江西檳榔芋疫病病原菌鑒定及室內藥劑篩選

鄒 芬, 何烈干, 李湘民, 黃瑞榮, 馬輝剛

(江西省農業(yè)科學院植物保護研究所, 南昌 330200)

芋Colocasiaesculenta(L.)Schott為天南星科芋屬作物,在世界熱帶濕潤地區(qū)大量種植[1],在我國則主產于廣西、廣東、福建等地[2]。芋富含糖類、蛋白質、維生素等營養(yǎng)物質[3],是一些發(fā)展中國家的重要主食作物[4],據聯(lián)合國糧農組織報道芋現(xiàn)已成為全球消耗量排名第五的塊根類蔬菜[5]。為助力產業(yè)扶貧,江西九江永修縣在2018年首次引進種植了約1 333 m2檳榔芋。2020年6月-7月,筆者到該地調查后發(fā)現(xiàn)在檳榔芋葉片上出現(xiàn)大量壞死斑,部分植株葉柄上也有該癥狀(圖1a～c),與已報道的芋疫病癥狀基本一致[6]。

芋疫病主要由卵菌芋疫霉PhytophthoracolocasiaeRacib引起,是芋生產中最具破壞性的病害,現(xiàn)已成為全世界芋種植的主要制約因素,每年造成的損失達25%～50%[7]。對病原菌進行準確鑒定是病害有效防控的前提。以往對芋疫病的鑒定主要基于病害癥狀和病原菌形態(tài)學觀察,隨著分子生物學方法的快速發(fā)展,周清平等[8]和陸葉等[9]利用ITS通用引物對芋疫病病原菌進行了鑒定。但是卵菌種間相似度較高,ITS并不能完全區(qū)分親緣關系較近的種[10]。研究表明,多基因序列分析能更準確地鑒定病原菌,三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白基因(Ypt1)和β微管蛋白基因(β-tubulin)也常被用于卵菌特異性分離鑒定的靶標[11-12]。

當前可通過種植抗病品種、加強田間管理、輪作、套作等方式對芋疫病進行防治,但化學防治仍是防控該病害最快、最有效的方法。Cox 等[13]對巴布亞新幾內亞地區(qū)芋疫病藥劑防治試驗表明,甲霜靈和王銅防效顯著;周清平等[8]對芋疫病防治藥劑的篩選結果表明,60%錳鋅·氟嗎啉可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑和72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑的防效均在60%以上;葉泉清等[2]對廣西荔浦芋的藥劑防治試驗結果表明，50%烯酰嗎啉水分散粒劑和58%甲霜·錳鋅可濕性粉劑防效較好,平均防效分別為58.8%和52.4%。然而,由于化學農藥的長期使用,加上卵菌遺傳變異快,病原菌抗藥性的發(fā)生時有報道[14]。據報道致病疫霉P.infestans、古巴假霜霉Pseudoperonosporacubensis、腐霉Pythiumsp.等病原菌對甲霜靈均產生了抗性[15-17]。因此,亟須篩選出對檳榔芋有良好防治效果的常用殺菌劑,從而有針對性地對芋疫病進行防治。

本研究采用形態(tài)學觀察、致病性測定、分子生物學鑒定聯(lián)合多基因序列分析對檳榔芋疫病的病原菌進行分離鑒定,并測定了7種常用殺菌劑對病原菌的抑制效果,以期為該病害的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試菌株

辣椒疫霉P.capsici標準交配型A1、A2菌株由安徽省農業(yè)科學院植物保護與農產品質量安全研究所戚仁德研究員惠贈。

1.1.2供試藥劑

96.8%烯酰嗎啉(dimethomorph)原藥,安徽豐樂農化有限責任公司;97%霜脲氰(cymoxanil)原藥,上海升聯(lián)化工有限公司;20%氟嗎啉可濕性粉劑,沈陽科創(chuàng)化學品有限公司;23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑、500 g/L氟啶胺懸浮劑,先正達生物科技(中國)有限公司;0.3%丁子香酚可溶液劑,河南省焦作華生化工有限公司;45%敵磺鈉濕粉,遼寧省丹東市農藥總廠。

1.1.3供試培養(yǎng)基

V8培養(yǎng)基:將罐裝V8飲料(330 mL)倒入燒杯中,加入3.3 g CaCO3,混勻后用4層紗布過濾,按1∶9加入純水進行稀釋,如配固體培養(yǎng)基再按1.5%加入瓊脂粉;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g,蒸餾水定容至1 L。

1.2 病原菌的分離與純化

于2020年6月至7月從江西省九江市永修縣采集典型的檳榔芋疫病染病葉片和葉柄帶回實驗室,采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。具體方法為:將葉片和葉柄用滅菌水沖洗干凈,稍微晾干,切取葉片和葉柄病健交界處3 mm×3 mm大小的組織塊,先用75%乙醇消毒15 s,隨后置于1%次氯酸鈉溶液中浸泡1～2 min,最后用無菌水漂洗3次,用滅菌濾紙吸干水分后置于含50 μg/mL氨芐青霉素和100 μg/mL利福平的V8培養(yǎng)基上,放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d,待菌落長出后進行單孢分離純化[18],純化后接種于V8斜面培養(yǎng)基,置于13℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測定

按照柯赫氏法則,采用游動孢子懸浮液接種離體葉片以測定菌株致病性。從田間摘取健康且長勢較為一致的檳榔芋葉片帶回實驗室,用70%乙醇對葉片表面進行消毒。將供試菌株接種于V8平板上,25℃黑暗培養(yǎng)5 d,加入滅菌水誘導游動孢子釋放,配制成3×104個/mL的游動孢子懸浮液,在每張葉片背面左半部分選取兩個點滴10 μL游動孢子懸浮液,右邊以滅菌水為對照,放入托盤中保濕,25℃黑暗培養(yǎng),逐日觀察葉片發(fā)病情況。待發(fā)病后進行病原菌的再分離。

1.4 形態(tài)學觀察

將純化的菌株接種于V8平板上,置于25℃黑暗下培養(yǎng)5 d,觀察菌落形態(tài)特征,參照鄭小波[19]、陸家云[20]的方法測量孢子囊的大小。將純化的菌株同時和辣椒疫霉標準交配型A1、A2菌株對峙培養(yǎng)以誘導有性器官雄器、藏卵器和卵孢子產生,在顯微鏡下觀察各個有性器官形態(tài)并拍照測量,每種性器官至少測量50個數據。

1.5 病原菌分子生物學鑒定

采用CTAB法提取病原菌菌絲體DNA,分別使用核糖體內部轉錄間隔區(qū)ITS通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[9]、三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白基因Ypt1引物Yph1F(5′-CGACCATKGGTGTGGACTTT-3′)/Yph2R(5′-ACGTTCTCMCAGGCGTATCT-3′)[11]、β微管蛋白基因β-tubulin引物BT5(5′-GTATCATGTGCACGTACTCGG-3′)/BT6(5′-CAAGAAAGCCTTACGACGGA-3′)[12]對菌株進行PCR擴增,PCR反應體系(50 μL)為:10×PCR Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL,5 U/μLTaq酶0.5 μL,ddH2O補足至50 μL。反應程序:94℃預變性3 min;94℃變性25 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸5 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至擎科生物(長沙)技術有限公司進行測序。將所得序列提交到NCBI數據庫,并進行Blastn比對,下載鄰近屬種序列,使用Bioedit 軟件對序列進行整理,將各基因序列首尾串聯(lián),使用ClustalX工具對多基因序列進行比對,應用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 供試菌株對7種殺菌劑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[21]測定檳榔芋疫病病原菌對7種殺菌劑的敏感性。將殺菌劑配制成不同濃度的母液,并按照1∶1 000的比例制成系列質量濃度的含藥PDA平板。將供試菌株于PDA平板上活化,于25℃黑暗下培養(yǎng)6 d,用直徑5 mm的打孔器打取菌餅,將菌絲面朝下接種于含藥平板中央,以無藥平板為對照,每個處理重復3次,置于生化培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)7 d,采用十字交叉法測量菌落直徑,計算菌絲生長抑制率。利用SPSS 17.0軟件求出EC50、b±標準誤差、卡方值和P值。

2 結果與分析

2.1 檳榔芋疫病田間癥狀觀察及致病性測定

田間調查時發(fā)現(xiàn),檳榔芋疫病主要危害葉片,開始產生水漬狀斑點,隨后迅速擴展為大的褐色輪紋狀病斑,病斑周圍分泌出淡黃色的小液滴,中間腐敗穿孔,僅留葉脈呈破傘狀(圖1a-c),部分葉柄上也有病斑出現(xiàn)。

本次共采集了20片葉片和10個葉柄,最終分離純化獲得3株菌株,分別命名為JJYT-1、JJYT-2、JJYT-3,將分離純化的病原菌接種健康葉片,接種24 h后葉片開始褪綠,出現(xiàn)圓形水漬狀淺褐色病斑,3 d后病斑逐漸擴大,顏色加深,病斑周圍有淡黃色暈圈,中間開始腐爛,對照處理無癥狀(圖1d-e)。從發(fā)病部位進行病原菌的再分離,獲得與原菌株一致的菌,表明接種菌株為引起檳榔芋疫病的病原菌。

圖1 檳榔芋疫病的田間發(fā)病癥狀及致病性測定

2.2 病原菌形態(tài)學觀察

病原菌菌落在V8培養(yǎng)基上呈圓形,邊緣整齊,菌落白色,氣生菌絲較少。孢子囊主要呈長橢圓形,少部分為卵圓形,頂端具乳突,大小為(39.0～67.3)μm×(21.9～30.6)μm,平均51.6 μm×25.8 μm,長寬比2.0(1.7～2.4)。供試菌株自身未見卵孢子產生,和辣椒疫霉A1標準菌株對峙培養(yǎng)8 d后,在兩菌交界處有大量藏卵器、雄器和卵孢子產生。藏卵器呈球形,大小為(26.8～38.4)μm,平均33.1 μm,卵孢子大小為(17.6～31.3)μm,平均26.6 μm,雄器圍生,大小為(11.7～17.6)μm×(8.2～16.2)μm,平均14.6 μm×11.4 μm,與鄭小波[19]和陸家云[20]描述的芋疫霉形態(tài)基本一致。

圖2 檳榔芋疫病病原菌形態(tài)特征

2.3 分子生物學鑒定

使用ITS、Ypt1、β-tubulin基因通用引物對分離得到的3株菌株分別進行PCR擴增,可分別擴增出約820、415 bp和700 bp的特異性條帶。將序列提交至GenBank,JJYT-1菌株獲得登錄號分別為MT936521、MT977413、MT977414;JJYT-2菌株獲得登錄號分別為OM108210、OM162131、OM162133;JJYT-3菌株獲得登錄號分別為 OM108211、OM162132、OM162134。3株菌株的ITS、Ypt1、β-tubulin序列與NCBI上P.colocasiae相關序列相似性均為99%～100%。通過MEGA 7.0構建ITS-Ypt1-β-tubulin多基因進化樹,結果表明3株菌株與Phytophthoracolocasiae聚于同一分支(圖3)。

圖3 基于 ITS、Ypt1和β-tubulin基因構建的檳榔芋疫病病原菌JJYT-1、JJYT-2和JJYT-3的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 7種殺菌劑對檳榔芋疫病病原菌的毒力

由表1結果可知:供試的7種殺菌劑對檳榔芋疫病病原菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用。其中23.4%雙炔酰菌胺SC對菌絲生長抑制效果最好,EC50為0.006 μg/mL;96.8%烯酰嗎啉TC、0.3%丁子香酚SL、20%氟嗎啉WP、500 g/L氟啶胺SC、97%霜脲氰TC對菌絲生長的抑制效果也較好,EC50介于0.094～1.272 μg/mL之間;45%敵磺鈉WG對病原菌的抑制效果最差,EC50為56.923 μg/mL,但45%敵磺鈉WG除了能抑制菌絲生長速率外,還能抑制菌絲生長量,隨著濃度的升高,菌絲量明顯減少。

表1 7種殺菌劑對檳榔芋疫病病原菌的室內毒力

3 結論與討論

國內已有對芋疫病病原菌鑒定的相關報道,王向社等[22]和葉泉清等[2]通過形態(tài)學觀察和致病性測定將芋疫病病原菌鑒定為芋疫霉;周清平等[8]和陸葉等[9]等通過形態(tài)學觀察和ITS序列分析將芋疫病鑒定為芋疫霉。然而,Martin等[10]報道ITS難以對部分親緣關系相近的種如橡樹疫霉P.ramorum和假丁香疫霉P.pseudosyringae進行區(qū)分,本研究通過形態(tài)學觀察、致病性測定聯(lián)合ITS-Ypt1-β-tubulin多基因序列分析對芋疫病病原菌的鑒定方法更加準確和可靠,這是江西省內首次對該病病原菌的鑒定報道。芋疫霉的寄主范圍較窄,主要寄主為芋屬作物,可通過氣流、雨水、帶菌球莖等傳播,由于該地區(qū)的檳榔芋是從外地引進,推測可能是球莖上帶有該病原菌造成此次芋疫病的發(fā)生。

本研究測定了7種常用殺菌劑對檳榔芋疫病病原菌的抑制作用,結果表明,除45%敵磺鈉濕粉外,其余6種殺菌劑抑制效果均較好。在國內現(xiàn)有的研究報道中,對芋疫病化學防治使用時間長、范圍廣的藥劑主要有甲霜靈和烯酰嗎啉,但甲霜靈的作用位點β-1,3 葡聚糖酶單個核苷酸位點的突變就能引起病原菌抗藥性[23],因此其使用逐漸受到限制。烯酰嗎啉以其抑菌活性強、對卵菌有特效、且與甲霜靈等苯酰胺類殺菌劑無交互抗性而受到廣泛重視[24],葉泉清等[2]、周清平等[8]和朱敦軍[25]開展的田間藥劑試驗結果表明,50%烯酰嗎啉水分散粒劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉水分散粒劑對芋疫病的平均防效分別為58.8%、67.9%和79.2%;黃達才[26]的研究表明,80%烯酰嗎啉水分散粒劑對芋疫病平均防效在70%以上;本研究室內毒力測定結果表明,芋疫霉對96.8%烯酰嗎啉原藥十分敏感,EC50值為0.094 μg/mL,這與前人發(fā)現(xiàn)烯酰嗎啉對芋疫病防效良好的結論基本一致[2,8,25-26]。本研究發(fā)現(xiàn),23.4%雙炔酰菌胺懸浮劑對芋疫霉菌絲生長抑制效果優(yōu)于96.8%烯酰嗎啉原藥,其EC50為0.006 μg/mL,方輝等[27]的研究表明,250 g/L雙炔酰菌胺懸浮劑對芋疫病有較好的防治效果,且顯著優(yōu)于70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和70%烯?！に迩杷稚⒘┑某Ｒ?guī)用藥量。雙炔酰菌胺是先正達公司開發(fā)的新型卵菌病害殺菌劑,也是第一個商品化的扁桃酰胺類化合物,其對抑制孢子萌發(fā)具有較高活性,同時也抑制菌絲體的生長與孢子的形成,研究表明,其對卵菌病害如番茄晚疫病和黃瓜霜霉病等具有很好的防治效果[28]。由于芋葉片表面的蠟質,加上芋疫病多發(fā)生于高溫多雨季節(jié),許多殺菌劑無法吸附在葉片上而導致防效較差[23]。然而,雙炔酰菌胺對植物表面的蠟質具有很高的親和力,耐雨水沖刷,被吸附后的有效成分能夠保護整個葉片不受病害侵染[29]。因此,當芋疫病發(fā)生時可優(yōu)選雙炔酰菌胺進行防治。此外,0.3%丁子香酚可溶液劑、20%氟嗎啉可濕性粉劑、500 g/L氟啶胺懸浮劑和97%霜脲氰原藥對芋疫霉菌絲生長抑制的EC50值分別為0.10、0.275、0.703、1.272 μg/mL,這些數據均可為芋疫病田間防治提供一定參考。

本試驗僅在室內完成,下一步應開展田間藥效試驗以驗證實際防效。另外,在芋種植過程中,化學防治芋疫病時用藥要早,病害零星發(fā)生時便應用藥,同時應避免長期使用單一藥劑,不同藥劑的輪換使用及復配劑的使用能有效避免抗藥性的發(fā)生。此外,也應加強田間水分管理、增大植株間距、間作等,以達到對芋疫病進行綜合防治的目的。