circ-ITCH抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究*

蔡沾煥,陳 升,蘇學(xué)良

儋州市人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬儋州醫(yī)院普外科，海南儋州 571700

結(jié)直腸癌(CRC)是全世界最常見的惡性腫瘤之一，占男性惡性腫瘤發(fā)病率的第二位和女性的第三位，以及男性惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三位和女性的第四位[1]。隨著診斷和治療技術(shù)的不斷提高，CRC患者的五年生存率有所改善，但是腫瘤患者的五年生存預(yù)后與疾病的進(jìn)展階段高度相關(guān)。晚期CRC患者通常伴有腫瘤轉(zhuǎn)移，五年的存活率非常低[2]。因此，本文迫切需要進(jìn)一步研究CRC的發(fā)病機(jī)制和腫瘤轉(zhuǎn)移中的未知分子機(jī)制。環(huán)狀RNA(CircRNA) Itchy E3泛素蛋白連接酶(Circ-ITCH)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制CircRNA之一，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Circ-ITCH在常見惡性腫瘤乳腺癌[3]和消化道常見惡性腫瘤胃癌、肝細(xì)胞肝癌等[4-5]多種腫瘤中表達(dá)水平降低，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，Circ-ITCH是否抑制CRC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力未知。Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)的異常激活與人類惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，尤其是CRC[6]。Circ-ITCH在乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌和甲狀腺乳頭狀癌中通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抑癌作用[3,5]，提示Circ-ITCH在CRC中可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)。因此本文致力于研究Circ-ITCH通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制CRC的惡性進(jìn)展，以期發(fā)現(xiàn)Circ-ITCH作為干預(yù)CRC治療分子靶點(diǎn)的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料 納入在本院確診的CRC患者82例?；颊呓M織標(biāo)本新鮮，立即采用液氮凍存。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 接受根治性疾病的CRC患者，包括收集腫瘤組織和相鄰的正常組織(距離腫瘤5 cm)； (2) 病理明確為CRC ；(3) 患者臨床資料包括年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤分級、TNM分期的臨床參數(shù)及預(yù)后資料；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受過全身治療或局部治療；(2) 合并另一種惡性腫瘤； (3)患有嚴(yán)重威脅生命健康的基礎(chǔ)疾病。本研究根據(jù)赫爾辛基宣言獲得所有受試者書面知情同意書，并已經(jīng)獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 Trizol 試劑(15596-018)和Lipofectamine 2000(11668)試劑購自美國Invitrogen公司；Circ-ITCH和GAPDH引物均由廣州Ribobio公司設(shè)計(jì)和合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500)購自美國Promega公司；Sybr Green PCR試劑盒(RR820A)購自日本Takara公司；SW480、SW620和HT29及正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基(61870036)和胎牛血清(10099141C)均購自Thermo Fisher Scientific公司；Leibovitz′s L-15(MFCD00217482)購自美國sigma公司；McCoy′ 5A培養(yǎng)基(FS-5045P)購自上海撫生試劑公司；胰酶(T8150)、青霉素(P8010)、鏈霉素(3810-74-0)、CCK8試劑(CA1210)和細(xì)胞裂解緩沖液(DgcX8ocR)購自北京索萊寶科技有限公司；空載質(zhì)粒和Circ-ITCH過表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購自廣州Ribobio公司；Transwell小室(3413)購自美國Corning公司；增強(qiáng)型 ECLTM檢測試劑盒(KGP1128)購自中國南京KeyGene公司；BCA蛋白檢測試劑盒(23227)購自美國Thermo試劑公司；PVDF膜(1620177)購自美國BioRad公司；β-catenin(ab32572)cyclinD1(ab16663)、cMyc(ab32072)、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP，ab92536)2、MMP9(ab76003)、GAPDH(ab8245)和兔二抗(ab32072)、鼠二抗(ab279289)均購自英國Abcam公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用Trizol試劑從組織中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并根據(jù)說明書進(jìn)行RNA至 cDNA的逆轉(zhuǎn)錄。以 cDNA為模板使用Sybr Green PCR試劑盒配制PCR反應(yīng)體系，選擇GAPDH作為對照，采用 Applied Biosystems 7900HT 序列檢測系統(tǒng)檢測Circ-ITCH和GAPDH 的表達(dá)水平。 使用2-ΔΔCt方法量化Circ-ITCH表達(dá)。引物序列：Circ-ITCH 正向引物：5′-GTT GGT CAA TCG CCT GCT A-3′，反向引物：5′-GGT CCC GCA CAG GGG TA-3′;GAPDH 正向引物：5′-TCA AGA AGG TGG TGA AGC A-3′ ，反向引物：5′-AGG TGG AGG AGT GGG TGT-3′。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 CRC細(xì)胞SW480和NCM460在RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SW620細(xì)胞在Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HT29在McCoy′ 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)。各種培養(yǎng)基中均含有10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素和100 mg/mL的鏈霉素，放置在37 ℃含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿后采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中Circ-ITCH的表達(dá)水平。

選擇低表達(dá)Circ-ITCH的SW620細(xì)胞，計(jì)數(shù)2×105個(gè)/孔，接種至6孔板中培養(yǎng)。隨機(jī)分為對照組(NC組)和實(shí)驗(yàn)組(Circ-ITCH組)。細(xì)胞貼壁后，采用Lipofectamine 2000按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，首先將Lipofectamine 2000 試劑與培養(yǎng)基混勻后靜止5 min，然后分別與空載質(zhì)粒和Circ-ITCH過表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒混合后，轉(zhuǎn)染至NC組和Circ-ITCH組中。放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染48 h，qRT-PCR檢測Circ-ITCH 過表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑8(CCK8)實(shí)驗(yàn) 采用CCK8試劑檢測細(xì)胞增殖能力。收集NC組和Circ-ITCH組細(xì)胞，在200 μL培養(yǎng)基中以2×103個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔板細(xì)胞中，設(shè)置24、48和72 h，并每組設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔，放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)更換100 μL 培養(yǎng)基和10 μL CCK8試劑，混勻后在37 ℃下處理2 h。采用酶標(biāo)儀檢測各細(xì)胞在450 nm處測定吸光度值(A值)。

1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。收集NC組和Circ-ITCH組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3次后，在100 μL無血清培養(yǎng)基中以1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種至24孔板中的Transwell小室上。24 孔板的下室中加入含有500 μL的10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，放置在 37 ℃含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。取出Transwell室，棄去孔中的培養(yǎng)基并用PBS洗滌。 然后，將細(xì)胞用甲醇固定30 min并用0.1%晶體染色20 min。使用棉拭子輕輕擦拭上未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.3.5TOP/FOP 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 采用TOP/FOP 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。收集NC組和Circ-ITCH組細(xì)胞，在200 μL培養(yǎng)基中以2×103個(gè)細(xì)胞的密度接種至96孔板細(xì)胞中，采用PRL-TK質(zhì)粒(每孔10 ng)和TOP/FOP質(zhì)粒(每孔200 ng)共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告器測定系統(tǒng)分析各組細(xì)胞中熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度。

1.3.6Western-blot實(shí)驗(yàn) 采用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解RIPA緩沖液提取各組細(xì)胞中的細(xì)胞總蛋白，并采用BCA 蛋白檢測試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)煮沸變性后，通過SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在用5%的非脂肪牛奶封閉后，將膜在4 ℃下與初級抗體一起溫育過夜。HRP標(biāo)記的二抗體用于在室溫下孵育2 h。通過增強(qiáng)型 ECLTM檢測試劑盒可視化蛋白質(zhì)條帶。一抗抗體稀釋液∶抗β-catenin(1∶500)，抗cyclinD1(1∶1 000)，抗cMyc(1∶500)，抗MMP2(1∶1 000)，抗MMP9(1∶1 000)，抗GAPDH(1∶1 000)。

2 結(jié) 果

2.1Circ-ITCH表達(dá)與CRC患者病理參數(shù)的關(guān)系 qRT-PCR檢測Circ-ITCH在CRC組織中的表達(dá)水平(1.24±0.65)低于在癌旁組織中的表達(dá)水平(1.56±0.78)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.643,P=0.010)，見圖1A。t檢驗(yàn)分析Circ-ITCH與CRC患者病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示高表達(dá)水平Circ-ITCH與CRC患者年齡、性別、腫瘤最大徑、分化程度均無關(guān)(P>0.05)，與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)(P<0.05)，見圖1B～C和表1。

注：A為Circ-ITCH在CRC和癌旁組織中的表達(dá)，與癌旁組織相比，*P<0.05；B為Circ-ITCH在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC組織中的表達(dá)，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CRC組織相比，*P<0.05；C為Circ-ITCH在不同TNM分期CRC組織中的表達(dá)，與TNM Ⅰ～Ⅱ期組織相比，*P<0.05。圖1 qRT-PCR檢測結(jié)果

表1 Circ-ITCH蛋白在CRC組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.2Circ-ITCH的表達(dá)水平與CRC患者預(yù)后的關(guān)系 Log-Rank法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯示與低表達(dá)Circ-ITCH的CRC患者相比，高表達(dá)Circ-ITCH的CRC患者預(yù)后較差(χ2=4.195，P=0.041)，見圖2。

圖2 Log-Rank檢驗(yàn)分析Circ-ITCH在CRC組織中表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

2.3Circ-ITCH 在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測Circ-ITCH在SW480、SW620和HT29及正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460中的表達(dá)水平分別為(0.31±0.10)、(0.18±0.04)、(0.53±0.08)和(1.00±0.01)，Circ-ITCH在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平低于在正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460中的表達(dá)水平，在SW620細(xì)胞中的表達(dá)水平最低(P<0.041)，見圖3A。Circ-ITCH在NC組和Circ-ITCH組SW620細(xì)胞中的表達(dá)分別為(1.00±0.01)、(5.49±1.10)，Circ-ITCH在Circ-ITCH組SW620細(xì)胞中的表達(dá)水平增加(t=5.821，P=0.004)，見圖3B。

注：A為Circ-ITCH在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平低于在正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460中的表達(dá)水平，與NCM460組相比，*P<0.05；B為與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細(xì)胞中Circ-ITCH的表達(dá)水平增加，與NC組相比，*P<0.05。圖3 qRT-PCR檢測結(jié)果

2.4細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK8檢測顯示與NC組相比，Circ-ITCH組CRC細(xì)胞SW620的增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

與NC組相比，*P<0.05。圖4 細(xì)胞增殖能力檢測

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測 采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測顯示NC組和Circ-ITCH組SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)目分別為(64.67±4.64)個(gè)和(23.67±4.99)個(gè)。與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.508，P=0.001)，見圖5。

注：與NC組相比，*P<0.05。圖5 細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測

2.6Wnt/β-catenin信號(hào)通路檢測 采用TOP/FOP 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測顯示NC組和Circ-ITCH組SW620細(xì)胞中TOP/FOP 雙熒光素酶活性分別為(0.99±0.03)個(gè)和(0.47±0.08)個(gè)。與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.220，P<0.001)，見圖6。

注：與NC組相比,*P<0.05。圖6 Wnt/β-catenin信號(hào)通路檢測

2.7Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測顯示與NC組相比，Circ-ITCH組SW620細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin核表達(dá)水平及其下游增殖相關(guān)蛋白cyclinD1、cMyc和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

注：與NC組相比，*P<0.05。圖7 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測

3 討 論

在人類基因組中存在大量的非編碼RNA，并且非編碼RNA和人類疾病，尤其是惡性腫瘤之間存在的關(guān)系始終是研究的熱點(diǎn)。CircRNA是非編碼RNA的重要成員，通過替代剪接形成內(nèi)源性RNA，具有共價(jià)閉合的環(huán)形結(jié)構(gòu)，不存在3′和5′末端，使得CircRNA非常穩(wěn)定，不易被內(nèi)切核酸酶降解[7]。目前已經(jīng)在真核生物中檢測到超過20 000個(gè)CircRNA，并且隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，在不同的組織中越來越多的CircrNA被鑒定，其在疾病發(fā)展中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。目前研究結(jié)果已經(jīng)表明CircRNA參與了幾乎所有類型惡性腫瘤的發(fā)展，同時(shí)CircRNA可能是惡性腫瘤新的潛在生物標(biāo)志物和治療目標(biāo)[8]。然而大多數(shù)CircRNA在惡性腫瘤進(jìn)展中的功能仍然是未知的，因此研究CRC惡性進(jìn)展中表達(dá)異常并發(fā)揮重要功能的CircRNA，對尋求抗CRC治療的分子靶點(diǎn)具有重要意義。

Circ-ITCH是一種從位于20號(hào)Q11.22染色體上的基因Itchy E3泛素蛋白質(zhì)連接酶的幾個(gè)外顯子產(chǎn)生的CircrNA，由BERNASSOL等[9]首次研究并報(bào)道。Circ-ITCH在乳腺癌及膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)受到抑制，低表達(dá)Circ-ITCH的乳腺癌和膀胱癌患者的存活率降低[3,10]。WANG等[11]報(bào)道Circ-ITCH低表達(dá)水平與前列腺癌PSA、腫瘤分期和GLEASEN分?jǐn)?shù)高度相關(guān)。但是Circ-ITCH在CRC中的表達(dá)及臨床意義未見有報(bào)道，本文收集CRC組織標(biāo)本，檢測結(jié)果顯示Circ-ITCH在CRC組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織，并且統(tǒng)計(jì)分析顯示Circ-ITCH低表達(dá)水平與CRC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，且Circ-ITCH低表達(dá)水平的CRC患者預(yù)后較差，提示Circ-ITCH在CRC中發(fā)揮抑癌作用，可作為CRC患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。同時(shí)一項(xiàng)Meta分析顯示Circ-ITCH低表達(dá)惡性腫瘤患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤最大徑更大、TNM分期更晚、整體存活率更差，表明Circ-ITCH低表達(dá)與惡性腫瘤侵襲性臨床病理特征和各種不利結(jié)果相關(guān)，可以用作人類惡性腫瘤中的分子治療靶標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物[12]。這表明研究Circ-ITCH在CRC中發(fā)揮具體的生物學(xué)功能具有重要的意義。在乳腺癌、胃癌和卵巢癌等惡性腫瘤中Circ-ITCH抑制細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[3-4,13]，那么Circ-ITCH是否抑制CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。首先檢測Circ-ITCH在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460，并且選擇表達(dá)水平最低的CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)染Circ-ITCH過表達(dá)質(zhì)粒，CCK8和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)Circ-ITCH后，CRC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力降低，表明Circ-ITCH抑制CRC的惡性進(jìn)展，與其他惡性腫瘤中的報(bào)道一致[3-4,13]。但是Circ-ITCH在CRC中發(fā)揮作用的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

CircRNA廣泛參與形成RNA蛋白復(fù)合物的形成，其充當(dāng)miRNA海綿是作為調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的重要作用機(jī)制，除此以外CircRNA可以通過調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)途徑和影響基因的表達(dá)發(fā)揮作用[8]。在膀胱癌中Circ-ITCH通過調(diào)節(jié)miR-17和miR-224靶基因P21和PTEN在體外和體內(nèi)抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[10]。而Circ-ITCH抑制乳腺癌、肝細(xì)胞肝癌和甲狀腺乳頭狀癌惡性進(jìn)展的作用機(jī)制均為抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路[3,7]。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)增殖、分化和細(xì)胞命運(yùn)對腸道穩(wěn)態(tài)進(jìn)行至關(guān)重要的作用，其在CRC中異常激活，促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展，是抗CRC治療的重要關(guān)鍵靶點(diǎn)[6]。TOP/FOP雙熒光素酶是檢測Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的重要手段，本文通過TOP/FOP雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Circ-ITCH后，CRC細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性增加。研究顯示β-catenin從細(xì)胞質(zhì)中移至細(xì)胞核中，是激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵，且核β-catenin蛋白表達(dá)升高被認(rèn)為是CRC侵襲的標(biāo)志，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)的靶標(biāo)，包括增殖相關(guān)蛋白cMyc，Cyclin D1和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力[14-15]。本文采用Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測顯示過表達(dá)Circ-ITCH后，CRC細(xì)胞中核β-catenin蛋白表達(dá)水平降低，以及增殖相關(guān)蛋白cMyc，cyclin D1和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9表達(dá)水平均降低。本研究表明Circ-ITCH 通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制CRC的惡性進(jìn)展。

綜上所述，Circ-ITCH在CRC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平降低，與CRC患者不良病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)。Circ-ITCH 通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制CRC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。Circ-ITCH具有作為CRC不良預(yù)后生物標(biāo)志物和抗腫瘤治療分子靶點(diǎn)的潛力。