反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動(dòng)法對(duì)姜黃素的增溶及穩(wěn)態(tài)化

王永輝，汪新月，郭衛(wèi)蕓，高雪麗，李光輝*，孫思勝，黃繼紅

（1.許昌學(xué)院食品與藥學(xué)院 河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 許昌 461000）

在食品加工中，姜黃素被廣泛作為調(diào)味劑、防腐劑和著色劑等使用[1-2]。姜黃素具有酚羥基和甲氧基的結(jié)構(gòu)特征，具備與活性氧和氮反應(yīng)的能力[3-4]，其對(duì)正常細(xì)胞毒性低，但是可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞系死亡[5-8]。姜黃素還具有作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑治療關(guān)節(jié)炎等炎癥疾病的作用[9-10]，以及具有抗菌、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗纖維化等多重作用[2-3]。姜黃是一種極具功能食品開(kāi)發(fā)價(jià)值的藥食同源物質(zhì)，其主要有效活性成分為姜黃素，但是姜黃素難溶于水，化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，受外界環(huán)境影響也比較大，而且在腸道中代謝快，生物利用率低[11]。研究表明，pH值、鹽離子、溫度以及溶液極性等改變后可以誘導(dǎo)分子間發(fā)生組裝，形成納米級(jí)、具有一定幾何外形的膠體顆粒[12]。通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與姜黃素的非共價(jià)絡(luò)合作用，兩者共組裝形成的納米級(jí)膠體顆粒能夠極大地改善姜黃素的水溶性及穩(wěn)定性。當(dāng)前報(bào)道的誘導(dǎo)方法主要有pH驅(qū)動(dòng)法、噴霧干燥法、液體反溶劑沉淀法、凝聚法等[13]。

反溶劑誘導(dǎo)法通過(guò)向溶液中加入非溶劑而引起溶質(zhì)過(guò)飽和，從而為溶質(zhì)的沉淀提供驅(qū)動(dòng)力，同時(shí)為了維持納米顆粒的穩(wěn)定性，溶液中通常還要有表面活性劑的存在[14]。pH驅(qū)動(dòng)法通過(guò)轉(zhuǎn)變?nèi)芤旱膒H值誘導(dǎo)生物大分子發(fā)生“解離－重構(gòu)”及“去質(zhì)子化-質(zhì)子化”[15]，實(shí)現(xiàn)將游離態(tài)姜黃素包埋于大分子內(nèi)部。Dai等[16]利用大豆卵磷脂和玉米醇溶蛋白，通過(guò)反溶劑共沉淀制備了姜黃素復(fù)合納米顆粒，明顯提高了姜黃素的水溶性及穩(wěn)定性。Chen等[17]通過(guò)反溶劑誘導(dǎo)法制備了姜黃素復(fù)合納米顆粒溶液，使姜黃素的穩(wěn)定性和生物可利用率得到明顯提高。Pan等[18]通過(guò)pH驅(qū)動(dòng)法獲得了具有良好復(fù)溶性的姜黃素復(fù)合納米顆粒。Xu等[19]通過(guò)pH驅(qū)動(dòng)法制備了姜黃素復(fù)合納米顆粒，姜黃素在酸性環(huán)境下的分散性及穩(wěn)定性均得到提高。這兩種制備方法均能夠有效提高姜黃素的溶解性以及穩(wěn)定性，但由于不同研究間存在試驗(yàn)原料以及含量的差異，無(wú)法對(duì)這兩種制備方法進(jìn)行對(duì)比分析，因此這兩種制備方法的優(yōu)劣尚缺乏具體研究。

單純蛋白質(zhì)構(gòu)建的姜黃素納米復(fù)合物在弱酸性食品體系中的穩(wěn)定性較差。研究表明，通過(guò)構(gòu)建蛋白/多糖/姜黃素三元復(fù)合物可以解決姜黃素復(fù)合物納米顆粒在弱酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性問(wèn)題[20]?？扇苄源蠖苟嗵牵╯oluble soybean polysaccharides，SSPS）屬于水溶性膳食纖維，是一種良好的乳化穩(wěn)定劑，其在酸性環(huán)境下具有獨(dú)特的穩(wěn)定蛋白質(zhì)的能力。研究表明，將SSPS作為穩(wěn)定劑可明顯提高蛋白質(zhì)/姜黃素復(fù)合納米顆粒在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性[21]。本研究以酪蛋白酸鈉為載體，通過(guò)反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動(dòng)法分別制備姜黃素復(fù)合物，對(duì)比分析兩種制備方法對(duì)姜黃素增溶能力的影響，并考察姜黃素復(fù)合物在不同溫度及不同貯藏時(shí)間下的穩(wěn)定性，本研究還進(jìn)一步分析酪蛋白酸鈉（sodium caseinate，NaCas）復(fù)配SSPS后兩種制備方法對(duì)姜黃素增溶能力及其酸性環(huán)境穩(wěn)定性的影響。本研究旨在對(duì)比分析反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動(dòng)法對(duì)姜黃素的增溶能力及穩(wěn)定性的影響，為姜黃素在功能食品的應(yīng)用中提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素（純度≥92%）、NaCas（純度≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SSPS（純度≥98%）：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA 2014 B）：上海越平科學(xué)儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-7504）：上海新茂儀器有限公司；磁力攪拌器（ZNCL-DL）：愛(ài)博特科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D）：常州普天儀器制造有限公司；酸度計(jì)（PB-10）：德國(guó) Sartorius公司；高速冷凍離心機(jī)（JW-2019HR）：安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 反溶劑誘導(dǎo)法制備姜黃素復(fù)合物

參考Wang等[21]的方法制備姜黃素復(fù)合物，并略作修改。用去離子水配制5mg/mLNaCas儲(chǔ)備液，于4℃冰箱放置4 h。將0.4 g姜黃素加入40 mL無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢韬笤?℃離心（8 000 r/min、8 min）除去沉淀，將獲得的姜黃素乙醇溶液（10 mg/mL）置于4℃冰箱避光保留備用。取NaCas儲(chǔ)備液10 mL置于15 mL具塞玻璃瓶中，20℃室溫下，通過(guò)磁力攪拌器在1 000 r/min的攪拌速度下，逐滴加入0.5 mL姜黃素乙醇溶液，并持續(xù)攪拌10 min。隨后，將上述混合物在4℃離心（8 000 r/min、8 min）除去沉淀，上清液即為姜黃素復(fù)合物溶液。用去離子水將上清液稀釋40倍，并在425 nm下測(cè)初始吸光度。對(duì)照組用去離子水替代NaCas溶液，制備過(guò)程同上。

1.3.2 pH驅(qū)動(dòng)法制備姜黃素復(fù)合物

參考Pan等[18]的方法制備姜黃素復(fù)合物，并略有修改。用去離子水配制5 mg/mL NaCas儲(chǔ)備液，于4℃冰箱放置4 h。取NaCas儲(chǔ)備液10 mL置于15 mL具塞玻璃瓶中，加入5 mg姜黃素粉末，用4 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)整為12.0。在室溫（20℃）下，通過(guò)磁力攪拌器在1 000 r/min的轉(zhuǎn)速下攪拌10 min后，用4 mol/L HCl溶液將溶液的pH值調(diào)整為7.0。將該溶液在4℃、8 000 r/min條件下離心8 min除去沉淀，上清液即為姜黃素復(fù)合物溶液。用去離子水將上清液稀釋40倍，并在425 nm下測(cè)初始吸光度。對(duì)照組用去離子水替代NaCas溶液，制備過(guò)程同上。

1.3.3 不同貯藏溫度下姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的測(cè)定

將兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液分別在4、20、50℃ 下放置 30 min，4℃、8 000 r/min離心 3 min后除去沉淀。將上清液用去離子水稀釋40倍后，在425nm下測(cè)吸光度，計(jì)算保留率。保留率為不同溫度放置后測(cè)定的吸光度與初始吸光度的百分比。

1.3.4 不同貯藏時(shí)間下姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的測(cè)定

將兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液分別置于4℃避光放置，每隔12 h取2 mL，4℃、8 000 r/min離心3 min，除去沉淀，將上清液用去離子水稀釋40倍后，在425 nm下測(cè)吸光度，計(jì)算溶液中姜黃素的保留率。保留率為不同放置時(shí)間測(cè)定的吸光度與初始吸光度的百分比。

1.3.5 不同酸性環(huán)境下姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的測(cè)定

用去離子水將兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液分別稀釋10倍后，將其均分為6份，用0.5 mol/L的鹽酸將上述溶液的 pH 值分別調(diào)整為 7、6、5、4、3、2。將不同pH值的姜黃素復(fù)合物溶液分別在4℃離心（8 000 r/min、3 min），上清液用去離子水稀釋40倍后，在425 nm下測(cè)吸光度，計(jì)算保留率。保留率為不同pH值下測(cè)定的吸光度同pH值為7時(shí)吸光度的百分比。

1.3.6 添加SSPS后姜黃素復(fù)合物溶解能力的測(cè)定

在NaCas儲(chǔ)備液中加入0.5%的SSPS，經(jīng)磁力攪拌充分溶解后，分別采用1.3.1中的反溶劑誘導(dǎo)法和1.3.2中的pH驅(qū)動(dòng)法制備姜黃素復(fù)合物。用去離子水將復(fù)合物溶液稀釋40倍，并在425 nm下測(cè)吸光度。

1.3.7 添加SSPS后姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性的測(cè)定

將加入SSPS后經(jīng)兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液均稀釋40倍，然后均分為6份，用4 mol/L的HCl溶液分別調(diào) pH 值為 7、6、5、4、3、2。在 4 ℃離心（8 000 r/min、3 min），測(cè)定上清液在425 nm的吸光度，并計(jì)算保留率。保留率的計(jì)算方法同1.3.5。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每項(xiàng)試驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立測(cè)定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（p＜0.05），用 Origin 8進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種方法對(duì)姜黃素增溶作用的比較

制備方法對(duì)姜黃素復(fù)合物吸光度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 制備方法對(duì)姜黃素復(fù)合物吸光度的影響Fig.1 Effects of preparation methods on curcumin complexes

由圖1可知，在利用NaCas同姜黃素非共價(jià)結(jié)合制備姜黃素復(fù)合物的過(guò)程中，反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動(dòng)法對(duì)于姜黃素的增溶效果差異顯著（p＜0.05）。相對(duì)于pH驅(qū)動(dòng)法，在相同NaCas濃度下反溶劑誘導(dǎo)法對(duì)姜黃素的增溶能力可提高近4倍。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能在于pH驅(qū)動(dòng)法在實(shí)施過(guò)程中產(chǎn)生較多的鹽離子，鹽離子的存在降低了姜黃素復(fù)合顆粒的表面電荷，從而使顆粒失去穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致姜黃素溶解性的降低。研究表明，高鹽離子對(duì)姜黃素復(fù)合顆粒的膠體穩(wěn)定性非常不利[20]。另外，在沒(méi)有NaCas存在的去離子水中，兩種制備方法對(duì)姜黃素的增溶效果差異不顯著（p＞0.05），姜黃素的溶解能力均非常低。這一現(xiàn)象同Chen等[17]、Pan等[18]以及Wang等[21]的研究結(jié)果較為一致。

2.2 不同環(huán)境條件對(duì)姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

2.2.1 貯藏溫度對(duì)姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

姜黃素復(fù)合納米顆粒膠體溶液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的體系，溫度對(duì)其穩(wěn)定性的影響較大[20]。貯藏溫度對(duì)不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響Fig.2 Effects of temperature on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由圖2可知，兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物溶液隨著貯藏溫度的提升，姜黃素的保留率均出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這說(shuō)明溫度的升高導(dǎo)致姜黃素復(fù)合納米顆粒的膠體穩(wěn)定性下降，部分顆粒出現(xiàn)了聚集沉淀，導(dǎo)致溶液中的姜黃素含量降低。另外，溫度較高時(shí)會(huì)導(dǎo)致部分姜黃素發(fā)生降解，從而使姜黃素的保留率進(jìn)一步降低。有研究指出，貯藏溫度越高，姜黃素越不穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，姜黃素會(huì)發(fā)生明顯的分解[22]。當(dāng)溫度為4℃時(shí)，兩種方式制備的姜黃素復(fù)合物均具有較高的保留率，兩者之間差異不顯著（p＞0.05）。在室溫（20℃）時(shí)，反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性要優(yōu)于pH驅(qū)動(dòng)法。當(dāng)處理溫度為50℃時(shí)，雖然姜黃素的保留率均出現(xiàn)大幅下降，但pH驅(qū)動(dòng)法制備的姜黃素復(fù)合物較反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物的穩(wěn)定性更佳。

2.2.2 貯藏時(shí)間對(duì)姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

貯藏時(shí)間對(duì)不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 貯藏時(shí)間對(duì)不同方法制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響Fig.3 Effects of storage time on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由圖3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種方法制備的復(fù)合物溶液中姜黃素的保留率均呈明顯下降的趨勢(shì)。但在相同的貯藏時(shí)間下，兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物的保留率差異顯著（p＜0.05）。pH驅(qū)動(dòng)法制備的姜黃素復(fù)合物溶液貯藏12 h后，姜黃素的保留率不足70%。而反溶劑誘導(dǎo)法制備的復(fù)合物溶液中姜黃素的保留率仍高達(dá)95%。貯藏時(shí)間為48 h時(shí)，反溶劑誘導(dǎo)法制備的復(fù)合物溶液中姜黃素的保留率仍在80%左右，而pH驅(qū)動(dòng)法中姜黃素的保留率僅有約50%。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因同樣應(yīng)歸因于pH驅(qū)動(dòng)法中有大量鹽離子的引入，造成溶液的離子強(qiáng)度較高，從而降低了姜黃素納米顆粒的貯藏穩(wěn)定性。因此，在相同的貯藏時(shí)間下，反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物溶液具有更高的穩(wěn)定性。

2.2.3 溶液pH值對(duì)姜黃素復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

當(dāng)溶液的pH值靠近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解性迅速下降，造成蛋白質(zhì)諸多功能性質(zhì)（乳化性、凝膠性及起泡性）喪失[23]。pH值對(duì)不同方式制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)不同方式制備的姜黃素復(fù)合物保留率的影響Fig.4 Effects of pH values on the retention rates of curcumin complexes prepared by different methods

由圖4可知，隨著溶液pH值的降低，姜黃素在溶液中的保留率呈先明顯降低后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)溶液的pH值為6時(shí)，反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物保留率顯著高于pH驅(qū)動(dòng)法（p＜0.05）。但隨著溶液pH值的進(jìn)一步下降，兩種方法制備的復(fù)合物中姜黃素的保留率差異不顯著（p＞0.05）。當(dāng)溶液的pH值為4時(shí)，姜黃素在上清液的保留率均僅有10%左右。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因在于當(dāng)溶液的pH值降低到酪蛋白酸鈉的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白溶解能力下降，發(fā)生聚集沉淀造成姜黃素發(fā)生共沉淀。另外，研究結(jié)果還表明，兩種方法制備的姜黃素復(fù)合物在低pH值環(huán)境下穩(wěn)定性均較差，具有相同的趨勢(shì)。

2.3 添加SSPS后不同制備方法對(duì)姜黃素的增溶作用

添加SSPS后不同制備方法對(duì)姜黃素復(fù)合物吸光度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 添加SSPS后不同制備方法對(duì)姜黃素復(fù)合物吸光度的影響Fig.5 Effects of SSPS on the light absorption value of curcumin complexes prepared by different methods

由圖5可知，無(wú)論是反溶劑誘導(dǎo)法還是pH驅(qū)動(dòng)法，NaCas中復(fù)配SSPS后的吸光度均顯著高于單純的NaCas（p＜0.05）。原因可能為 SSPS是一種糖蛋白，其含有的蛋白能夠同姜黃素發(fā)生結(jié)合，從而形成更多的姜黃素復(fù)合物。另外，對(duì)于NaCas/SSPS復(fù)合體系，同單純的NaCas體系類(lèi)似，反溶劑誘導(dǎo)法對(duì)姜黃素的增溶能力仍然明顯高于pH驅(qū)動(dòng)法，前者仍約是后者的4倍。說(shuō)明相對(duì)于NaCas，SSPS對(duì)姜黃素的增溶能力非常有限。

2.4 添加SSPS后姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性

SSPS是一種酸性陰離子多糖，其在食品加工中可作為一種重要的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。SSPS能夠在蛋白顆粒周?chē)纬梢粚颖Ｗo(hù)層，當(dāng)溶液的pH值在蛋白的等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白顆粒仍能均勻地分散在溶液中，保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)。相關(guān)研究表明，SSPS可以明顯提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定的姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性[19-21]。復(fù)配SSPS對(duì)姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖6。

圖6 復(fù)配SSPS對(duì)姜黃素復(fù)合物在酸性環(huán)境下穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of compound SSPS on the stability of curcumin complexes in the acidic environment

由圖6可知，溶液pH值的改變對(duì)復(fù)合物中姜黃素保留率存在較大影響。隨著溶液pH值的降低，兩種方法制備的復(fù)合物中姜黃素保留率均出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，但兩者下降的幅度存在明顯的區(qū)別。pH值小于7時(shí)，反溶劑誘導(dǎo)法制備復(fù)合物的姜黃素保留率顯著高于pH驅(qū)動(dòng)法對(duì)應(yīng)的保留率（p＜0.05）。對(duì)于反溶劑誘導(dǎo)法制備的復(fù)合物溶液，隨著pH值的降低，姜黃素保留率下降趨勢(shì)較為平緩，基本保持在80%以上。但是pH驅(qū)動(dòng)法制備的復(fù)合物姜黃素保留率隨pH值的下降呈現(xiàn)出近直線(xiàn)下降的趨勢(shì)，pH值為2時(shí)僅有10%。因此，通過(guò)pH驅(qū)動(dòng)法制備蛋白質(zhì)姜黃素復(fù)合物時(shí)，引入SSPS并不能改善復(fù)合物在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性。但是，通過(guò)蛋白復(fù)配SSPS，并利用反溶劑誘導(dǎo)法制備則可以改善其在酸性環(huán)境的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

利用食品組分的相互作用，通過(guò)制備膠體復(fù)合物可有效改善姜黃素的溶解性及穩(wěn)定性。結(jié)果表明，反溶劑誘導(dǎo)法和pH驅(qū)動(dòng)法兩種方式均可制備姜黃素復(fù)合物，并能夠顯著提高姜黃素的溶解能力與穩(wěn)定性。相對(duì)于pH驅(qū)動(dòng)法，反溶劑誘導(dǎo)法在相同濃度條件下能更好地增加姜黃素的水溶性，其增溶效果約是前者的4倍。NaCas溶液中添加SSPS后再通過(guò)反溶劑誘導(dǎo)法制備的姜黃素復(fù)合物能夠更好的提高姜黃素水溶性及其在酸性環(huán)境的穩(wěn)定性。因此，反溶劑誘導(dǎo)法能夠?qū)S素起到更好的增溶與穩(wěn)定效果，本研究可以為姜黃素在功能食品的應(yīng)用中提供參考。