聚乙二醇干擾素α-2b對慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)志物HBsAg、HBV-pgRNA、HBV-RNA的影響*

劉秋紅，張麗葉，張 敏，林 潔，歐陽雁

安寧市第一人民醫(yī)院感染性疾病科，云南安寧 650302

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染影響著人類的健康，該病毒可導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。全球約有2.5億人患有HBV感染，每年可造成近100萬人死亡[1]。在HBV自然感染過程中，一些被感染者的特點(diǎn)是血清HBV表面抗原(HBsAg)表達(dá)水平持續(xù)較低，該人群中的大多數(shù)成員是慢性乙型肝炎(CHB)患者。過去這部分患者不主張治療，但在隨訪中發(fā)現(xiàn)有14%～24%可能進(jìn)展為HBV e抗原(HBeAg)陰性CHB，有20%可能進(jìn)展為 HBeAg陽性CHB，有高達(dá)25%的患者發(fā)生肝臟相關(guān)疾病死亡，故在篩查中發(fā)現(xiàn)的這些慢性HBV攜帶者采取聚乙二醇干擾素治療，療程采取個體化方案，可以達(dá)到臨床治愈(HBsAg陰性)效果。

干擾素是一種增加免疫系統(tǒng)活性的重要細(xì)胞因子，由活躍的Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌[2]。干擾素通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能和促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)干擾素刺激基因的產(chǎn)生并經(jīng)干擾素信號通路編碼多種抗病毒蛋白等環(huán)節(jié)作用于HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等重要生物學(xué)過程，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的雙重作用。此外，干擾素可通過增強(qiáng)HBV前基因組RNA(pgRNA)和核心顆粒的降解，表觀遺傳修飾共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，抑制HBV轉(zhuǎn)錄并減少HBsAg的表達(dá)水平[3-5]。因干擾素半衰期短，需每天使用，加上聚乙二醇分子后，可延長干擾素的半衰期，血藥濃度可維持1周[6]。目前市面上普遍推薦使用聚乙二醇干擾素。

HBV-pgRNA、HBV-RNA作為近段時間新發(fā)現(xiàn)的乙型肝炎患者血清標(biāo)志物，其與聚乙二醇干擾素之間的關(guān)系尚未完全清楚。本研究旨在探究聚乙二醇干擾素α-2b(Peg-IFNα-2b)對CHB患者血清標(biāo)志物pgRNA、HBV-RNA之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2018年2月至2021年12月初次確診的36例CHB患者。其中男21例，女15例，平均年齡(38.53±13.21)歲。研究者HBV檢測均為B型，HBsAg均為陽性，總膽紅素(TBIL)(26.78±3.42)μmol/L、堿性磷酸酶(ALP)(159.78±20.14)IU/L、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)(48.95±6.02)U/L、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)(41.84±4.89)U/L均在正常范圍。所有患者均接受Peg-IFNα-2b 皮下注射[(劑量<50 kg(135 μg)，≥50 kg(180 μg)]每周1次，連續(xù)治療6個月。治療前后，均進(jìn)行空腹外周靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心5 min，取血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)有完整的基線篩查，包括血常規(guī)、尿常規(guī)、甲狀腺功能等。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不符合Peg-IFNα-2b治療指征者；(2) 妊娠期或短期內(nèi)有妊娠計劃、精神病、未能控制的癲癇、嚴(yán)重抑郁癥、自身免疫性疾病、嚴(yán)重感染、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病等；(3)甲狀腺疾病、既往有抑郁癥、未控制的糖尿病、高血壓、心臟病、人類免疫缺陷病毒感染或嚴(yán)重活動性疾病(如心臟病、大腦、腎臟疾病)者；(4)肝臟占位、肝硬化、肝癌及其他合并腫瘤疾病者。

本研究均獲得所有患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書，經(jīng)本院倫理委員會研究通過。

1.2儀器與試劑 Peg-IFNα-2b(國藥準(zhǔn)字：S20174006)購自廈門特寶生物公司；HBV-DNA購自西安天隆科技有限公司；HBV-DNA核酸定量檢測試劑盒購自羅氏診斷公司；病毒RNA提取純化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海碧云天公司；TRIzol液購自美國Invitrogen公司；ABI 7300型實(shí)時熒光定量PCR檢測儀購自美國Thermo Fisher公司；實(shí)驗所有引物的合成均委托上海吉瑪公司完成。

1.3指標(biāo)檢測方法

1.3.1HBsAg檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復(fù)至室溫，待用。按照HBsAg測定試劑盒說明書要求進(jìn)行操作，檢測血清中HBsAg水平。檢測范圍：0.05～250 IU/mL；若超過檢測上限，使用HBsAg稀釋液稀釋500或1 000倍再進(jìn)行檢測。

1.3.2HBV-DNA檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復(fù)至室溫，待用。使用HBV-DNA定量檢測試劑盒檢測HBV-DNA水平。

1.3.3HBV-pgRNA檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復(fù)至室溫，待用。通過病毒RNA提取純化試劑盒提取血清RNA，并用DNase Ⅰ消化。使用特異性引物、Taqman探針的qPCR實(shí)驗檢測HBV-pgRNA水平。HBV-pgRNA上游引物，5′-AYA GAC CAT CAA ATG CCC-3′，下游引物5′-ATT CTC AGA CCG TAG CAC ACG ACA C-3′；探針5′-FAM-CTT ATC AAC ACT TCC GGA RAC TAC TGT TGT TAG AC-BHQ1-3′。使用30 μL的qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃下變性5 min，然后在95 ℃持續(xù)20 s，60 ℃持續(xù)40 s，進(jìn)行40個循環(huán)。所用試劑嚴(yán)格按照質(zhì)量控制、防污染體系操作，保障數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.3.4HBV-RNA檢測 取出-80 ℃冰箱保存的血清，恢復(fù)至室溫，待用。使用HBV-RNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)檢測血清中HBV-RNA水平。

2 結(jié) 果

2.1Peg-IFNα-2b治療前后患者HBsAg、HBV-DNA的表達(dá)水平 患者使用Peg-IFNα-2b治療6個月后的血清HBsAg、HBV-DNA的表達(dá)水平與治療前比較，結(jié)果見表1。與治療前相比，治療后HBsAg、HBV-DNA的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 患者血清HBsAg、HBV-DNA的表達(dá)水平

2.2Peg-IFNα-2b調(diào)控患者血清標(biāo)志物HBV-pgRNA、HBV-RNA的表達(dá)水平 結(jié)果如表2所示，與治療前相比，治療后患者血清 HBV-pgRNA、HBV-RNA的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 患者血清 HBV-pgRNA、HBV-RNA、miR-548ah 的表達(dá)水平

2.3患者血清HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg之間的關(guān)系 為了探究HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg、Peg-IFNα-2b之間的關(guān)系，通過pearson相關(guān)性檢驗檢測Peg-IFNα-2b治療前后各個血清標(biāo)志物之間的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果如圖1所示，治療前患者血清HBV-pgRNA、HBV-RNA水平與HBsAg水平均呈正相關(guān)(r=0.751、0.702，P均<0.05)，見圖1A、B；治療后患者血清HBV-pgRNA、HBV-RNA水平與HBsAg水平也呈正相關(guān)(r=0.420、0.625，P均<0.05)。Peg-IFNα-2b治療后，HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg的相關(guān)系數(shù)均明顯的降低。

注：A為Peg-IFNα-2b治療前HBV-pgRNA與HBsAg的相關(guān)性；B為Peg-IFNα-2b治療前HBV-RNA與HBsAg的相關(guān)性；C為Peg-IFNα-2b治療后HBV-pgRNA與HBsAg的相關(guān)性；D為Peg-IFNα-2b治療后HBV-RNA與HBsAg的相關(guān)性。圖1 Peg-IFNα-2b治療前后HBV-pgRNA、HBV-RNA與HBsAg的相關(guān)性分析

3 討 論

HBV病毒復(fù)制周期復(fù)雜，其在人類肝細(xì)胞中維持病毒的持久感染。目前，已經(jīng)找到了大量可靠的監(jiān)測患者HBV感染的標(biāo)志物，包括血清的pgRNA、HBV-RNA。HBV感染期間，病毒顆粒通過?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)或硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)受體侵入細(xì)胞；然后，脫去表面抗原后，HBV基因組進(jìn)入細(xì)胞核，形成cccDNA，作為模板指導(dǎo)病毒RNA轉(zhuǎn)錄[8-9]。在RNA轉(zhuǎn)錄物中，pgRNA通過聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄到新的松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)基因組，然后核心顆粒與細(xì)胞膜中的HBsAg相互作用，至此病毒顆粒成熟，從肝細(xì)胞中釋放[10-11]。pgRNA是一種新出現(xiàn)的HBV感染的血清學(xué)標(biāo)志物，其作為病毒蛋白質(zhì)和病毒DNA合成的模板，參與病毒生命周期的調(diào)節(jié)功能，并可能在CHB的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[12]。據(jù)報道，pgRNA是一種新出現(xiàn)的HBV感染的血清學(xué)標(biāo)志物，可作為CHB患者不同感染時期的診斷、預(yù)后標(biāo)志物[13-15]。WANG等[16]報道，血清HBV-RNA水平與肝臟的壞死性炎癥和纖維化的組織病理學(xué)評分相關(guān)。由于血清HBV-RNA水平反映了肝內(nèi)HBV-RNA的數(shù)量，它們有可能被用作病毒入侵的診斷標(biāo)志物，血清HBV-RNA水平可用于準(zhǔn)確的區(qū)分輕度和重度肝組織病理學(xué)損傷。LIU等[17]報道，在慢性HBV感染的自然過程中，血清HBV-RNA水平會發(fā)生變化，血清HBV-RNA可作為預(yù)測慢性乙型肝炎患者疾病進(jìn)程的生物標(biāo)志物。pgRNA、HBV-RNA還可能存在于肝癌細(xì)胞中，引起腫瘤組織中的病毒復(fù)制[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，pgRNA、HBV-RNA在Peg-IFNα-2b治療后的CHB患者血清中水平均降低，說明Peg-IFNα-2b可抑制CHB血清pgRNA、HBV-RNA表達(dá)。

HBV病毒的基因型與疾病進(jìn)展和IFNα治療應(yīng)答有關(guān)。HBeAg陽性患者對IFNα治療的應(yīng)答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型。干擾素通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能和促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)、誘導(dǎo)干擾素刺激基因(ISGs)的產(chǎn)生并經(jīng)干擾素信號通路編碼多種抗病毒蛋白等環(huán)節(jié)作用于HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等重要生物學(xué)過程，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗病毒的雙重作用。此外，干擾素可通過增強(qiáng)HBV-pgRNA和核心顆粒的降解，或通過對cccDNA的表觀遺傳修飾來抑制HBV轉(zhuǎn)錄并減少病毒蛋白如HBsAg的表達(dá)[19-20]。干擾素療程有限，血清學(xué)應(yīng)答較高且應(yīng)答更持久。核苷治療后，HBsAg較低或是下降快速者，加用干擾素治療，HBsAg下降將更快；而對于高病毒載量CHB患者單用干擾素治療，如果HBsAg下降緩慢者，可同時聯(lián)用恩替卡韋或替諾福韋酯，強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合、優(yōu)勢互補(bǔ)，抗病毒與免疫調(diào)控雙管齊下，治療效果更佳。目前70%以上適合干擾素治療者并未開始治療，可能與還未真正了解到干擾素治療的獲益有關(guān)?，F(xiàn)實(shí)中干擾素治療者不到20%，有大量的臨床治愈優(yōu)勢患者未曾抓住臨床治愈的時機(jī)。

綜上所述，Peg-IFNα-2b具有清除CHB患者血清HBsAg的巨大潛力，這與其抑制HBV-pgRNA、HBV-RNA的表達(dá)水平緊密相關(guān)，為Peg-IFNα-2b用于CHB的治療提供理論支持。