過測定葡萄糖、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、胰島素、糖原含量評(píng)價(jià)其降血糖活性，為新橙皮苷二氫查耳酮的開發(fā)利用及降血糖藥物篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器

斑馬魚胚胎：由野生WT品系雌雄魚自然交配而得，WT品系斑馬魚由北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院海洋資源開發(fā)與利用課題組提供。

葡萄糖（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；四氧嘧啶（≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；新橙皮苷二氫查耳酮（≥95%）：上海麥克林生化科技有限公司；阿卡波糖（≥98%）：杭州中美華東制藥有限公司；蛋白含量檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒、糖原檢測試劑盒、胰島素檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司。

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL20）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；羅氏血糖儀（CR2032）：羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；生物恒溫箱（SHP-80）：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；全波長酶標(biāo)儀（Thermo-Multiskan Go）：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚交配產(chǎn)卵

斑馬魚養(yǎng)殖于多水槽自動(dòng)循環(huán)水系統(tǒng)，水溫保持在28℃，晝夜循環(huán)為14 h光照/10 h避光的條件，使用成魚交配產(chǎn)卵前，將雌雄按照1∶1分隔放在同一個(gè)交配缸，用擋板隔開，次日早晨將板拔掉，讓其進(jìn)行交配，收集2 h內(nèi)所產(chǎn)的魚卵，放在含0.5%亞甲基藍(lán)胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中（每個(gè)培養(yǎng)皿放30顆魚卵），每天早晚更換培養(yǎng)液。

1.2.2 建立斑馬魚高血糖模型

在顯微鏡下選取發(fā)育正常的5 d齡斑馬魚至6孔板中，每孔30尾，分別浸泡在濃度1%、2%、4%、6%和 8%的葡萄糖溶液及濃度為 0.050、0.100、0.200、0.400 mmol/L和0.800 mmol/L的四氧嘧啶溶液中，空白組浸泡于純水中，于28℃培養(yǎng)箱孵育24 h，統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組存活率，確定四氧嘧啶和葡萄糖的最適浸泡濃度。以血糖水平為指標(biāo)，確定四氧嘧啶和葡萄糖處理的條件，建立斑馬魚急性高血糖模型。

1.2.3 NHDC干預(yù)條件對(duì)急性高血糖斑馬魚的降血糖作用

設(shè)置空白組、模型組、不同濃度NHDC組、0.1mg/mL阿卡波糖組，于28℃培養(yǎng)箱孵育16 h后檢測血糖值，確定最佳降糖作用的藥物濃度。

按照相同方法設(shè)置空白組、模型組、0.1 mg/mL阿卡波糖組、0.100 mg/mL NHDC組，浸泡20 h，每隔4 h檢測血糖值，觀察記錄其變化趨勢，探討NHDC干預(yù)時(shí)間對(duì)高血糖斑馬魚的降血糖效果。

1.2.4 NHDC處理對(duì)斑馬魚糖代謝生化指標(biāo)的影響

在顯微鏡下選取發(fā)育正常的5 d齡斑馬魚至6孔板中，每孔30尾。設(shè)置空白組、模型組、0.100 mg/mL NHDC組，處理16 h后采用試劑盒檢測魚體組織中葡萄糖、TG、TC、糖原、胰島素含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 25.0及origin 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖（單因素ANOVA顯著性分析多組數(shù)據(jù)差異，Student’s t test分析兩組數(shù)據(jù)差異）。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異較顯著，P＜0.005表示差異極顯著，P＜0.001表示差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高血糖斑馬魚模型的建立

對(duì)斑馬魚幼魚浸泡在不同濃度四氧嘧啶的存活率進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見圖1。

圖1 四氧嘧啶浸泡濃度對(duì)斑馬魚存活率的影響Fig.1 Effects of alloxan immersion concentration on survival rate of zebrafish

由圖1可知，5個(gè)濃度處理組的存活率分別為98.0%、97.5%、63.5%、0%、0%。在浸泡濃度為 0～0.100 mmol/L時(shí)，斑馬魚幼魚的存活率高于97.5%，此時(shí)四氧嘧啶對(duì)斑馬魚造成的損傷較輕，存活率較高；在浸泡濃度為0.100 mmol/L～0.400 mmol/L時(shí)，斑馬魚的存活率與濃度呈負(fù)相關(guān)，在浸泡濃度為0.200 mmol/L時(shí)為63.5%；在浸泡濃度≥0.40 mmol/L時(shí)，斑馬魚死亡率高至100%。因此，選擇用于進(jìn)一步誘導(dǎo)高血糖模型的四氧嘧啶浸泡濃度范圍不超過0.100 mmol/L。

葡萄糖浸泡濃度對(duì)斑馬魚存活率的影響見圖2。

圖2 葡萄糖浸泡濃度對(duì)斑馬魚存活率的影響Fig.2 Effects of glucose immersion concentration on survival rate of zebrafish

由圖2可知，野生型斑馬魚幼魚分別浸泡在葡萄糖浸泡濃度為1%、2%和4%時(shí)，存活率為99.0%；而當(dāng)浸泡濃度為4%～8%時(shí)，隨著葡萄糖浸泡濃度提升，斑馬魚存活率逐漸下降，濃度為6%時(shí)存活率僅為73.5%，濃度為8%時(shí)存活率為0%。因此，選擇葡萄糖浸泡濃度為4%。

在0～0.100 mmol/L范圍內(nèi)選擇3個(gè)梯度濃度四氧嘧啶和4%葡萄糖聯(lián)用浸泡，結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度四氧嘧啶和4%葡萄糖聯(lián)用對(duì)斑馬魚存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of alloxan and 4% glucose combined on survival rate of zebrafish

由圖3可知，四氧嘧啶與葡萄糖兩者聯(lián)用濃度為0.050 mmol/L+4%浸泡16 h時(shí)存活率為97.5%，16 h后下降，其他聯(lián)用濃度在浸泡4h后存活率逐漸下降，當(dāng)浸泡時(shí)間超過12h時(shí)，斑馬魚血糖值低于3.9 mmol/L，故采用0.050 mmol/L四氧嘧啶+4%葡萄糖浸泡16 h建立斑馬魚急性糖尿病模型。

由于斑馬魚幼魚體積較小，無法采集血液樣本，因此直接取幼魚魚體勻漿測定血糖含量。以血糖值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，0.050 mmol/L四氧嘧啶+4%葡萄糖聯(lián)用浸泡16 h后的斑馬魚為高血糖模型組，純水浸泡為空白組，結(jié)果見圖4。

圖4 四氧嘧啶與葡萄糖聯(lián)用浸泡對(duì)斑馬魚幼魚血糖值的影響Fig.4 Effects of combined immersion of alloxan and glucose on blood glucose values of juvenile zebrafish

如圖4所示，模型組血糖值（5.6 mmol/L）與空白組（2.3 mmol/L）差異極顯著（P＜0.005），表明模型建立成功。王澤民[19]使用高膽固醇飲食加上3%葡萄糖溶液浸泡誘導(dǎo)斑馬魚幼魚糖尿病的快速形成，其模型組的葡萄糖值為4.7mmol/L，低于本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的葡萄糖值，說明四氧嘧啶+葡萄糖聯(lián)用能夠快速建立急性高血糖模型。

2.2 NHDC干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間對(duì)高血糖斑馬魚血糖水平的影響

不同濃度藥物對(duì)斑馬魚血糖水平的影響見圖5。

圖5 不同濃度藥物對(duì)斑馬魚血糖水平的影響Fig.5 The effects of different concentrations of drugs on blood glucose level of zebrafish

如圖5所示，在干預(yù)16 h后，藥物組血糖水平均明顯低于模型組，但相比于空白組，0.025、0.050、0.075 mg/mL 3個(gè)劑量組血糖水平仍較高，0.100 mg/mL NHDC組血糖值與空白組相比無差異，與阿卡波糖組相當(dāng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，用濃度大于0.1 mg/mL NHDC處理斑馬魚后，其死亡率較高（＞70%），因此選定0.100mg/mL為最佳劑量。勞喬聰[18]通過1.00 mmol/L四氧嘧啶+4%蔗糖聯(lián)用浸泡建立斑馬魚糖尿病模型，在阿卡波糖給藥后血糖值明顯低于模型組。丁薇娜[20]的研究表明3'-香葉基柑橘查耳酮（100 mg/kg）給藥后能明顯降低糖尿病小鼠的餐后血糖值，并且降糖作用效果與阿卡波糖（100 mg/kg）相當(dāng)。阿卡波糖屬于臨床中常見的α-糖苷酶抑制劑，其作用效果為降低糖尿病患者的餐后高血糖[21]，同樣作為柑橘查耳酮的NHDC也具有降血糖作用，與丁薇娜[20]的研究結(jié)果一致，因此初步認(rèn)為NHDC能起到餐后降血糖作用。

NHDC干預(yù)時(shí)間對(duì)斑馬魚血糖水平的影響見圖6。

圖6 NHDC干預(yù)時(shí)間對(duì)斑馬魚血糖水平的影響Fig.6 The effect of NHDC administration time on blood glucose of zebrafish

如圖6所示，從總體上看干預(yù)時(shí)間為4 h～20 h時(shí)，空白組血糖值無明顯變化，模型組血糖水平逐步升高，當(dāng)斑馬魚在溶液中浸泡4 h時(shí)，除空白組外，藥物組血糖值均與模型組無明顯差異，可能由于阿卡波糖及NHDC餐后降血糖作用起效慢，因此干預(yù)4 h的降血糖效果并不明顯。0.100 mg/mL NHDC在干預(yù)8 h～16 h時(shí)間段內(nèi)血糖值隨著時(shí)間的延長穩(wěn)步下降，且始終低于模型組，到16 h時(shí)與空白組無差異，其降血糖效果與阿卡波糖相當(dāng)。表明NHDC降血糖作用隨著時(shí)間的延長而增加，血糖值下降較為穩(wěn)定，降血糖作用時(shí)間長。

2.3 NHDC對(duì)高血糖斑馬魚血脂水平的影響

多數(shù)糖尿病患者伴有血脂代謝異常[22]，這是因?yàn)樘悄虿』颊咭葝u細(xì)胞分泌胰島素的能力降低，糖代謝紊亂造成脂質(zhì)代謝發(fā)生異常，氨基酸合成脂蛋白酶的能力降低，從而增加了血液當(dāng)中的脂肪含量，造成血脂異常[23]，通常表現(xiàn)為甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白的升高以及高密度脂蛋白的降低[24]。因此，斑馬魚的葡萄糖、膽固醇和甘油三酯含量可從側(cè)面反映血糖的高低[25]。NHDC給藥對(duì)斑馬魚葡萄糖含量、TG含量、TC含量的影響見圖7～圖9。

圖7 NHDC給藥對(duì)斑馬魚葡萄糖含量的影響Fig.7 The effect of NHDC administration on glucose value of zebrafish

圖8 NHDC給藥對(duì)斑馬魚TG含量的影響Fig.8 The Influence of NHDC administration on TG content of zebrafish

圖9 NHDC給藥對(duì)斑馬魚TC含量的影響Fig.9 The Influence of NHDC administration on TC content of zebrafish

如圖7～圖9所示，與空白組相比，四氧嘧啶和葡萄糖處理的模型組的葡萄糖含量、TG含量、TC含量均有一定倍數(shù)的增加，而NHDC處理后，葡萄糖含量從0.49 mmol/g降至0.16 mmol/g，降低了67.35%，TG和TC含量分別降低了80.88%和55.31%，與模型組相比差異顯著（P＜0.05），因此NHDC能夠有效降低高糖環(huán)境誘導(dǎo)的斑馬魚高血脂水平。

2.4 NHDC對(duì)胰島素分泌以及糖原合成水平的影響

胰島素是調(diào)節(jié)血糖的關(guān)鍵激素，胰島素與其受體結(jié)合后能夠激活胰島素信號(hào)通路，抑制糖原合成激酶-3β，并進(jìn)一步激活糖原合酶（glycogen synthase，GS），通過刺激糖原合成減少肝臟葡萄糖輸出[26]，因此當(dāng)胰島素分泌減少或生理效應(yīng)降低會(huì)抑制胰島素信號(hào)通路下游GS的激活與表達(dá)，直接造成糖原含量的降低，進(jìn)而引發(fā)血糖水平的升高。NHDC給藥對(duì)斑馬魚胰島素分泌和糖原合成的影響見圖10～圖11。

圖10 NHDC給藥對(duì)斑馬魚胰島素分泌的影響Fig.10 The effects of NHDC administration on insulin secretion in zebrafish

圖11 NHDC給藥對(duì)斑馬魚糖原合成的影響Fig.11 The effects of NHDC administration on glycogen synthesis in zebrafish

如圖10～圖11所示，四氧嘧啶和葡萄糖處理16 h后，模型組斑馬魚胰島素含量顯著低于空白組（P＜0.05），提示四氧嘧啶和葡萄糖可能造成斑馬魚β細(xì)胞功能受損使得胰島素分泌下降，胰島素含量的減少導(dǎo)致其生理效應(yīng)降低，表現(xiàn)為糖原含量的減少（圖11）。NHDC處理組與模型組相比，胰島素分泌水平和糖原水平分別增加了58%（圖10）和52%（圖11），且與空白組無差異。因此，推測NHDC能夠修復(fù)受損的胰島β細(xì)胞、刺激胰島素分泌、提高胰島素作用的糖原合成水平，從而降低血糖濃度。

3 討論與結(jié)論

四氧嘧啶會(huì)選擇性破壞胰腺中產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞，是制備糖尿病模型的常用藥物。研究表明，0.050 mmol/L四氧嘧啶和4%葡萄糖浸泡處理16 h造成了幼魚體內(nèi)糖脂代謝紊亂，表現(xiàn)為血糖、葡萄糖、TG、TC水平的升高，同時(shí)β細(xì)胞功能受損使得模型組斑馬魚胰島素分泌減少，糖原含量下降。胰島素水平的變化與糖脂代謝和穩(wěn)態(tài)紊亂密切相關(guān)，胰島素生理效應(yīng)降低會(huì)影響糖原合成過程，同時(shí)也會(huì)降低血糖水平。此外，游離脂肪酸是脂肪酸分解過程中生成的功能物質(zhì)，胰島素生理效應(yīng)的降低會(huì)導(dǎo)致游離脂肪酸生成增加，游離脂肪酸含量偏高會(huì)導(dǎo)致高脂血癥，因此模型組糖脂代謝紊亂的發(fā)生與胰島素分泌下降有關(guān)。而0.100 mg/mL NHDC干預(yù)后能夠刺激胰島素分泌，恢復(fù)葡萄糖、TG、TC、糖原水平?；谶@些研究結(jié)果，認(rèn)為NHDC可能通過修復(fù)受損β細(xì)胞，增加胰島素生理效應(yīng)、促進(jìn)糖原合成來發(fā)揮降血糖作用，但其具體降血糖作用的機(jī)制還需要再進(jìn)行更深入的研究。本研究為后期斑馬魚高血糖模型的建立以及黃酮類化合物降血糖作用研究提供了參考，為糖尿病功能食品和治療藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。