黏蛋白乳化劑在1 418例細(xì)胞蠟塊制備技術(shù)中的應(yīng)用研究*

吳燕杏，毛榮軍，莫超華，韓福蘭，曾 敏，陳增偉

佛山市中醫(yī)院病理科，廣東佛山 528000

細(xì)胞病理學(xué)技術(shù)是一種疾病的病理學(xué)診斷和研究方法，該方法具有操作簡便、患者痛苦少、易于接受等優(yōu)點(diǎn)。早期的細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)，主要是細(xì)胞涂片法和離心后直接取細(xì)胞沉淀物包埋法(如離心管沉淀法、冷凍細(xì)胞塊制備法、試管包埋法、載玻片細(xì)胞聚集法等)[1]。劉芳等[2]研究報道，細(xì)胞涂片法易出現(xiàn)涂片厚薄不一，細(xì)胞重疊和細(xì)胞松散，背景較深等現(xiàn)象，造成診斷困難。TOBAR等[3]研究認(rèn)為，離心后直接取細(xì)胞沉淀物包埋法由于沒有介質(zhì)把細(xì)胞凝聚在一起，對細(xì)胞量少的標(biāo)本制作效果極差。而對細(xì)胞量較多的標(biāo)本也容易在切片過程中出現(xiàn)掉片，造成染色不良，影響病理診斷結(jié)果。

近年來，使用瓊脂、蛋清、凝血酶等制備細(xì)胞塊的技術(shù)陸續(xù)被報道，這些介質(zhì)材料聚攏并提高了細(xì)胞數(shù)量，但是存在一定的局限，技術(shù)上改變了組織固定、脫水、透明、浸蠟的時間，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)條件需要摸索[4]，也可能會對后續(xù)的免疫組織化學(xué)染色(IHC)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響[5]。迄今為止，沒有一種“金標(biāo)準(zhǔn)”的介質(zhì)材料和制作細(xì)胞塊的操作流程被指南或者專家共識所認(rèn)可。本研究的黏蛋白是一種不含任何分子結(jié)構(gòu)的介質(zhì)材料，本研究收集了1 418例非婦科細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，探討了黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊在蘇木素伊紅(HE)染色、IHC的效果和診斷價值，旨在為推廣一種操作便捷、成本低、富集率高、形態(tài)好、診斷價值高的細(xì)胞塊制備技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選取2018年7月至2022年1月本院送檢的1 418例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本為研究對象，使用黏蛋白乳化劑作為基質(zhì)材料制備細(xì)胞塊，制作石蠟切片和HE染色，由兩位資深病理醫(yī)師對細(xì)胞塊作出組織學(xué)診斷，對其中細(xì)胞塊診斷為惡性的285例標(biāo)本再次切片并進(jìn)行相關(guān)免疫組化檢測2 138項?；颊吣挲g19.86～85.61歲，平均(49.85±18.32)歲。1 418例標(biāo)本按照細(xì)胞標(biāo)本來源的不同分為脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本1 183例(83.43%)和細(xì)針針吸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本235例(16.57%)。脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本分為胸腹腔積液572例(48.35%)、乳腺溢液153例(12.93%)、痰液128例(10.82%)、尿液104例(8.79%)、支氣管鏡灌洗液97例(8.20%)、盆腔積液75例(6.34%)、心包積液54例(4.57%)。細(xì)針針吸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本分為甲狀腺127例(54.04%)，乳腺85例(36.17%)，淋巴結(jié)23例(9.79%)。細(xì)胞塊病理診斷為惡性的285例標(biāo)本按照病理類型分為腺癌115例(40.36%)，乳頭狀癌88例(30.87%)，轉(zhuǎn)移癌59例(20.70%)，鱗癌23例(8.07%)。1 418例患者均有術(shù)后病理診斷結(jié)果作為對照。本研究獲得患者知情同意和本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2儀器與試劑 ASP6025全自動真空組織脫水機(jī)、HistoCore Arcadia H 熱石蠟包埋機(jī)、RM2235手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、ST5020多功能染色機(jī)購自德國徠卡儀器有限公司。JH-18S全自動免疫組化染色儀購自上海杰浩生物技術(shù)有限公司。TLXJ-IIC 低速臺式大容量離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠。BPG-9070A精密鼓風(fēng)干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。黏蛋白(貨號：FJ702510，CAS：84082-64-4)購自安徽酷爾生物工程有限公司。HE染色液購自無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)有限公司。免疫組織化學(xué)染色一抗和二抗購自上海杰浩生物技術(shù)有限公司。甲醛溶液購自廣州維格斯生物科技有限公司。乙醇購自廣東光華科技股份有限公司。二甲苯購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2方法

1.2.1黏蛋白乳化劑制備細(xì)胞塊的方法 非婦科標(biāo)本放置在標(biāo)準(zhǔn)50 mL錐形離心管中，2 500 r/min離心5min,棄上清液(對于細(xì)胞量不足的標(biāo)本，可多次重復(fù)離心；對于血性標(biāo)本，可加入紅細(xì)胞裂解液30 mL后進(jìn)行離心)，加入甲醛-乙醇(AF)液5 mL，2 500 r/min離心5 min,棄上清液后保留1 mL沉淀物，加入10%黏蛋白乳化劑250 μL(黏蛋白乳化劑與標(biāo)本的混合比例為1∶4)，混勻,2 500 r/min離心5 min,棄上清液，離心管底部可見細(xì)胞塊呈膠體狀態(tài)，用塑料鏟輕輕取出沉淀細(xì)胞塊放入包埋盒。

1.2.2HE染色及切片質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞塊參考中華醫(yī)學(xué)會推薦的常規(guī)石蠟切片制備程序進(jìn)行固定、脫水、透明、包埋、切片和HE染色[6]。常規(guī)石蠟包埋-HE染色切片質(zhì)量的評價標(biāo)準(zhǔn)[7]，包含：組織切面完整度和切片切面數(shù)(10分)、切片厚薄度和均勻度(10分)、切片完整度(10分)、切片平坦度(10分)、切片純凈度(10分)、切片整潔度(10分)、切片透明度(10分)、染色清晰度(10分)、裱片位置恰當(dāng)度(10分)、切片標(biāo)簽貼放正確度(10分)。優(yōu)質(zhì)片：≥90分；優(yōu)良片：75～89分；基本合格片：60～74分；不合格片：≤59分。切片優(yōu)良率=[(優(yōu)質(zhì)片數(shù)+優(yōu)良片數(shù))/總切片數(shù)]×100%]。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色方法及評價標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)染色流程：石蠟切片烤片(68 ℃，15 min)，脫蠟至水，根據(jù)一抗的要求，對組織進(jìn)行抗原修復(fù),切片上滴加0.3%H2O2，孵育10 min，PBS沖洗，滴加一抗，孵育60 min，PBS沖洗,滴加二抗，孵育15 min，PBS沖洗，滴加DAB 顯色試劑，HE復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，二甲苯透明，中性樹膠封片。評價標(biāo)準(zhǔn)[8]，包含(1)優(yōu)質(zhì)片：定位精準(zhǔn)，背景清晰，著色恰當(dāng)，呈特異性著色；(2)優(yōu)良片：定位較精準(zhǔn)，背景較清晰，著色較合理，有少量非特異性染色；(3)不合格片：抗原彌散現(xiàn)象嚴(yán)重，著色不合理，出現(xiàn)大量非特異性染色。切片優(yōu)良率=[(優(yōu)質(zhì)片數(shù)+優(yōu)良片數(shù))/總切片數(shù)]×100%]。

2 結(jié) 果

2.1黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊及切片的外觀大體情況 肉眼可見，黏蛋白乳化劑制備的1 418例非婦科細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的細(xì)胞塊制作成功率是100.00%，細(xì)胞塊外觀呈圓形果凍樣膠體的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞聚集成團(tuán)、硬度適中，見圖1A。黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊切片外觀完整、呈規(guī)則的圓形結(jié)構(gòu)、疏松度適中，見圖1B。

注：A為黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊外觀；B為黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊石蠟切片外觀。圖1 黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊及石蠟切片外觀情況

2.2黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊石蠟切片HE染色和IHC染色的顯微鏡下情況 顯微鏡下可見，黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊能連續(xù)均勻切片，HE染色背景清晰，核漿著色鮮艷，紅藍(lán)分明，對比清晰，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細(xì)菌可呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。細(xì)胞均勻分布于圓形區(qū)域內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)立體感，見圖2A1、A2。

注：A1為甲狀腺乳頭狀癌，上皮樣細(xì)胞呈腺樣排列，細(xì)胞排列擁擠，細(xì)胞核大，核膜增厚、不規(guī)則，核染色質(zhì)淡染，可見核溝。 B1為CK19示瘤細(xì)胞胞質(zhì)彌散強(qiáng)陽性。A2為單核組織細(xì)胞源性細(xì)胞，大量的胞質(zhì)紅染的上皮樣細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，胞漿內(nèi)可見空泡，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞核偏位。B2為大部分上皮樣細(xì)胞CD68陽性。圖2 黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊石蠟切片HE染色(HE法×100)和IHC染色(SP二步法×100)的顯微鏡下情況

顯微鏡下可見，黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊石蠟切片厚薄均一，IHC染色的背景干凈，呈特異性染色。主要表現(xiàn)在兩方面：第一，特異反應(yīng)產(chǎn)物分布于特定的部位，即具有結(jié)構(gòu)性。第二，特異性產(chǎn)物在同一切片上呈現(xiàn)不用程度陽性染色結(jié)果，即具有細(xì)胞性。見圖2B1、B2。

2.3黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊HE染色和IHC染色切片優(yōu)良率 HE染色切片共1 418張，分別為：優(yōu)質(zhì)片1 142張(80.54%)、優(yōu)良片261張(18.40%)、基本合格片12張(0.85%)、不合格片3張(0.21%)，HE 染色切片優(yōu)良率為98.94%。IHC染色加片為2 138張，分別為：優(yōu)質(zhì)片1 729張(80.87%)、優(yōu)良片394張(18.43%)，不合格片15張(0.70%)，IHC染色切片優(yōu)良率為99.30%。

2.4黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊的診斷效能 本文以患者術(shù)后病理診斷為癌的294例標(biāo)本作為金標(biāo)準(zhǔn)的陽性病例，1 124例病理學(xué)診斷結(jié)果為非癌的標(biāo)本作為金標(biāo)準(zhǔn)的陰性病例。黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊診斷靈敏度為96.94%；特異度為100.00%；符合率為99.37%；約登指數(shù)為0.9694。

3 討 論

診斷細(xì)胞學(xué)是通過采集病變處的細(xì)胞，染色后觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化來診斷和研究臨床疾病的一門學(xué)科。細(xì)胞塊制片是早期的涂片診斷的進(jìn)一步優(yōu)化，該技術(shù)能為細(xì)胞學(xué)的病理診斷提供更優(yōu)質(zhì)的技術(shù)，是臨床疾病診斷的強(qiáng)有力支持依據(jù)。隨著臨床送檢標(biāo)本的日益多樣化和復(fù)雜性，給傳統(tǒng)的涂片技術(shù)提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。簡單的離心沉淀細(xì)胞塊制作技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，但是，該方法存在諸多不足，如：細(xì)胞較多的標(biāo)本，容易發(fā)生細(xì)胞相互擠壓嚴(yán)重的現(xiàn)象，影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)的辨別；細(xì)胞量少的標(biāo)本，非常容易發(fā)生細(xì)胞丟失的現(xiàn)象，反復(fù)的離心也不能制成細(xì)胞塊[9]。國內(nèi)外學(xué)者開始嘗試在離心沉淀的細(xì)胞中加入不同的基質(zhì)材料，取得一定的進(jìn)步，但仍然存在較多問題，如：操作過程復(fù)雜、制片困難、切片掉落、細(xì)胞形態(tài)變異、背景較深、嚴(yán)重影響病理診斷結(jié)果[10-11]。因此，目前仍然缺乏一種細(xì)胞塊的制作的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法。

MELEGA 等[12]研究報道，瓊脂、HistoGel和Collodio等基質(zhì)材料制備的細(xì)胞塊法操作過程繁瑣，后續(xù)固定、脫水、透明、浸蠟等實(shí)驗(yàn)條件較復(fù)雜，制作的石蠟切片質(zhì)量不穩(wěn)定。與之不同的是，本研究細(xì)胞塊制作程序較為便捷，無須改變原有的處理組織程序和使用特殊的機(jī)器，黏蛋白價格適中。本研究的1 418例非婦科細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的細(xì)胞塊均制作成功說明了黏蛋白乳化劑制備細(xì)胞塊的富集效率較高，細(xì)胞丟失較少。與陳淑霞等[13]報道的25例眼內(nèi)玻璃體液細(xì)胞蠟塊制作成功率是100.00%的研究結(jié)論一致。但是，本研究納入的病例數(shù)較多，標(biāo)本來源更廣，囊括了臨床送檢的胸腹腔積液、乳腺溢液、痰液、尿液、支氣管鏡灌洗液、盆腔積液、心包積液、甲狀腺、乳腺和淋巴結(jié)穿刺等標(biāo)本。因此，本研究結(jié)果更嚴(yán)謹(jǐn)，臨床適用性更強(qiáng)。筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn)，對于部分細(xì)胞量較少，第一次離心后肉眼觀無明顯沉淀物的標(biāo)本，建議適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速至3 000 r/min，重復(fù)離心3～5次，直至滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊石蠟切片HE染色和IHC染色的形態(tài)學(xué)效果符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，均能滿足三甲醫(yī)院的病理學(xué)診斷的需求。胡沙沙等[14]使用一種專用包埋盒、專用的細(xì)胞塊數(shù)控離心包埋機(jī)和特殊的“膠”制作了300例細(xì)胞塊。張巧全等[15]使用乙醇為還原劑，戊二醛為固定劑，4 ℃條件下制備了26例腦膜癌的細(xì)胞塊。高麗麗等[16]使用試劑盒制備了40例胸腹腔積液脫落細(xì)胞標(biāo)本的細(xì)胞塊。上述文獻(xiàn)報道的細(xì)胞塊石蠟切片HE染色和IHC染色形態(tài)學(xué)染色效果與本研究的基本一致。不同的是，本研究使用的是自行配制的黏蛋白乳化劑，非商品化的試劑盒，亦無須購買特殊的設(shè)備，檢測成本低，操作流程簡便，染色效果佳，有利于在各個層次醫(yī)療單位病理科推廣使用。值得注意的是，PARK等[17]報道瓊脂水平在2.00%～5.00%制備的細(xì)胞塊硬度適中，細(xì)胞塊與蠟塊融合良好。而本研究摸索的黏蛋白乳化劑最佳濃度是10.00%，即黏蛋白5 g∶50 mL蒸餾水。本研究發(fā)現(xiàn)黏蛋白濃度太低，細(xì)胞塊無法凝結(jié)和包埋。反之，黏蛋白濃度太高，細(xì)胞塊會偏硬和偏脆，細(xì)胞塊和石蠟融合不好，其間部分石蠟松浮，在切片時就使蠟片，造成切片質(zhì)量下降明顯。

本文的細(xì)胞塊HE染色和IHC染色切片優(yōu)良率均大于98.00%，達(dá)到了三甲醫(yī)院的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。鄧雪琴等[18]用小牛血去蛋白凝膠試劑盒制備了5例胸腹腔積液的細(xì)胞蠟塊，其HE染色和CK7、TTF1染色均取得了理想的效果。而本研究嚴(yán)格按照病理專業(yè)醫(yī)療質(zhì)量控制指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)[19]，對HE染色和IHC染色切片優(yōu)良率做了數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)反映的是黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊歷經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色和IHC染色和封片后的效果。

本文以患者術(shù)后病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合靈敏度、特異度、符合率和約登指數(shù)等診斷評價指標(biāo)，綜合評估認(rèn)為：黏蛋白乳化劑制備細(xì)胞塊的診斷效能較高。其操作過程較簡單，成本低，細(xì)胞塊制作效果佳，可滿足HE和IHC染色診斷的需求，可對細(xì)胞塊進(jìn)行連續(xù)切片，可長期保存，與組織學(xué)診斷的符合率高，應(yīng)用前景廣闊。尤其是對于一些組織學(xué)無法獲得標(biāo)本的疾病的早期診斷，黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊是組織學(xué)診斷的有益補(bǔ)充。

當(dāng)然，本研究也存在一些不足，本研究的標(biāo)本來源于單中心實(shí)驗(yàn)室的研究，標(biāo)本類型仍然不夠豐富。后續(xù)實(shí)踐中，本研究將積極爭取多中心醫(yī)療合作，拓展標(biāo)本來源，如延伸到組織間液、腦脊液、眼內(nèi)玻璃體液等標(biāo)本的研究，繼續(xù)摸索黏蛋白乳化劑制備的細(xì)胞塊在分子病理領(lǐng)域，如熒光原位雜交(FISH)、顯色原位雜交(CISH) 、基因重排、 DNA甲基化、 基因突變檢測、微衛(wèi)星不穩(wěn)檢測的效果,以助于疾病的診斷、指導(dǎo)個體化治療、預(yù)后的監(jiān)控，為患者的精準(zhǔn)細(xì)胞學(xué)診斷提供強(qiáng)力保障。