乳及乳制品中食源性致病菌快速檢測技術的應用研究進展

趙淑環(huán)，王云霞，劉麗君，李翠枝*，呂志勇

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

隨著國民經(jīng)濟水平的不斷發(fā)展和進步，居民生活質量日益提高，家庭飲食結構不斷改善，乳制品消費水平呈明顯增長趨勢[1]。由于乳制品營養(yǎng)豐富，在采集、加工、運輸、銷售等環(huán)節(jié)極易被微生物污染，成為其生長繁殖的營養(yǎng)介質，微生物檢測是乳制品安全檢測中的一項重要內(nèi)容，其中食源性致病菌的檢測又關系到消費者的身體健康和生命安全[2]。食源性病原體是導致食源性疾病的主要原因，在美國每年約有4 800 萬例食源性疾病病例（相當于每6 個人中就有1 例），約有128 000 人住院，3 000 人死亡[3-4]。目前，乳制品中常見的食源性致病菌有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌和克羅諾桿菌等[5-8]，多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，依靠傳統(tǒng)生化、微生物全自動鑒定儀、實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜等方法進行細菌鑒定，傳統(tǒng)培養(yǎng)及生化鑒定工作繁瑣且耗時長，檢測結果往往滯后于生產(chǎn)，無法滿足乳制品安全檢測高通量、時間短的需求，不能及時為企業(yè)提供風險預警，儀器法鑒定雖有效提高了檢測效率，但對實驗人員和儀器精密度要求較高，且儀器費用昂貴，很難在企業(yè)工廠配備和使用。隨著乳制品安全問題的日益嚴重，以及對食源性致病菌低劑量（＜100 CFU/g）檢測的需求，致病菌快速檢測技術的研究也在不斷深化，研究重點是利用可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)的分析方法，直接評價乳基質中微生物的存在，建立一種靈敏、特異、快速檢測乳制品中致病菌的技術，以達到快速檢測的目的，對于乳制品行業(yè)內(nèi)部安全監(jiān)控極為重要[9]。

近年來，基于免疫學、分子生物學和生物傳感器的食源性致病菌快速檢測技術取得了很大進展。Demirci等[10]從48 頭奶牛、65 頭山羊、65 頭綿羊和53 頭驢共收集231 份乳樣進行研究，采用ISO6579：2002《食品和動物飼料微生物學-沙門氏菌的水平檢測方法》和ISO21567：2004《食品和動物飼料微生物學-志賀氏菌的水平檢測方法》、抗菌藥敏實驗和血清分型之后，通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對病原微生物進行物種和亞種區(qū)分，5 份羊乳樣品（2.16%）呈沙門氏菌屬陽性，而通過實時熒光定量PCR（q-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)僅2 份羊乳樣品（0.87%）呈沙門氏菌屬陽性，并且所有的牛乳樣品均不含沙門氏菌屬和志賀氏菌屬；Ojima-Kato等[11]開發(fā)了一種基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜的應變解決方案新型軟件，構建了一個準確、可靠的質譜分析數(shù)據(jù)庫，利用S10-spc-alpha操縱子基因編碼核糖體蛋白質譜方法來解決李斯特氏菌屬的系譜和種類，即單核細胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、威爾斯李斯特氏菌、西爾李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌的精確區(qū)分問題，實現(xiàn)物種或血清型水平微生物的全自動鑒定，為受李斯特氏菌屬污染的乳制品提供更快的可追溯性分析[12]。本文對食源性致病菌快速檢測技術的原理和應用現(xiàn)狀進行綜述，以期為乳制品中致病菌快速檢測技術的發(fā)展提供參考。

1 食源性致病菌傳統(tǒng)檢測技術

乳制品中常見的如金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、克羅諾桿菌等致病菌，在自然界中廣泛存在，可以通過乳制品加工人員、加工和運輸過程污染乳制品，導致乳制品腐敗變質和人類食物中毒。按照傳統(tǒng)的檢測方法，如GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.30—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》和GB 4789.40—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》等，進行增菌培養(yǎng)、選擇性分離、形態(tài)觀察、生理生化反應、血清學鑒定等步驟需要耗時4～7 d[13-14]，乳制品中的致病菌可被定性或定量檢出，但是菌株的分離和鑒別大多依靠肉眼觀察，主觀性強、準確性低、檢驗周期長、操作復雜、靈敏度低，容易漏檢樣品中損傷或低劑量的致病菌，無法滿足快速檢測和預防致病菌污染的要求。因此，建立一種高特異性、準確、快速的致病菌檢測方法對乳制品行業(yè)具有重要意義。

2 食源性致病菌快速檢測技術

2.1 培養(yǎng)基顯色法

顯色培養(yǎng)基用于微生物的選擇性生長和鑒別，已廣泛應用于致病菌的篩選和鑒定。其基本原理是利用病原菌中含有的特異性酶進行培養(yǎng)，將酶的特異性顯色底物添加到培養(yǎng)基中，在細菌生長代謝過程中產(chǎn)生的特異性酶分解特異性顯色底物后，目標菌形成不同顏色的菌落，從而對目標菌快速進行分離和鑒別。該項技術是將現(xiàn)代化學合成技術、細菌代謝組學與目前尚不可替代的傳統(tǒng)方法相結合應用于細菌檢驗領域的一項新技術。

顧其芳等[15]發(fā)現(xiàn)，來自廣東環(huán)凱生物技術有限公司和法國科馬嘉公司的金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基的靈敏度和特異性均高于Baird-Parker瓊脂平板，且對緩慢葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、產(chǎn)色葡萄球菌均有較強的抑制能力。劉成文等[16]用局部顯色培養(yǎng)基純化單核細胞增生李斯特氏菌，對純單核細胞增生李斯特氏菌和陽性人工污染樣品的快速檢測表明，在10-3～10-8稀釋度下，檢出率可達100%，特異性強、靈敏度和準確度高。高珮[17]比較鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌分別接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂、酚紅煌綠瓊脂和HE瓊脂的檢測效果，結果表明，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基是檢測沙門氏菌的有效方法，可提高檢測精度和檢測效率。程曉云等[18]根據(jù)GB 4789.40—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》對阪崎腸桿菌進行分離和生化鑒定，36 份樣品中，檢出阪崎腸桿菌2 株，檢出率為5.56%，廣東環(huán)凱生物技術有限公司阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基與法國科馬嘉公司阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基的陽性符合率為100%，可疑菌落檢出率分別為16.67%和13.89%。以上研究結果顯示，針對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和阪崎腸桿菌等細菌的顯色培養(yǎng)基在檢測細菌時，培養(yǎng)24 h后，通過肉眼觀察菌落顏色即可對細菌進行定性或定量分析，與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，顯色培養(yǎng)基克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)基在各種細菌分離、鑒別、計數(shù)等操作過程中復雜、敏感性低和特異性差的缺點，能夠對細菌進行快速篩查和鑒定。但在實際檢測過程中，該技術因為一些競爭菌的存在可能會抑制目標菌的生長，造成假陰性結果，所以顯色培養(yǎng)技術仍需與其他儀器或檢測技術相結合使用，隨著未來對微生物特異性生化反應機制研究的深入，將會促進微生物顯色培養(yǎng)技術在食源性病原菌檢測領域的進一步開發(fā)和應用。

2.2 免疫法

免疫檢測技術的出現(xiàn)具有快速、簡單、有效和特異性強等特點，其高靈敏度、低成本的特點彌補了傳統(tǒng)檢測方法的固有不足[19]。酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法、熒光免疫測定（fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA）法、膠體金免疫層析（gold immunochromatographic assay，GICA）法和免疫磁珠分離（immunomagnetic separation，IMS）法等免疫學方法已廣泛應用于食源性致病菌的快速檢測。

2.2.1 ELISA法

ELISA是目前最常用的檢測方法，它利用酶標記抗體與微生物細胞表面的特異性抗原發(fā)生特異反應，加入酶底物后，由于催化作用底物顏色發(fā)生變化，所以可以被檢測到[20]。Nouri等[21]發(fā)現(xiàn)，直接ELISA法檢測牛乳中的金黃色葡萄球菌腸毒素的準確性顯著高于電泳、高效液相色譜和夾心ELISA法。周鶴峰等[22]構建了一種阪崎腸桿菌的特異性抗體相關的間接ELISA方法，37 ℃顯色10 min后，最終檢測靈敏度達到102CFU/mL，該方法具有高效、快速、特異性強的特點，為食品中阪崎腸桿菌的相關檢測提供了參考。He Yixin等[23]使用納米抗體Nb 13制備了ELISA試劑盒，該試劑盒可以檢出牛乳中6 CFU/mL的沙門氏菌。ELISA法特異性好、效率高、成本低、檢出限可達ng甚至pg水平，并可制成試劑盒，適用于批量樣品的分析[24]。乳制品病原微生物檢測中，ELISA法有效克服了現(xiàn)有傳統(tǒng)微生物檢測方法在檢測效率方面的缺陷，所用設備簡單，在要求微量化、靈敏、便捷等的情況下，ELISA技術與其他技術相比也顯示出了極大優(yōu)勢，但同時不可避免也存在一定的局限性，對抗體質量的依賴性高，抗體的制備過程比較復雜，抗原表面決定簇類似常會發(fā)生交叉反應，在微生物快檢技術發(fā)展中較為受限。

2.2.2 FIA法

FIA是免疫學中最早的技術之一，與傳統(tǒng)檢測方法相比，F(xiàn)IA具有檢測速度快、操作簡單、自動化程度高、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，在檢測食源性致病菌方面，已經(jīng)實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、彎曲桿菌和沙門氏菌的快速檢測。但是，目前FIA技術仍然存在一定的問題和缺陷，F(xiàn)IA法僅包含形態(tài)學和免疫學2 項指標，病原微生物的常規(guī)檢測需要形態(tài)、生化等多方面綜合指標，F(xiàn)IA技術在追求快速檢測的同時降低了指標的多維性，檢驗結果較為片面，在菌落形態(tài)相似時，因共同抗原容易出現(xiàn)假陽性結果。

2.2.3 GICA法

GICA法是20世紀70年代逐漸建立起來的一種標記技術，它是一種結合納米技術、免疫分析技術和色譜技術的固相標記免疫分析技術，具有靈敏度高、性能穩(wěn)定、特異性強、操作簡單、適用范圍廣、成本低等優(yōu)點，可用于定性或半定量快速檢測大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等食源性致病菌，是快速檢測領域極具發(fā)展?jié)摿Φ姆椒ㄖ籟25-27]。劉洪貴等[28]用自制多克隆抗體制備免疫膠體金，用于檢測牛乳中的金黃色葡萄球菌，靈敏度為1×104CFU/mL。職愛民等[29]研制的膠體金試紙大多用單克隆抗體標記，通常5～15 min即可出結果，結果可以用肉眼判斷，靈敏度高、不需要昂貴的儀器、對操作人員要求低、便于攜帶和現(xiàn)場檢驗，但不能進行定量檢測，適用于乳制品安全領域的快速現(xiàn)場篩查。在致病菌檢測過程中，與傳統(tǒng)生化鑒定分離方法比較，GICA法操作簡單、檢測成本低、檢測速度快，適用于工廠生產(chǎn)前端，可在預防和即時監(jiān)測中發(fā)揮巨大的作用。

2.2.4 IMS法

IMS作為一種新的免疫學方法，是將免疫學的高度特異性與磁珠獨特的磁性相結合而發(fā)展起來的一種新技術，涂于磁珠表面的抗體與樣品中的目標物結合形成抗原-抗體復合物，在外部磁場的作用下，標記復合體的磁珠進行定向運動，將目標物與樣品中的雜質分離，從而達到檢測目標物的目的[30]。Bakthavathsalam等[31]將IMS技術與PCR、q-PCR技術結合檢測牛乳中的沙門氏菌，檢測限為103CFU/mL，檢測時間從幾天縮短到4 h，并可有效區(qū)分傷寒沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌。IMS技術廣泛應用于微生物學及分子生物學領域，適用于不同類型的樣品檢測，與傳統(tǒng)的常規(guī)檢驗方法相比具有顯著的優(yōu)勢，能從樣品中迅速、有選擇性地分離出目的微生物，有效減少背景干擾，提高檢測的精準性，還能捕獲損傷的靶細菌，篩選結果可以與常規(guī)細菌生化方法聯(lián)用，也可以和顯色培養(yǎng)基、熒光PCR及微生物全自動鑒定儀器等方法聯(lián)用，為食源性致病菌的檢測和鑒定提供有效的快速篩選手段。

2.3 分子生物學法

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，核酸檢測技術已成為近年來的研究熱點之一，許多核酸檢側方法已應用于食源性病原體的檢測，在食源性致病菌的檢測和鑒定中發(fā)揮著重要作用。目前常用的分子生物學檢測技術有PCR和等溫擴增技術。

2.3.1 PCR技術

PCR是一種在體外選擇性擴增DNA或RNA片段的常用分子生物學方法，由于其具有特異性強、靈敏性高、快速、簡便、可擴增RNA或cDNA、對起始材料質量要求低等優(yōu)點，在食源性致病菌的快速檢測中被廣泛應用，如q-PCR、多重PCR技術等。

2.3.1.1 q-PCR技術

q-PCR是在普通PCR反應系統(tǒng)中加入熒光團，整個過程基于熒光信號的積累進行實時監(jiān)測，在每個周期檢測熒光信號的強度，并記錄在計算機軟件中，通過計算每個樣品的循環(huán)閾值，最后根據(jù)標準曲線對樣品中待測成分進行定量分析[32]。根據(jù)熒光模式的不同，q-PCR可分為DNA染色法、熒光探針法和化學引物試劑法，前2 種方法應用較為廣泛[33]。q-PCR按定量方法可分為絕對定量和相對定量，基于TaqMan探針的q-PCR技術可用于根據(jù)生物分布進行成分定量分析，每個q-PCR板包含不同濃度的標準樣品和質量控制樣品，用于目標DNA拷貝的絕對定量[34]。李聰[35]利用改進的指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術分別篩選與蠟樣芽孢桿菌和志賀氏菌特異性結合的適體，并根據(jù)篩選的適體建立了特異性好、靈敏度高、無需制備抗體的適體捕獲結合q-PCR檢測致病菌的方法。q-PCR方法已較為成熟，其配套儀器及試劑較為全面、試劑成本中等、操作簡單、檢測靈敏性和特異性較高，但也存在一些缺點，如因目的基因發(fā)生突變而導致漏檢、低濃度模板的檢測結果無法確定、使用標準曲線定量檢測時誤差較大等，精準定量是q-PCR技術的發(fā)展趨勢。

2.3.1.2 多重PCR技術

為了實現(xiàn)對多種食源性致病菌的快速、同步檢測，一系列多靶點檢測技術應運而生，其中，多重PCR法因其高靈敏度和特異性而受到廣泛關注[36]。多重PCR是在同一個PCR反應體系中加入2 對以上的引物，然后連續(xù)擴增出許多核酸片段的PCR反應，其反應原理、試劑和操作過程與傳統(tǒng)PCR相似[37-38]。楊軍等[39]根據(jù)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌3 種目標菌的保守基因設計多重PCR引物，通過多重PCR檢測致病菌，檢測限達102CFU/mL，并且反應體系的組分之間沒有交叉干擾，對人工污染乳制品盲樣進行驗證，3 種致病菌檢出率為100%，無假陰性。鄢雷娜[40]建立疊氮溴化丙啶-多重PCR法檢測乳制品中腸炎沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和克羅諾桿菌活菌，對經(jīng)7 h培養(yǎng)后的加標乳制品樣本中的腸炎沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和克羅諾桿菌的檢測限為102CFU/mL，且顯示出良好的特異性。多重PCR是在同一PCR反應管內(nèi)定量檢測多種病原微生物，可以大大節(jié)省時間及試劑耗材，具有顯著的高效性和經(jīng)濟性。

2.3.1.3 數(shù)字PCR技術

隨著高通量技術的發(fā)展，數(shù)字PCR技術也得到了發(fā)展，數(shù)字PCR技術中的“數(shù)字”是指單個實體中的信號切換，如關閉或打開、激活或不激活、凝結或不凝結、熒光或非熒光等，數(shù)字PCR技術是繼普通PCR和q-PCR之后的第3代PCR技術，它是一種具有單分子靈敏度的精確核酸定量技術[41]。相對于許多PCR，數(shù)字PCR方法更為高效、快速，它將傳統(tǒng)PCR與熒光探針技術相結合，將檢測樣品分為多個液滴，每個液滴上都有相同的PCR擴增，含有熒光靶序列的微滴為陽性，否則記為陰性，然后根據(jù)泊松分布統(tǒng)計樣品的DNA分子數(shù)目與比例，從而實現(xiàn)更靈敏的絕對定量，目前，數(shù)字PCR已經(jīng)實現(xiàn)了牛乳中沙門氏菌的定量分析，檢測限為5 CFU/mL，具有顯著的定量優(yōu)勢[42]。目前，已建立了多種食源性病原菌的數(shù)字PCR技術檢測方法，如大腸桿菌O157:H7、副溶血性弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特氏菌等[43-46]。

2.3.2 等溫擴增技術

等溫擴增作為一種體外核酸擴增技術，其特點是反應過程中溫度恒定，借助熱臺或水浴鍋等簡單的恒溫儀器即可實現(xiàn)擴增，大大降低了成本和對精密溫控設備的依賴，已成為PCR擴增的替代方案[47]。徐文文等[48]利用環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）建立了一種方便、快速、高效、針對不同乳制品中常見食源性致病菌的檢測方法，并對LAMP檢測引物試劑和儀器在實驗室菌株和人工污染的乳制品樣品快速篩選中的適用性進行了評價，所選引物試劑只擴增了目標菌株的核酸，其他菌株沒有擴增，擴增檢測靈敏度均達101fg/μL，采用GB 4789.36—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》、GB 4789.10—2016和LAMP法同時對嬰幼兒乳粉和干酪樣品進行檢測，檢測結果完全一致，對發(fā)酵乳樣品進行檢測時，大腸埃希氏菌O157:H7和金黃色葡萄球菌也有較好的檢測結果，檢測時間不超過30 min。與普通PCR相比，LAMP不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，縮短了檢測時間[49-50]。但等溫擴增技術存在的問題是在細胞死亡后，從樣品中提取的死菌DNA同樣能作為模板進行特異性擴增，所以在檢測過程中因難以區(qū)分死菌和活菌會出現(xiàn)假陽性結果[51]。

2.4 質譜鑒定技術

質譜技術是一種根據(jù)離子產(chǎn)生的質譜圖確定樣品分子組成的分析技術，是一種新的微生物鑒定技術。質譜技術不僅可以對傳統(tǒng)的目標分析物進行定性和定量分析，還可以用于快速、準確的細菌鑒定，其原理是質譜儀離子源通過電離作用賦予目標菌高能量，目標菌在吸收能量后被激發(fā)，產(chǎn)生強電離效率，載體進入質譜儀后，通過電壓的作用加速飛行，由于每個離子具有不同的質荷比，而探測器上捕獲的帶電粒子所產(chǎn)生的信號信息也不同，細菌的鑒定可以通過與質譜庫中的標準圖譜數(shù)據(jù)進行比對來實現(xiàn)[52-54]。質譜法在微生物檢測中的應用具有明顯的優(yōu)勢，對樣品的要求很低，樣品可以不進行分離純化，直接進行測定，精確度高、操作簡單、可以實現(xiàn)自動化，同時還具有高靈敏度、高通量及高特異性，因此在微生物檢測方面得到了迅速發(fā)展[55]。目前，質譜技術已應用于金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等常見致病菌的分型和鑒定，與傳統(tǒng)方法相比分型和鑒定結果一致[56-57]。

3 結 語

綜上所述，傳統(tǒng)國標法仍是食源性致病菌檢測的金標準，但其操作復雜、檢測周期長、主觀因素多等不足不能滿足乳制品行業(yè)現(xiàn)代化高速發(fā)展的需要。近些年涌現(xiàn)的顯色培養(yǎng)技術、免疫法、分子生物學法、質譜鑒定技術等快速檢測技術，已在國內(nèi)外乳制品中得到廣泛運用，但仍然無法滿足市場需求，針對技術的靈敏度、準確性和穩(wěn)定性等方面仍存在較大的改進空間。例如：1）培養(yǎng)基顯色技術因非目標菌的競爭作用和特異性酶反應，常會造成檢測結果假陰性和假陽性，降低顯色培養(yǎng)基的靈敏性和特異性；2）免疫檢測技術具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡單、結果直觀、適合現(xiàn)場檢測等諸多優(yōu)點，但非常依賴于抗體的好壞；且由于抗原表面決定簇類似，常使結果發(fā)生交叉反應；3）分子生物學檢測技術操作步驟簡單、快速、高效，但儀器設備昂貴，無法區(qū)分活、死致病菌，易造成假陰性結果；4）質譜鑒定技術能夠快速、有效對致病菌進行鑒定，但也存在一定的局限性，對微生物圖譜數(shù)據(jù)庫依賴度高，需要不斷完善和更新微生物圖譜數(shù)據(jù)庫。

隨著我國社會經(jīng)濟的發(fā)展和科學技術的更新，乳制品食源性致病菌快速檢測技術還有很大的發(fā)展空間。研究人員應加強對以下方面更為深入的探索：1）加強相關檢測技術和設備的研究，與時俱進，積極創(chuàng)新多元化、智能化、便攜化和節(jié)約化檢測技術及檢測設備，實現(xiàn)生產(chǎn)過程實時在線監(jiān)測和現(xiàn)場快速檢測，大大提高食源性致病菌檢測效率，從而全面提升乳制品安全檢測與質量檢測水平，有效控制食物中毒事件的發(fā)生，切實為人民群眾生命健康提供有力保障；2）在新型科學技術不斷涌現(xiàn)的當下，還應積極探索與元宇宙、人工智能、大數(shù)據(jù)、區(qū)塊鏈等新型創(chuàng)新技術的聯(lián)用，為乳制品行業(yè)風險監(jiān)控提供強有力的技術支持。