竹醋液對常溫貯藏砂糖橘的保鮮效果

林小蘭，吳銅，賴婷婷，龍櫟冰，方娣，韓冬梅，吳振先，3*，羅燾*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東省果蔬保鮮重點實驗室，南方園藝產(chǎn)品保鮮教育部工程研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.廣東省荔枝工程技術(shù)中心，廣東 廣州 510642）

砂糖橘是原產(chǎn)于廣東省四會的名特優(yōu)柑橘品種，以其甜味如砂糖而得名，又稱“十月桔”[1]。標(biāo)準(zhǔn)砂糖橘果實呈扁球形，具有皮薄、果汁豐富、化渣性好、總糖含量高等優(yōu)點[2]。但砂糖橘的組織結(jié)構(gòu)和生理特性較特殊，耐貯性較差，在成熟過程和采后環(huán)節(jié)中易受機(jī)械傷，易被病原菌侵染而發(fā)生腐爛，自然條件下采后貨架期僅1周～2周。真菌性病害是砂糖橘貯運過程中常發(fā)生的病害，主要是貯藏前期頻發(fā)的青綠霉病和貯藏后期的酸腐病，感染綠霉病的砂糖橘果實7 d內(nèi)全果腐爛，感染青霉病則14 d內(nèi)全果腐爛。酸腐病主要發(fā)生在貯藏后期果實抗病力下降后，低溫貯藏2個月左右為發(fā)病高峰[3]。因此，尋找有效的保鮮方法對于減少砂糖橘采后損耗至關(guān)重要。目前我國砂糖橘的采后保鮮主要以化學(xué)藥劑保鮮為主，生產(chǎn)上還輔以水溶性蠟液為主的保鮮蠟。但長期使用化學(xué)保鮮劑會使果實病原菌產(chǎn)生抗藥性，且實際生產(chǎn)中化學(xué)保鮮劑的超標(biāo)使用和殘留易造成食品安全問題。植物天然提取物用于果蔬保鮮具有安全無毒的特點，主要有植物精油、酚類、生物堿、有機(jī)酸等[4]，多種植物特定器官或組織的提取物被報道對微生物具有抑菌潛力[5]，如劍麻提取液可以有效降低綠霉病發(fā)病率[6]；印度楝樹皮提取物處理番茄可以抑制由茄腐鐮孢引起的果實腐爛[7]。

竹子被當(dāng)作治療發(fā)燒和解毒的傳統(tǒng)中藥有很長的歷史[8]。竹子的多個部位富含抗氧化物質(zhì)，作為公認(rèn)的食品抗氧化劑天然來源，竹葉抗氧化物目前已被列入GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》。竹子的各種產(chǎn)品中富含促進(jìn)健康的次生代謝物，也有越來越多的竹產(chǎn)品被報道用于新鮮產(chǎn)品的采后處理。竹醋液（bamboo pyroligneous acid，BPA）是一種在有限氧氣條件下熱解竹子獲得的產(chǎn)品[9]，在農(nóng)藥增效[10]、抑菌和殺菌[11]、土壤改良[12]、鮮切花保鮮[13]等多方面均有應(yīng)用。有研究表明，BPA對人體安全可靠[14-15]。朱忠貴等[16]在金針菇液體培養(yǎng)基里加入不同濃度BPA，發(fā)現(xiàn)0.01%、0.1%BPA對金針菇生長有促進(jìn)作用。BPA作為主要成分被制作成復(fù)合天然食品添加劑。BPA對維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和抑制真菌病原體有效，能有效激活苯丙素代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而提高總黃酮和酚類物質(zhì)的含量，保持蘋果品質(zhì)并提高抗性[17]。近年來竹醋液應(yīng)用于柑橘果實采后保鮮的相關(guān)報道逐漸增多，如臍橙浸泡竹醋液后貯藏105 d，其腐爛率相比清水對照降低了14.77%，總糖和可溶性固形物則比清水對照高1%和1.55%[18]；以1.5%竹醋液和1%殼聚糖復(fù)合物處理椪柑，明顯降低了爛果率，有效抑制膜脂過氧化作用[19]，但竹醋液在砂糖橘果實上的保鮮效果未見系統(tǒng)研究。因此，本試驗對常溫貯藏的砂糖橘、機(jī)械傷果和接種指狀青霉砂糖橘果實進(jìn)行不同濃度的竹醋液處理，系統(tǒng)研究竹醋液對砂糖橘果實的防腐保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

砂糖橘：廣州市從化華隆果蔬保鮮有限公司；指狀青霉：孢子活化后培養(yǎng)3 d，湘潭大學(xué)陶能國教授饋贈；竹醋液（BPA）：江陰中炬生物科技有限公司；次氯酸、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、Na2B4O7·10H2O、硼酸、濃鹽酸（均為分析純）：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚試劑：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

恒溫箱（BAO-150A）：施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；保鮮盒（22 cm×14 cm×14.5 cm、33 cm×21 cm×10 cm）：上海樂扣樂扣貿(mào)易有限公司；超聲波萃取儀（KQ 5200E）：昆山市超聲儀器有限公司；渦旋機(jī)（QL-901）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；微型離心機(jī)（5426）：Eppendorf（中國）有限公司；酶標(biāo)儀（1530-801285）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；紫外分光光度計（UV759CRT）：上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 竹醋液處理砂糖橘

1.2.1.1 竹醋液處理和貯藏

挑選成熟度相對一致、無病蟲害和無機(jī)械損傷的砂糖橘，混勻隨機(jī)分成4組，分別置于250 mL/L（T1）、150 mL/L（T2）和 50 mL/L（T3）竹醋液和蒸餾水（CK）中，浸泡5 min后撈出自然晾干。將晾干的砂糖橘裝入聚乙烯薄袋（厚度0.03 mm），每袋10個，排放整齊并扎口。每個處理不少于20袋，于（25±1）℃、85%～90%相對濕度下貯藏。分別在貯藏10、20、30 d和36 d觀察和取樣。固定其中5袋進(jìn)行觀察，其余用于后期取樣。

1.2.1.2 定期觀察和取樣

每隔10 d觀察各處理和對照組固定的5袋果，記錄果實腐爛率和病害侵染率。每個處理組隨機(jī)拿3袋果進(jìn)行取樣，將果皮和果肉分離，用液氮冷凍完全，研成小塊后保存在-80℃冰箱備用。果實腐爛率和果實侵染率計算公式如下。

果實腐爛率/%=∑（腐爛果實數(shù)量）/10×100

果實侵染率/%=∑（發(fā)病果實數(shù)量）/10×100

1.2.2 砂糖橘機(jī)械造傷和竹醋液處理

1.2.2.1 造傷處理

挑選成熟度相對一致、無病蟲害和無機(jī)械傷的果實，用自制的扎孔器在每個果赤道面上等距離扎3組孔（2 mm深，直徑4 mm，12個針孔）。將造傷的果混勻隨機(jī)分成 4 組，分別放入 250 mL/L（T1）、150 mL/L（T2）和 50 mL/L（T3）竹醋液和蒸餾水（CK）中，浸泡 5 min后撈出，瀝干，鋪放在清潔和滅菌過的超凈工作臺上微風(fēng)晾干。

1.2.2.2 貯藏和數(shù)據(jù)記錄

保鮮盒清潔后用75%乙醇消毒、晾干，用于果實貯藏。每個保鮮盒放10個果實，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，蓋上密封蓋后，置于90%～95%相對濕度和25℃下貯藏。每48 h開蓋換氣，記錄每個處理的果實侵染率、傷口侵染率和果實腐爛率，計算公式如下。

傷口侵染率/%=∑（發(fā)病傷口數(shù)量）/30×100

1.2.3 竹醋液處理砂糖橘接種指狀青霉孢子

1.2.3.1 接種指狀青霉

參考朱從一[20]的方法接種，略有修改。活化3 d～4 d的菌株，挑選孢子懸浮于無菌水中，血球計數(shù)板計數(shù)，配制成濃度1×106個/mL的孢子懸浮液。挑選成熟度相對一致、無病蟲害和無機(jī)械傷的砂糖橘，用2%次氯酸鈉溶液浸泡，表面消毒3 min后快速撈出，無菌水沖洗后放于超凈工作臺上微風(fēng)晾干。用自制扎孔器在每個果實的果皮赤道面上等距扎2個孔（深2 mm，圓形直徑4 mm，12個小針孔）。用無菌水將竹醋液稀釋成250 mL/L（T1）、150 mL/L（T2）和 50 mL/L（T3），以蒸餾水為對照（CK），用移液槍吸取10 μL竹醋液注射到每個果皮傷口。超凈工作臺中微風(fēng)晾干10 min后，移液槍吸取指狀青霉孢子懸浮液接種至每個果皮傷口，每孔 10 μL，微風(fēng)晾干 10 min。

1.2.3.2 貯藏和數(shù)據(jù)記錄

保鮮盒（33 cm×21 cm×10 cm）清潔后用75%乙醇消毒、晾干。每個保鮮盒放20個接種的果實，每個處理設(shè)置3個重復(fù)，置于90%～95%相對濕度和25℃下貯藏。每24 h進(jìn)行開蓋換氣，每個處理固定3盒用于記錄果實侵染率、傷口侵染率、腐爛率和病斑指數(shù)，用十字交叉法測定病斑直徑。接種后4、24、48 h取樣，每個處理隨機(jī)取10個果實，削取以接種點為中心、直徑2 cm的果皮，作為接種點果皮樣品，同時削取未接種點的果皮，用液氮冷凍后，研碎后保存在-80℃冰箱備用。計算公式如下。

傷口侵染率/%=∑（發(fā)病傷口數(shù)量）/40×100

病斑指數(shù)/mm=∑（病斑直徑）/總接種點

1.2.4 總酚和總類黃酮含量的測定

1.2.4.1 樣品提取液的制備

果皮樣品用液氮研磨成粉末后，稱取0.1 g至2 mL離心管中，加入1 000 μL預(yù)冷的80%乙醇，超聲波萃取60 min（加冰降溫），結(jié)束后取出置于4℃冰箱，萃取過夜（10±2）h。第2天繼續(xù)超聲波萃?。颖禍兀? h，每隔0.5 h渦旋1次。4℃下以12 000×g離心10 min，吸取上清液至另一2 mL離心管，用于總類黃酮和總酚含量測定。

1.2.4.2 總類黃酮含量測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總類黃酮含量[21-23]。準(zhǔn)確吸取500 μL果肉提取液或35 μL果皮提取液（加465 μL的80%乙醇補齊）于2 mL離心管中。另取500 μL 80%乙醇加入2 mL離心管中，作為空白對照。配制0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0、10、20、40、60、80、100、200、300、400 μL 至 2 mL 帶刻度的離心管中，加80%乙醇補齊至500μL。所有樣品管、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品管和空白對照管分別加入50μL的5%NaNO2溶液，搖勻后避光放置6min。加入50μL的10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min。加入400 μL的4%NaOH溶液，搖勻，放置10 min。測定510 nm下吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=133.7x+0.75，R2=0.999）。通過外標(biāo)法以蘆丁當(dāng)量計算樣品中總類黃酮含量。

1.2.4.3 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量[23-24]，并稍作修改。準(zhǔn)確吸取50μL果肉提取液取（加蒸餾水550μL）或15 μL果皮提取液（加蒸餾水585 μL）于 5 mL離心管中，搖勻。另取600 μL蒸餾水加入5 mL離心管中，作為空白對照。配制110 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，準(zhǔn)確吸取 0、40、80、120、160、200、240、280 μL 于 5 mL離心管中，加蒸餾水補齊至600 μL。所有樣品管、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品管和空白對照管分別加入50 μL福林酚試劑，充分混勻。然后加入150 μL的20%Na2CO3溶液，充分混合后用蒸餾水定容至2.5 mL。室溫（25±1）℃避光（黑色塑料袋覆蓋）放置0.5 h，測定760 nm下吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=22.46x-0.28，R2=0.990 3）。通過外標(biāo)法以沒食子酸當(dāng)量計算樣品中總酚含量。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶酶活測定

1.2.5.1 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）酶活測定

參照龐學(xué)群等[25]的方法，稍作修改。果皮用液氮研磨成粉末后，稱取0.2 g粉末于2 mL離心管中，加入1 mL、pH8.8的100 mmol/L硼酸鈉緩沖液混勻，萃取50 min。4℃下12 000×g離心20 min，制得的上清液為粗酶提液。將100 μL粗酶提液與1 mL 200 mmol/L苯丙氨酸和2 mL硼酸鈉緩沖液混勻，水浴鍋中37℃反應(yīng)1 h后，用100 μL 6 mmol/L鹽酸終止反應(yīng)。測定290 nm下吸光度，將每克鮮重（FW）每分鐘OD290增加0.01定義為一個酶活單位U。

1.2.5.2 過氧化物酶（peroxidase，POD）酶活測定

參照Huang等[26]的方法，稍作修改。果皮用液氮研磨成粉末后，稱取0.2 g于2 mL離心管中，加入1.0 mL pH7.0的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）混勻。萃取50 min，4℃下12 000×g離心20 min，制得的上清液為粗酶提液。比色皿中加入50 μL粗酶提液，之后依次混入0.95 mL 0.2%愈創(chuàng)木酚、1.0 mL 0.3%H2O2和1.0 mL PBS，記錄470 nm下吸光度的變化，將每克鮮重（FW）每分鐘OD470增加0.01定義為一個酶活單位U。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010錄入和整理數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析（單因素多重比較，Duncan法），使用Origin 8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹醋液處理對砂糖橘常溫貯藏的影響

竹醋液處理對常溫貯藏過程中砂糖橘果實侵染率、果實腐爛率的影響見圖1。

圖1 竹醋液處理對常溫貯藏過程中砂糖橘果實侵染率和果實腐爛率的影響Fig.1 The effect of BPA treatements on the total infection ratio and total decay ratio of‘Shatangju’fruits during storage at room temperature

如圖1所示，隨著貯藏時間的延長，對照組砂糖橘的果實侵染率和果實腐爛率逐漸上升。從10 d開始，各組砂糖橘均出現(xiàn)病害侵染，貯藏第36天，CK組果實侵染率高達(dá)86%，各處理組果實侵染率均低于CK組。整個貯藏期間，T2和T3組果實侵染率均低于CK組，其中T2組處理可更為有效地抑制病菌對砂糖橘的侵染。果實腐爛率與果實侵染率呈現(xiàn)大致相同的趨勢，貯藏第10天，除T2組外，其他3組處理果實均出現(xiàn)腐爛；第20天，T2組果實首次出現(xiàn)腐爛；第36天，T2和T3組果實腐爛率僅為20%左右，而CK和T1組超過35%。綜合果實侵染率和果實腐爛率，各處理對砂糖橘均有防腐效果，其中T2處理對砂糖橘的防腐效果較為理想，T3次之，T1最差。

砂糖橘在常溫貯藏過程中易被各種病菌侵染導(dǎo)致腐爛[27]，而竹醋液是一種安全有效且適用于果蔬采后保鮮的生物源抑菌劑，在蘋果、臍橙、甜椒等果蔬上的處理試驗結(jié)果顯示，竹醋液可以明顯提高果蔬的采后貯藏性，抑制擴(kuò)展青霉的侵染[17]。本試驗結(jié)果表明，竹醋液處理砂糖橘能增強砂糖橘對病菌的抵抗力，提高砂糖橘常溫條件下的貯藏性。但竹醋液濃度過高可能會適得其反，150 mL/L為最佳濃度，其次為50 mL/L。

2.2 竹醋液處理對機(jī)械傷砂糖橘的影響

砂糖橘果皮較薄，運輸過程中易產(chǎn)生機(jī)械傷，病菌從傷口侵染，加快果實腐爛。機(jī)械傷組的果實中，只要有一個傷口受到病害侵染，即視為果實受到侵染。竹醋液處理對常溫貯藏過程中機(jī)械傷砂糖橘果實的傷口侵染率、果實侵染率和果實腐爛率的影響見圖2。

圖2 竹醋液處理對常溫貯藏過程中機(jī)械傷砂糖橘果實的傷口侵染率、果實侵染率和果實腐爛率的影響Fig.2 The effect of BPA treatements on the spot infection ratio，fruit infection ratio and rot ratio of mechanical injured‘Shatangju’fruits during the storage at room temperature

如圖2A和圖2B所示，貯藏4 d～6 d，各處理組果實侵染率和傷口侵染率顯著低于CK組（P＜0.05），貯藏第8天開始快速上升，12 d之后除CK處理外，其他處理果實侵染率均達(dá)到100%，傷口侵染率超過85%。對照組和處理組的果實侵染和腐爛進(jìn)程不一。如圖2C所示，CK組果實在貯藏后期迅速腐爛，12 d～14 d果實腐爛率從17%上升至37%，而3個處理組果實腐爛率在10 d～14 d保持穩(wěn)定，T1和T2處理組低于T3組。上述結(jié)果表明，竹醋液處理可較為有效地延緩機(jī)械損傷砂糖橘果實的腐爛，以250 mL/L濃度最佳。

2.3 竹醋液處理對指狀青霉接種導(dǎo)致的砂糖橘腐爛的影響

竹醋液處理對常溫貯藏過程中接種指狀青霉砂糖橘果實的傷口侵染率、果實腐爛率和病斑直徑的影響見圖3。

圖3 竹醋液處理對常溫貯藏過程中接種指狀青霉砂糖橘果實的傷口侵染率、果實腐爛率和病斑指數(shù)的影響Fig.3 The effect of BPA treatements on the total spot infection ratio，total decay ratio and lesion diameter of‘Shatangju’fruits inoculated with Penicillium digitatum during the storage at room temperature

由圖3可知，接種青霉菌后，砂糖橘在短時間內(nèi)即發(fā)生腐爛，這與文獻(xiàn)的研究結(jié)果相符[3]。貯藏2 d內(nèi)，各組的傷口侵染率超過了80%，竹醋液處理組的果實傷口侵染率略低于對照組（圖3A）。貯藏3 d后，處理組和對照組果實的傷口侵染率無顯著差異（P＞0.05），4 d時全部達(dá)到100%。砂糖橘果實在貯藏第4天開始出現(xiàn)腐爛，T1和T3組的果實腐爛率低于對照（圖3B），然而各果盒中腐爛進(jìn)度和個數(shù)不一，各處理間果實腐爛率并無顯著差異。隨著貯藏時間的延長，接種青霉后貯藏的砂糖橘病斑直徑快速增長（圖3C），到第5天時總體病斑直徑約為60 mm，T1組在2 d～5 d病斑直徑略低于對照和其他處理組，且在前期（2 d～3 d）抑制病斑直徑發(fā)展效果明顯，可見竹醋液短期內(nèi)對于減少指狀青霉接種導(dǎo)致的傷口侵染率、果實腐爛率以及抑制病斑直徑的擴(kuò)大有效果，且隨著濃度的增加，保鮮效果越明顯。

2.4 竹醋液處理對常溫貯藏過程中砂糖橘果皮總酚和總類黃酮含量、PAL和POD酶活的影響

總酚和類黃酮作為重要的化學(xué)屏障，能夠參與植物抗病的防御反應(yīng)[28]。因此本研究測定了總酚和總類黃酮含量，以及與這兩類物質(zhì)合成相關(guān)的POD和PAL的酶活。竹醋液處理對常溫貯藏過程中砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL酶活和POD酶活的影響見圖4。

圖4 竹醋液處理對常溫貯藏過程中砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL酶活和POD酶活的影響Fig.4 The effect of BPA treatements on the total phenolic content，total flavonoid content，PAL activity and POD activity in the‘Shatangju’fruits pericarp during the storage at room temperature

在砂糖橘常溫貯藏過程中，T1組表現(xiàn)并不出色，因此僅測定CK、T2和T3組的相關(guān)物質(zhì)。如圖4A所示，測定常溫貯藏砂糖橘果皮的總酚含量后發(fā)現(xiàn)，T3組在0d時果皮總酚含量顯著高于CK（6.75mg/g）和T1組（6.01mg/g），為 7.39mg/g（P＜0.05）。但在 10d 時，CK 組顯著高于T2和T3組。20 d～30 d對照和處理組無顯著差異（P＞0.05）。如圖4B所示，貯藏0～30d期間，T3組總類黃酮含量明顯高于CK和T2組，貯藏第10天時急劇下降至18.85 mg/g，至第30天又回升至24.22 mg/g，T2組總類黃酮含量在貯藏期間整體有所升高，但各時期均低于T3組。CK組則整體呈下降趨勢，30 d時總類黃酮水平與T2組持平。綜上，竹醋液處理可能增加內(nèi)源酚類和黃酮類物質(zhì)的累積，維持果實對病原菌的化學(xué)防御屏障從而達(dá)到保鮮效果。

PAL是苯丙烷類物質(zhì)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，與酚類物質(zhì)合成和誘導(dǎo)抗病性有關(guān)[29]。從圖4C可看出，竹醋液處理的砂糖橘在0 d時PAL活性顯著高于CK組（P＜0.05），第10天時CK組的PAL活性上升且高于竹醋液處理的兩組砂糖橘，但10 d后CK組的PAL活性急劇下降，而T3組PAL活性在10 d～20 d大幅上升，至第30天一直保持在60.22 U/（g·min）FW，顯著高于CK組的44.56 U/（g·min）FW（P＜0.05），T2組在30 d時酶活性為54.05 U/（g·min）FW，顯著高于CK組（P＜0.05）。

POD是植物中清除活性氧自由基的重要酶，能夠提高植物抗病能力。在30 d的貯藏時間內(nèi)，無論是CK組還是竹醋液處理組的POD活性均呈下降趨勢，但T2組在0～20 d保持較高的POD活性，到第30天，T3組顯著高于CK組和T2組（圖4D）。陳藝等[19]用竹醋液殼聚糖復(fù)合涂膜處理椪柑后，發(fā)現(xiàn)POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，貯藏期間，處理組的POD活性組明顯高于對照組。周漢軍等[30]用藍(lán)桉葉精油處理砂糖橘也呈現(xiàn)相似結(jié)果。在本試驗中，T2和T3處理組分別在貯藏第20天和第30天高于CK組，但在貯藏前期（0 d和10 d）均低于CK組。以上結(jié)果表明，竹醋液處理可明顯提高砂糖橘果皮總類黃酮積累，維持貯藏期間果皮的PAL和POD活性，這可能是竹醋液處理對常溫貯藏砂糖橘具有保鮮作用的原因之一。

2.5 竹醋液處理對指狀青霉接種砂糖橘果皮總酚和總類黃酮含量、POD和PAL酶活的影響

在前述的貯藏試驗中，以250 mg/L竹醋液處理接種指狀青霉的砂糖橘效果最佳，因此僅測定CK和T1組的抗病相關(guān)物質(zhì)。竹醋液處理對接種指狀青霉砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL活性和POD活性的影響見圖5。

圖5 竹醋液處理對接種指狀青霉砂糖橘果皮總酚含量、總類黃酮含量、PAL活性和POD活性的影響Fig.5 The effect of BPA treatements on the total phenolic content，total flavonoid content，PAL avtivity and POD activity in the pericarp of‘Shatangju’fruits inoculated with Penicillium digitatum

如圖5A所示，CK組接種和未接種指狀青霉的果皮總酚含量呈下降趨勢，至48 h時分別為4.97 mg/g和4.84 mg/g，而T1接種組總酚含量在48 h內(nèi)保持在5.40 mg/g左右，未接種組則是先下降后上升，48 h時含量顯著高于 CK 未接種組，為 5.46 mg/g（P＜0.05）（圖5A）?？傤慄S酮含量呈現(xiàn)相似的變化趨勢，T1組果皮總類黃酮含量在貯藏48h后顯著高于CK組（P＜0.05）（圖5B）。從T1組總酚和總類黃酮含量的變化來看，竹醋液對提高砂糖橘對病害的防御能力有一定作用。付陳梅[31]研究發(fā)現(xiàn)，類黃酮對微生物的抑制一方面通過對微生物的微細(xì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使其生理功能失調(diào)，從而導(dǎo)致菌絲體或者孢子的生長減緩；另一面參與機(jī)體防御機(jī)制的啟動，使次生代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生明顯變化，促進(jìn)相關(guān)酶活性的提高或者抗性蛋白的合成等，從而抑制微生物的生長。檸檬中的類黃酮能短時間內(nèi)迅速破壞青霉細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性，并造成大量內(nèi)容物滲出，青霉的分生孢子發(fā)生明顯變形，菌絲也有一定程度變化[32]。

在貯藏48 h期間，T1接種組的PAL活性穩(wěn)定在53.00 U/（g·min）FW，CK接種和T1未接種組呈先下降后升高的趨勢，CK未接種組的PAL活性則先上升后下降，48 h時，CK接種組顯著低于其他3組（P＜0.05）（圖5C）。各處理組的POD活性均在貯藏0～24 h時出現(xiàn)劇烈下降，而貯藏24 h～48 h時，各處理組的POD活性均升高，CK和T1組中接種指狀青霉的POD活性顯著高于未接種組（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，竹醋液本身具有良好的抗氧化性，表現(xiàn)出較好的清除自由基能力[33]。貯藏24 h時T1兩個處理組的POD活性顯著低于CK組（P＜0.05），可能是竹醋液在執(zhí)行清除自由基的功能。

以上結(jié)果表明，250 mL/L的竹醋液處理能保持接種指狀青霉砂糖橘較高的PAL活性，PAL活性增強可以使總酚、總類黃酮等抗病性相關(guān)物質(zhì)增加，從而達(dá)到提高抗病性的效果。

2.6 常溫貯藏和指狀青霉接種砂糖橘抗病相關(guān)指標(biāo)和發(fā)病率的相關(guān)性分析

經(jīng)竹醋液處理后，常溫貯藏和指狀青霉接種砂糖橘抗病相關(guān)指標(biāo)和發(fā)病率（傷口侵染率、果實侵染率和果實腐爛率統(tǒng)稱為發(fā)病率）的相關(guān)性如圖6所示。

圖6 常溫貯藏和指狀青霉接種砂糖橘抗病相關(guān)指標(biāo)和發(fā)病率的相關(guān)性Fig.6 Correlation between disease resistance indexes and incidence of‘Shatangju’fruits stored at room temperature and inoculated with Penicillium digitatum

如圖6A所示，常溫貯藏的砂糖橘果皮中，PAL活性、POD活性、總酚和總類黃酮含量，與果實侵染率、果實腐爛率具潛在負(fù)相關(guān)性，其中POD酶活與果實侵染率呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；PAL、POD 酶活與總酚和總類黃酮具潛在正相關(guān)性。而接種指狀青霉的砂糖橘果皮中，POD活性、總酚含量與傷口侵染率、果實腐爛率具潛在負(fù)相關(guān)性；PAL活性、總類黃酮含量與發(fā)病率則具潛在正相關(guān)性（圖6B）。PAL和POD活性等的高低是評價植物抗性水平的重要參考標(biāo)準(zhǔn)，其中PAL是合成酚類物質(zhì)的關(guān)鍵酶之一，POD則可以催化酚類物質(zhì)的前體聚合成木質(zhì)素，加固細(xì)胞壁，以此來抵御病害[34]。在常溫貯藏的砂糖橘果皮中，這兩種酶的酶活均隨著時間的延長而下降，抗病相關(guān)物質(zhì)總酚和總類黃酮的合成也隨之減少，這可能是貯藏后期（20 d以后）發(fā)病率急劇升高的原因。而接種指狀青霉的砂糖橘果皮中只有POD、總酚與發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這意味著砂糖橘受到青霉菌侵染時，POD和總酚在果皮中作為主要抗病物質(zhì)，其作用比PAL和總類黃酮更直接有效。竹醋液可能促進(jìn)了砂糖橘果皮中抗病相關(guān)物質(zhì)的合成或抑制其降解，提高砂糖橘的抗病能力，從而起到保鮮作用。

3 結(jié)論

50、150 mL/L竹醋液處理常溫貯藏砂糖橘后，降低了果實侵染率和果實腐爛率，150 mL/L竹醋液處理效果更佳；50 mL/L竹醋液處理顯著提高了果皮總類黃酮含量（P＜0.05），使砂糖橘果皮在貯藏期間保持較高的PAL和POD活性；150 mL/L竹醋液對總酚含量無明顯影響，提高了10 d～20 d總類黃酮含量、砂糖橘貯藏期間PAL活性、0～10 d的POD活性。50、150 mL/L竹醋液降低了機(jī)械傷砂糖橘的果實腐爛率，減緩腐爛速度。250 mL/L竹醋液處理對于降低接種指狀青霉的砂糖橘5 d內(nèi)的果實腐爛率和病斑直徑有一定作用。接種后，相比對照，250 mL/L竹醋液處理提高了48 h接種點的總酚含量、總類黃酮含量、PAL活性，但對POD活性沒有明顯影響，提高了未接種組的總類黃酮含量?？共≈笜?biāo)（PAL、POD、總酚和總類黃酮）和發(fā)病率的相關(guān)性分析結(jié)果說明，砂糖橘受到青霉菌侵染時，POD和總酚的抗病作用對比PAL和總類黃酮更直接有效，竹醋液的使用可以促進(jìn)抗病物質(zhì)的合成或抑制其降解。以上結(jié)果表明，常溫貯藏砂糖橘時推薦以150 mL/L竹醋液進(jìn)行處理，其對無傷和機(jī)械損傷的果實均可取得較好的防腐保鮮效果，而對于青霉菌侵染風(fēng)險較高的貯藏環(huán)境，則推薦以250 mL/L竹醋液對砂糖橘進(jìn)行處理。