李惠如,楊治鑫,高子媛,鄭 翔,耿娜娜
(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)
口腔癌約占口腔惡性腫瘤的90 %,全球每年約有超過30萬新發(fā)病例,占總新發(fā)腫瘤病例數(shù)的2.1 %[1]。其中,口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)約占口腔癌的90 %,主要包括發(fā)生在舌前2/3、唇頰部、口底、牙齦、磨牙后三角和硬腭等8個(gè)不同部位的亞群[2]。盡管存在包括免疫療法[3]在內(nèi)的多種新方法,但目前臨床上對(duì)OSCC的治療主要以手術(shù)為主,并且在現(xiàn)階段放化療仍是重要的輔助治療手段[4]。鉑類藥物是目前使用最廣泛的抗癌藥物之一,可通過與腫瘤細(xì)胞DNA交聯(lián)形成Pt-DNA加合物,阻止腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,并最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。近年來,第三代鉑類廣譜抗癌藥物奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXA)廣泛用于臨床,它能有效降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性,對(duì)肝、腎、胃腸道和骨髓的毒性較順鉑和卡鉑明顯降低,具有良好的耐受性[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn),OXA對(duì)結(jié)直腸癌[6]、胃癌[7]、胰腺癌[8]和膽管癌[9]等均有較好的抗腫瘤效果。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Reticulum stress, ER)中的蛋白質(zhì)處理、修飾和折疊是決定細(xì)胞功能、命運(yùn)和存活的嚴(yán)格調(diào)控過程。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)不僅發(fā)生在正常細(xì)胞中,與腫瘤細(xì)胞也有著密切關(guān)系,影響著腫瘤的存活、自噬、遷移、侵襲等[10]。在短期應(yīng)激下,細(xì)胞發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠通過多種機(jī)制適應(yīng)性恢復(fù)其穩(wěn)態(tài),機(jī)制之一則是通過蛋白肌酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶-真核起始因子2α-活性轉(zhuǎn)錄因子4(Protein kinase R-like ER kinase-eukaryotic initiation factor 2α-activating transcriptional factor 4,PERK-eIF2α-ATF4)通路實(shí)現(xiàn)的[11]。但長期應(yīng)激狀態(tài)下會(huì)最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外PERK-eIf2信號(hào)傳導(dǎo)和ATF4蛋白的表達(dá)也被證明是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移所必需的[12-13]。因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-eIF2α-ATF4通路的調(diào)控在抗腫瘤治療過程中具有重要的作用。
目前在口腔領(lǐng)域中,關(guān)于OXA對(duì)OSCC抑制作用的相關(guān)文獻(xiàn)較少,報(bào)道主要涉及DNA損傷[14]、氧化應(yīng)激[15]等信號(hào)通路,鮮有其機(jī)制與ERS的報(bào)道。而近年來,奧沙利鉑也已被證明能夠通過ERS誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡[16]。因此,本課題通過探討OXA對(duì)口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞殺傷作用中ERS及其主要信號(hào)通路PERK-eIF2α-ATF4的影響,以期為OSCC的臨床化療方案提供新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Themo scientific公司;倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;多功能酶標(biāo)儀購自美國分子儀器公司;生物潔凈工作臺(tái)購自中國蘇州安泰空氣技術(shù)公司;蛋白免疫印跡系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司;低溫冷凍離心機(jī)購自美國Themo scientific公司;Real-time PCR檢測儀購自美國Bio-Rad公司;超微量核酸蛋白定量儀購自美國Thermo Fisher公司;流式細(xì)胞儀購自德國Beckman Coulter公司。
1.2 試劑 口腔鱗癌細(xì)胞系HSC-3,由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供;DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher公司(Gibco,貨號(hào):C11965500BT);使用來自AusGeneX的胎牛血清(貨號(hào):FBS500-S);OXA、CCK-8、DAPI和ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒均購自北京索萊寶公司(貨號(hào)分別為:O3390、CA1210、C0065和CA1020);Glucose regulated protein78 (GRP78)、PERK、eIF2α、ATF4、 C/EBP-homologous protein (CHOP)、Caspase3和GAPDH抗體均購自ProteinTech公司(貨號(hào)分別為:11587-1-AP、24390-1-AP、11170-1-AP、10835-1-AP、15204-1-AP、19677-1-AP、10494-1-AP);Phospho-PERK(Thr980)抗體(Bioss, 貨號(hào):bs-3330R);山羊抗兔二抗(ProteinTech,貨號(hào):SA00001-2);TB Green Premix Ex Taq II、Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TAKARA公司(貨號(hào)分別為:RR820A、9108和RR037A)。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞系使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清、2.0 g/L NaHCO3、100 μg/mL鏈霉素及100 U/mL青霉素),置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5 % CO2、恒溫37 ℃、濕度飽和)中培養(yǎng),每隔2~3天傳代。
2.2 細(xì)胞增殖率檢測 將HSC-3細(xì)胞(接種密度為8×103/mL)接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后,采用不同濃度(10、20、30、40、50 mg/L)的OXA處理細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,OXA處理24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處細(xì)胞的吸光值(A),檢測各組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100 %,最后計(jì)算出藥物的半數(shù)有效濃度(Half maximal inhibitory concentration, IC50)。其中,陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖率記為100 %。
2.3 DAPI染色 將HSC-3細(xì)胞(接種密度為2.4×105/mL)接種于6孔板中,靜置培養(yǎng)24 h后,分別采用0、20、40、80 mg/L OXA處理細(xì)胞,對(duì)照組中加入等體積的培養(yǎng)基。處理24 h后,加入2 mL PBS緩沖液漂洗2次,經(jīng)丙酮固定10 min后,再次用PBS溶液漂洗2次,最后用DAPI溶液避光染色10 min,于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核變化并采集圖像。
2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將HSC-3細(xì)胞(接種密度為3×105/mL)接種于6孔板中,靜置培養(yǎng)24 h后,分別采用0、20、40、80 mg/L OXA處理細(xì)胞,24 h后收集細(xì)胞。用緩沖液漂洗2次,離心后使用Annexin V/PI 進(jìn)行染色。室溫下避光反應(yīng)15 min后,再用適量緩沖液重懸細(xì)胞,置于流式細(xì)胞儀中,檢測活細(xì)胞百分率、早期凋亡細(xì)胞百分率、晚期凋亡細(xì)胞百分率和壞死細(xì)胞百分率。計(jì)算細(xì)胞的總凋亡率,總凋亡率=早期凋亡細(xì)胞百分率+晚期凋亡細(xì)胞百分率+壞死細(xì)胞百分率。
2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT- qPCR) 不同濃度(20、40、80 mg/L)的OXA處理細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)試劑盒步驟,將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件:37 ℃、15 min,85 ℃、5 sec,4 ℃。PCR引物序列如下:GRP78,F:5′-TCAAGTTCTTGCCGTTCAAGG-3′, R:5′-AAATAAGCCTCAGCGGTTTCTT-3′;PERK,F:5′-ACGATGAGACAGAGTTGCGAC-3′R:5′-ATCCAAGGCAGCAATTCTCCC-3′;eIF2α,F:5′-GAAGGCGTATCCGTTCTATCAAC-3′,R:5′-AGCAACATGACGAAGAATGCTAT-3′;ATF4,F:5′-ATGACCGAAATGAGCTTCCTG-3′,R:5′-GCTGGAGAACCCATGAGGT-3′;CHOP,F:5′-CAAGAGGTCCTGTCTTCAG1ATGA-3′,R:5′-TCTGTTTCCGTTTCCTGGTTC-3′;Caspase3,F:5′-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3′,R:5′-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3′;GAPDH,F:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,R:5′-AGGGGCCATCCACGTCTTC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL,包括無菌水7 μL、TB Green Premix Ex Taq II 10 μL 、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA 1 μL。 擴(kuò)增條件:95 ℃ 30 s,(95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s)39個(gè)循環(huán),95 ℃ 10 s。將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參基因,并采用2-ΔΔCt法對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。
2.6 蛋白免疫印跡(Western blot) 采用不同濃度(20、40、80 mg/L)的OXA處理HSC-3細(xì)胞24 h后裂解細(xì)胞,并提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,根據(jù)所需蛋白量取相應(yīng)體積樣品進(jìn)行變性,并完成制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉、孵育一抗(PERK 1∶1 000,p-PERK 1∶1 000,GRP78 1∶2 000,eIF2α 1∶1 000,ATF4 1∶1 000,CHOP 1∶1 000,GAPDH 1∶10 000,Caspase3 1∶1 000)和二抗(1∶2 000)、曝光與顯影。
3.1 OXA抑制HSC-3細(xì)胞的增殖 參考OXA體外誘導(dǎo)其他腫瘤細(xì)胞的凋亡用藥濃度梯度[16-17],本實(shí)驗(yàn)最終采用0、10、20、30、40、50 mg/L的OXA處理HSC-3細(xì)胞,并用 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖率。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,不同濃度的OXA均能抑制HSC-3細(xì)胞的增殖(P<0.05或P<0.01),且均呈劑量依賴性,其中半數(shù)有效抑制濃度IC50為40 mg/L(見圖1),因此本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20、40、80 mg/L濃度的OXA。
*、**:與對(duì)照組比較, P<0.05, P<0.01。圖1 OXA對(duì)HSC-3細(xì)胞的增殖的抑制作用
3.2 OXA促進(jìn)HSC-3細(xì)胞的凋亡 不同濃度(0、20、40、80 mg/L)的OXA處理HSC-3細(xì)胞后,采用DAPI法檢測細(xì)胞核的凋亡情況、Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的總凋亡率。本研究DAPI染色結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)圓形或橢圓形,核完整,染色質(zhì)較為均勻,呈淡藍(lán)色;經(jīng)OXA處理后部分細(xì)胞核開始固縮,產(chǎn)生部分藍(lán)色熒光及凋亡小體(紅色圓圈所示),呈現(xiàn)較為典型的細(xì)胞凋亡的核形態(tài)特征,且隨著OXA劑量的增加,細(xì)胞核凋亡情況進(jìn)一步加劇(見圖2)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,20、40、80 mg/L OXA組細(xì)胞總凋亡率分別為(4.5±0.4、12.9±0.7、20.3±0.6)%,均顯著高于對(duì)照組(1.2±0.2)%,(P<0.01,見圖3)。以上結(jié)果表明,OXA促進(jìn)了HSC-3細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
A:對(duì)照組;B~D:分別為奧沙利鉑20、40、80mg/L組;×200。圖2 DAPI染色觀察HSC-3細(xì)胞核凋亡情況
B1:壞死細(xì)胞百分率;B2:晚期凋亡細(xì)胞百分率;B3:活細(xì)胞百分率;B4:早期凋亡細(xì)胞百分率;**:與對(duì)照組比較, P<0.01。圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測HSC-3細(xì)胞的凋亡率
3.3 OXA激活HSC-3細(xì)胞中ERS及其PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路 q-RT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各組OXA處理HSC-3細(xì)胞24 h后,mRNA水平上GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase3 表達(dá)均呈上調(diào)趨勢,劑量依賴,且高劑量組均顯著上調(diào)(見圖4)。Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,各組OXA處理HSC-3細(xì)胞24 h后,GRP78、p-PERK/PERK、ATF4、CHOP、Cleaved-caspase 3/Pro-caspase 3蛋白表達(dá)水平均呈上調(diào)趨勢,尤其是高劑量組均顯著上調(diào),eIF2α蛋白中劑量組顯著上調(diào),而高劑量組顯著下調(diào)(見圖5)。以上結(jié)果表明,OXA激活了HSC-3細(xì)胞中ERS的水平,同時(shí)激活了ERS途徑中PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路,尤其是標(biāo)志性分子CHOP的上調(diào),進(jìn)一步促進(jìn)Caspase 3的剪切激活,最終誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
**:與對(duì)照組比較, P<0.01。圖4 OXA對(duì)細(xì)胞GRP78、PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、Caspase 3 轉(zhuǎn)錄水平的影響
*、**:分別與對(duì)照組比較, P<0.05、 P<0.01。圖5 OXA對(duì)細(xì)胞GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、ATF4、CHOP、Pro-Caspase3、Cleaved-Caspase 3蛋白水平的影響
腫瘤進(jìn)程與細(xì)胞凋亡有關(guān),細(xì)胞凋亡的抑制會(huì)阻礙腫瘤發(fā)生發(fā)展,因此研究細(xì)胞凋亡相關(guān)通路及蛋白成為尋找腫瘤治療靶點(diǎn)的主要途徑之一。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞中具有分泌、合成、折疊和修飾蛋白功能的細(xì)胞器,在多種因素刺激下會(huì)產(chǎn)生和聚集大量錯(cuò)誤折疊甚至未折疊的蛋白質(zhì),從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言,缺糖、酸中毒及嚴(yán)重缺氧將伴發(fā)ERS的產(chǎn)生[18],此時(shí)腫瘤細(xì)胞會(huì)激發(fā)未折疊蛋白反應(yīng),避免自身凋亡[19];然而當(dāng)發(fā)生持續(xù)性、長久性的ERS時(shí),腫瘤細(xì)胞亦會(huì)發(fā)生凋亡。因此ERS感受器及其下游信號(hào)通路的異常激活已成為腫瘤生長、轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療、靶向治療和免疫治療反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[20]。
大量研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制中占有重要地位,也是口腔腫瘤治療的靶點(diǎn)之一[21-23]。在臨床OSCC病理組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78在蛋白水平上的表達(dá)量與臨床病理和預(yù)后存在一定的相關(guān)性,可作為潛在的標(biāo)記物用以判斷其惡性程度以及預(yù)測其預(yù)后[24]。本研究結(jié)果顯示,OXA對(duì)HSC-3細(xì)胞的生長增殖具有抑制作用,且呈一定的劑量依賴性,并促進(jìn)GRP78的表達(dá)升高,與OSCC臨床病理研究結(jié)果基本一致,說明此時(shí)發(fā)生ERS。如前所述,腫瘤細(xì)胞會(huì)通過未折疊蛋白反應(yīng)避免細(xì)胞凋亡。ERS誘導(dǎo)下產(chǎn)生的未折疊蛋白反應(yīng)主要有以下3種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:肌醇激酶1-X盒結(jié)合蛋白1、PERK-eIF2α-ATF4和活性轉(zhuǎn)錄因子6通路[25]。而其中,PERK-eIF2α-ATF4通路也是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)通路之一[26]。因此,該通路也可能成為調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)I型跨膜蛋白,屬于真核細(xì)胞起始因子2蛋白激酶家族。在非ERS時(shí),PERK能夠與GRP78形成復(fù)合物;當(dāng)發(fā)生ERS時(shí),GRP78與PERK發(fā)生解離,PERK自身磷酸化以活化。PERK活化后可以誘導(dǎo)ATF4的轉(zhuǎn)錄,活化的ATF4可誘導(dǎo)ERS下游標(biāo)志性分子CHOP的產(chǎn)生,進(jìn)一步激活Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終激活半胱天冬酶3(Caspase 3)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[27]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明,在OXA作用下能夠誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡,其分子機(jī)制與ERS通路PERK-eIF2α-ATF4有關(guān),表現(xiàn)在PERK、eIF2α、ATF4等關(guān)鍵分子表達(dá)上調(diào),同時(shí)促進(jìn)了其PERK的磷酸化水平、CHOP的表達(dá)和Caspase 3發(fā)生剪切激活。
綜上所述,OXA能夠抑制口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞的生長增殖,同時(shí)促進(jìn)其細(xì)胞凋亡過程,其分子機(jī)制可能主要是通過上調(diào)其GRP78的表達(dá),激活ERS中PERK-eIF2α-ATF4通路,促進(jìn)ERS下游分子CHOP的表達(dá),進(jìn)一步激活Caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終誘導(dǎo)Caspase-3發(fā)生剪切激活,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
遵義醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2023年1期