貴州百香果病毒病病原的鑒定

任羽羽，王立娟，陳 楠，袁啟鳳，馬玉華

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州 貴陽 550006；2.貴州省果樹科學(xué)研究所，貴州 貴陽 550006；3.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】百香果(PassifloraeduliaSims)又稱雞蛋果，是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora)的多年生藤本植物[1-3]。其原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，我國臺灣地區(qū)最早引入，近年來在廣東、廣西、福建、海南、四川和貴州等地均有種植[4]。百香果營養(yǎng)豐富，兼具食用和藥用功能，深受大眾喜愛。百香果具有當(dāng)年種植當(dāng)年結(jié)果的優(yōu)勢，因而經(jīng)濟(jì)價值高[5]。當(dāng)前生產(chǎn)上百香果主要為無性繁殖，苗木多為外地引種栽培，導(dǎo)致多種病毒累積，致使果實(shí)品質(zhì)下降以及產(chǎn)量降低。鑒定貴州百香果的病毒病病原種類，有助于了解侵染貴州百香果主要病毒的種類和建立有效的分子檢測體系，對后期病毒檢測和防控意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，國內(nèi)外已報道8個屬32種侵染百香果的植物病毒，分別為馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)、黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)、菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)、柑橘粗糙病毒屬(Cilevirus)、蕪菁黃花葉病毒屬(Tymovirus)、香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)、煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)和線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)[6]。我國主要報道了10種可侵染百香果的病毒，我國臺灣地區(qū)最早在百香果種植地檢測出大戟曲葉病毒(Euphorbialeafcurlvirus,ELCV)和廣東番木瓜曲葉病毒(PapayaleafcurlGuangdongvirus,PaLCuGdV)2種雙生病毒屬病毒[7]；福建和廣西等地檢測到的百香果病毒主要有黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、夜來香花葉病毒(Telosmamosaicvirus,TeMV)和東亞西番蓮病毒(EastAsianPassifloravirus,EAPV)[8-11]；廣東地區(qū)主要檢測到西番蓮斑駁病毒(Passionfruitmottlevirus,PaMV)[12]；2017—2018年對貴州2個百香果品種進(jìn)行病毒鑒定，檢測結(jié)果為CMV和TeMV[13]。【研究切入點(diǎn)】近3年來，隨著貴州百香果產(chǎn)業(yè)規(guī)?？焖贁U(kuò)大和品種呈現(xiàn)多元化，針對貴州百香果病毒檢測的相關(guān)報道較少，因此有必要繼續(xù)開展病毒鑒定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用去真核生物核糖體rRNA構(gòu)建測序文庫，鑒定貴州百香果病毒種類，并利用RT-PCR驗(yàn)證，為建立貴州百香果病毒種類鑒定、分子檢測和病害防控具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年6月至2021年6月，在貴州省貞豐縣、鎮(zhèn)寧縣、關(guān)嶺縣及羅甸縣等百香果主要種植地采集具有病毒病典型癥狀的樣品，將其混合成4份，樣品信息參見表1。

表1 貴州百香果疑似病毒侵染的樣品信息Table 1 Information of suspected virus-infected samples of passion fruit in Guizhou

1.2 方法

1.2.1 百香果總RNA提取 利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取4份樣品的總RNA，具體操作步驟參照試劑說明書。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的降解程度及是否有蛋白等污染，應(yīng)用Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher)檢測總RNA的濃度，合格的樣品用于文庫構(gòu)建。

1.2.2 文庫建立與高通量測序及質(zhì)控 將1.2.1的4份樣品的總RNA等量混合為1份樣品，利用 Illumina Ribo-Zero(PlantLeaf)試劑盒(MRZPL1224)去除樣品rRNA。通過RT-PCR合成第1條cDNA鏈，然后再合成第2條cDNA鏈，經(jīng)過純化、加接頭和片段篩選等一系列步驟構(gòu)建測序文庫。利用DNA 1000 assay Kit(Agilent Technologies)進(jìn)行文庫質(zhì)檢，利用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System(Life Technologies)進(jìn)行定量，根據(jù)Illumina Hiseq 2500的PE150模式進(jìn)行深度測序。根據(jù) Illumina標(biāo)準(zhǔn)建庫測序流程進(jìn)行測序，獲得原始序列(reads)，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，去除帶接頭和低質(zhì)量的reads，以及連續(xù)低質(zhì)量值堿基數(shù)默認(rèn)小于Q20的堿基數(shù)目。獲得的reads，利用MEGAHIT對高質(zhì)量reads進(jìn)行組裝，篩選最優(yōu)組裝結(jié)果，相關(guān)參數(shù)均使用默認(rèn)值。

1.2.3 病毒RT-PCR驗(yàn)證 根據(jù)拼接獲得的序列設(shè)計(jì)EAPV、TeMV 和PLV的CP基因特異性引物，引物序列見表2。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以4份樣品總RNA模板的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為擴(kuò)增模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系20.0 μL：cDNA為2.0 μL、上下游引物各0.5 μL、Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)為10.0 μL、ddH2O為7.0 μL。RT-PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，35次循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后將目的片段進(jìn)行回收純化并送測序。

表2 病毒RT-PCR擴(kuò)增引物信息Table 2 Information of RT-PCR amplification primes of viruses

1.2.4 病毒系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn分析比對?；蜷_放閱讀框(open reading frame,ORF)使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov / orffinder /)預(yù)測。利用Clustal W程序進(jìn)行多序列比對，使用MEGA 7.0采用Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap值為1 000次。為明確TeMV-GZ、EAPV-GZ、PLV-GZ1-4與已經(jīng)報道的TeMV、EAPV和PLV分離物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，分別以大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus,SMV,FJ548849)、菜豆普通花葉病毒(Beancommonmosaicvirus,BCMV,AJ312437)和藍(lán)莓焦斑病毒(Blueberryscorchvirus,BBScv,KP232982和AY941198)為外群，對3種病毒相關(guān)的CP核苷酸序列和氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏轉(zhuǎn)錄組測序獲得的病毒序列信息

對疑似感染病毒的百香果樣葉進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組測序，利用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行雙末端測序，每端堿基長度均為150 bp，得到大量的原始reads，共1 189 414條序列。經(jīng)質(zhì)控后共獲得1 188 101條高質(zhì)量序列，占99.89%。對所有注釋為病毒相關(guān)的重疊群(Contig)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)表明，數(shù)據(jù)庫中共有1 374 705條序列與病毒比對成功，占總量的1.74%。

2.2 病毒組裝與注釋

經(jīng)組裝比對，共有605條contig注釋為病毒序列，總的contig長度為138 285 bp，平均長度為229 bp。發(fā)現(xiàn)3種已報道過侵染貴州百香果的病毒，分別為TeMV(NC009742)、EAPV(NC007728)和PLV(NC008292)。其中，數(shù)量最多的是PLV，共有275條，contig最大長度為685 bp；其次是EAPV，有166條，contig最大長度為3 912 bp；最后是TeMV，僅48條，contig最大長度為307 bp；其他種類的病毒共比對30條，contig最大長度為1 502 bp(表3、圖1)。

表3 病毒相關(guān)contig分類Table 3 Classification of virus-related contig

圖1 病毒相關(guān)contig長度分布Fig.1 Length distribution of virus-related contig

2.3 病毒相關(guān)reads數(shù)量分布

由圖2可見，EAPV(NC007728)含有的166條contig，其含有875 099條reads，占總的病毒reads數(shù)量的63.65%；PLV(NC008292)含有的275條contig，其含有477 305條reads，占總的病毒reads數(shù)量的34.72%；TeMV(NC009742)含有的48條contig，其含有21 795條reads，占總的病毒reads數(shù)量的1.59%；此外，注釋為其他種類病毒的reads數(shù)量有506條，占總量的0.04%。

圖2 病毒相關(guān)reads的分類統(tǒng)計(jì)Fig.2 Classification statistics of virus-related reads

2.4 病毒的RT-PCR驗(yàn)證

由圖3可見，4份樣品均能擴(kuò)增3種病毒，分別將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物測序，獲得的CP基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn比對發(fā)現(xiàn)，與已報道的TeMV、EAPV和PLV序列有較高的相似性。TeMV貴州分離物(TeMV-GZ)與已報道分離物的核苷酸序列一致性為87.6%～99.7%(MK340754)；EAPV貴州分離物(EAPV-GZ)與已報道分離物核苷酸序列一致性為85.2%～99.8%(MG650164)；PLV貴州分離物與已報道分離物核苷酸序列一致性為93.0%～95.4%(MT723990)；4個PLV貴州分離物多序列比對相似性較高，核苷酸序列一致性為99.5%～100%。將獲得的PLV貴州分離物分別命名為PLV-GZ1、PLV-GZ2、PLV-GZ3和PLV-GZ4。

注：M為DL 2 000 plus marker，1～4為樣品，5為陰性對照，6為空白對照。Note:M,DL 2 000 plus marker;1～4,samples;5,negative control;6,blank control.圖3 百香果3種病毒的 RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR detection of three viruses infecting passion fruit viruses

2.5 病毒系統(tǒng)發(fā)育樹

如圖4所示，獲得的TeMV-GZ分離物與6個不同分離物(MT557572,KJ789129,MN389481,MN384679,MN384683,MN384682)聚為一支，并與其他6個分離物(MH623079,MH500106,MH500104,MH500103,MH500102,MH500101)組成第2大類群；TeMV-GZ分離物與12個不同分離物(MN384683,MH500103,MH500106,MN384682,MH500104,MH500102,MH623079,MT557572,KJ789129,MN384679,MH500101,MN389481)聚集于同一個大的分支，與MN384679親緣關(guān)系較近。EAPV-GZ分離物與12個分離物(AB627437,AB690447,AB627436,AB690439,AB690444,AB690441,KP114136,AF208662,FR694184,MT450870,MN549400,MG650164)聚集于同一個大的分支；EAPV-GZ分離物與11個分離物(MG650164,MN549400,MT450870,KP114136,AB690441,FR694184,AF208662,AB690447,AB690444,AB627437,AB690439)聚集于1個大的分支，且與MG650164親緣關(guān)系較近。

圖4 基于外殼蛋白核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)構(gòu)建的病毒貴州分離物與Carlavirus屬其他病毒的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the PLV Guizhou isolates based on coat protein nucleotide (A) and amino acid sequence (B) and other viruses of Carlavirus

目前，NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的PLV病毒序列4對，與獲得的PLV貴州分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。4個PLV貴州分離物單獨(dú)聚在一起，然后與德國百香果分離物PLV-DSMZ(MT723990)、西班牙百香果分離物PLV-Rehovot(MH379331)、韓國百香果分離物(OK274270)和以色列百香果分離物(NC008292)聚集在一起；4個PLV貴州分離物與(OK274270,NC008292,MT723990,MH379331)聚為一支。

3 討論

目前，植物病毒檢測技術(shù)主要有生物學(xué)檢測、血清學(xué)檢測、電子顯微鏡檢測、分子生物學(xué)檢測和高通量測序等方法[6，14]。與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測方法相比，小RNA測序技術(shù)組裝的病毒基因序列相對較短，常用于檢驗(yàn)已知病毒的基因組序列。本試驗(yàn)應(yīng)用的去真核生物核糖體rRNA，測序?yàn)殡p末端，片段長度為150 bp。去除含量最豐富的核糖體rRNA，能夠提高病毒基因組核酸含量，檢測到更多的病毒RNA序列，從而提高檢測靈敏度，主要用于檢驗(yàn)未知病毒物[15-16]。

從4份疑似病毒侵染的百香果混合樣品中檢測到TeMV、EAPV和PLV共3種病毒，利用RT-PCR驗(yàn)證并測序，其中，TeMV和EAPV測序結(jié)果與已報道病毒核苷酸序列有較高的相似性。TeMV在泰國[17]、福建[11]、廣西[8]和貴州[13]等百香果種植地均有發(fā)生；EAPV在福建[10]和廣西[8]也相繼被報道能侵染百香果。PLV是乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)成員，對百香果侵染表現(xiàn)為不明顯的系統(tǒng)性花葉癥狀，老葉呈現(xiàn)斑駁癥狀[18]。PLV最早報道在國外，開始于德國、隨后在美國和澳大利亞的報道中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)該病毒能夠侵染百香果[18-20]，該病毒在國內(nèi)尚未明確報道。SPIEGEL等[21]已經(jīng)證實(shí)PLV病毒與卡拉病毒屬的顆粒形態(tài)、宿主范圍和血清學(xué)反應(yīng)極近相似，具有卡拉病毒屬的典型特征，并且與藍(lán)莓焦斑病毒親緣關(guān)系密切。目前對該病毒的傳播機(jī)制尚未明確，有關(guān)方面的報道較少，可能是通過引種或其他方式傳播到國內(nèi)，也可能是協(xié)作侵染等因素有待進(jìn)一步研究。至今貴州地區(qū)百香果上未有該病毒發(fā)生的明確報道，同時對百香果的產(chǎn)量是否有一定的影響尚未明確。

TeMV、EAPV貴州分離物與已報道分離物的核苷酸序列一致性分別為87.6%～99.7%、85.2%～99.8%。PLV貴州分離物CP基因核苷酸序列一致性為99.5%～100%，與已報道分離物核苷酸序列一致性為93.0%～95.4%。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，PLV分離物單獨(dú)形成1個分支，相同地區(qū)的分離物優(yōu)先聚集在一起，表現(xiàn)出較強(qiáng)的地域性。因此，通過建立分子檢測體系，可為后期病毒檢測和防控提供理論依據(jù)，同時為保證種苗健康繁育，建議大力推廣無病毒苗木，減少病毒傳播，促進(jìn)貴州百香果產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié)論

對貴州4個主產(chǎn)區(qū)疑似病毒侵染的百香果葉片進(jìn)行病毒種類鑒定表明，EAPV、PLV和TeMV的含量分別占63.65%、34.72%和占1.59%，其他的病毒共占0.04%。通過RT-PCR法進(jìn)一步證實(shí)4份樣本中均含有TeMV、EAPV和PLV，侵染貴州百香果的病毒主要是TeMV、EAPV和PLV。