基于線粒體CO Ⅰ基因及形態(tài)特征的喜樹叢枝植原體主要媒介昆蟲種類鑒定

何孟蘭, 蔡銀楓, 吳道慧, 蘇 帆, 萬瓊蓮, 王柱華,陳相聰, 吳艷芬, 喬 開, 蔡 紅*

(1.云南農業(yè)大學植物保護學院, 昆明 650201; 2.玉溪師范學院化學生物與環(huán)境學院, 玉溪 653100)

喜樹Camptothecaacuminata是我國特有樹種。喜樹除了觀賞和木材用林以外,還有重要的藥用價值,其樹葉、樹皮、根皮和果實都含有具有抗腫瘤作用的生物堿——喜樹堿,對多種癌癥有一定的療效。喜樹中抗癌物質的研究一直是一個熱點,近幾年也取得了巨大的進展,但隨著人工種植喜樹面積的逐年擴大, 喜樹病蟲害問題也愈發(fā)突出。早在1983年,趙建華等在貴州省南部公路旁發(fā)現種植的喜樹(俗稱野八角)上有叢枝病發(fā)生,借助電子顯微鏡觀察到病株葉脈韌皮部的篩管細胞中有大量典型的植原體菌體,認為喜樹叢枝病是由類菌原體(現稱植原體)所致[1]。

植原體自發(fā)現以來,世界各地已報道1 000余種由其引發(fā)的病害,這些植原體所威脅的經濟林木、作物、蔬菜、水果和觀賞植物已達到100余種,我國也報道了70多種植物植原體病害。植原體大量存在于寄主植物的韌皮部篩管細胞中,自然條件下植原體大多依賴于通過取食韌皮部汁液的半翅目媒介昆蟲以持久性傳播的方式在其宿主間實現高效的傳播,主要植原體媒介昆蟲有葉蟬科Cicadellidae、飛虱科Delphacidae和木虱科Psyllidae等植食性昆蟲。

昆蟲傳毒是一個植原體-昆蟲-植物互作的復雜過程,媒介昆蟲從染病植物獲取植原體后到傳播之前有一段潛伏期,因此植原體通過媒介昆蟲進行傳播的過程通常包括了被昆蟲取食、潛伏和接種3個基本階段。在取食階段,媒介昆蟲通過取食感病植株韌皮部汁液攝取到植原體并被吸收進昆蟲的中腸內,隨之植原體入侵昆蟲腸細胞和鄰近肌肉細胞及血淋巴,此過程被稱為飼毒期或取食時間(acquisition access period,AAP)。潛伏期(latency period,LP)是媒介昆蟲獲取植原體后到開始具有傳染性的一段時間間隔。在潛伏期期間植原體通過血淋巴侵入蟲體內開始增殖并到達唾液腺。潛伏期范圍為12天至一個多月,這與昆蟲種類、植原體菌株或種類以及溫度等非生物因素有關[2]。

本實驗室研究團隊前期以云南文山地區(qū)發(fā)現的具有典型叢枝癥狀的喜樹植株和在其感病植株上發(fā)現的疑似葉蟬類昆蟲為研究對象,鑒定出了5種葉蟬類昆蟲并通過傳毒試驗篩選出喜樹叢枝植原體株系媒介昆蟲優(yōu)勢種為小綠葉蟬Empoascasp.。但對小綠葉蟬的種類和分類地位還未明確。本試驗根據小綠葉蟬各齡期外部形態(tài)以及雄性外生殖器特征進行種類鑒定,并結合基于線粒體COⅠ基因序列片段的小綠葉蟬屬Empoasca與部分近緣種進行分子鑒定,進一步明確其分類地位。鑒定結果可為后期喜樹叢枝植原體的傳毒特性及侵染循環(huán)研究奠定理論基礎,為喜樹植原體的綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

小綠葉蟬采自云南省文山市感病喜樹上,用種植的健康喜樹苗在溫室內飼養(yǎng)4～5代后,采集雄成蟲浸泡于無水乙醇中,放置于-20℃長期保存?zhèn)溆?喜樹上飼養(yǎng)的若蟲及剩余的雌雄成蟲用于形態(tài)特征觀察。

1.2 主要試劑及儀器

DNA 提取試劑盒、PCR 產物純化試劑盒(購于Omega 公司),PCR 擴增高保真酶(Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase)、DNA Marker(購于南京諾唯贊生物公司),克隆載體試劑盒(pEASY?-Blunt Simple Clonging Kit)(購于北京全式金公司),Motic體視顯微鏡SMZ-168(購于麥克奧迪實業(yè)集團有限公司),Zeiss蔡司PrimoStar顯微鏡、Axiocam ERc 5s顯微鏡攝像機(購于北京汗盟紫星儀器儀表有限公司)。

1.3 形態(tài)學鑒定

分別在體視顯微鏡80、50、45、40、35、35、30倍下拍攝小綠葉蟬卵期、1～5齡若蟲及成蟲的形態(tài)特征。雄成蟲外生殖器的解剖及鑒定方法:用自制解剖針針尖插入雄成蟲胸腹結合處,輕輕取下蟲體下腹部,浸泡在10%NaOH溶液中,放于100℃的水浴鍋中煮1 min,直至肉眼可見僅剩明顯骨化部分(肌肉溶解);取出蟲體用超純水清洗5～6次,用吸水紙吸干多余水分,置于凹面載玻片事先滴好的滅菌甘油中,在體視顯微鏡下進行觀察解剖和鑒定,最后使用顯微鏡和顯微鏡攝像機拍照保存,根據相關資料進行種類鑒定。

1.4 分子鑒定

1.4.1葉蟬總 DNA 提取和PCR 擴增

小綠葉蟬的總DNA使用 Omega 公司的微量 DNA 提取試劑盒按照說明書方法提取,最后的總DNA于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。PCR通用引物COIF和COIR參照 Folmer 等[12]設計,由昆明擎科生物技術有限公司合成,(COIF:GGTCAACAAATCATAAAGATATTG，COIR:TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT)。擴增體系為2×TransStart?Max Buffer(2 mmol/L)12.5 μL,dNTP Mix(10 mmol/L)0.5 μL,Phanta?Max DNA Polymerase 0.5 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,昆蟲總 DNA 模板 1 μL,加ddH2O 至25 μL。PCR反應條件為: 94℃ 5 min;94℃ 30 s,46℃ 30 s,72℃ 46 s,35個循環(huán);72℃延伸 10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2克隆及測序

目標產物經PCR產物純化試劑盒純化后與全式金克隆載體 pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector 進行連接并轉化到大腸桿菌 Trans1-T1 Phage Resistant 中,經藍白斑篩選陽性克隆子后,接種到含氨芐青霉素(ampicillin, Amp)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h并進行菌液 PCR 檢測后送至北京擎科生物公司進行雙向測序。

1.4.3COⅠ 基因序列比較分析

應用DNAMANV7軟件,對擬帕小綠葉蟬Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis-CA的COⅠ 基因序列進行多序列比對,去除相同的上下游引物部分,得到 709 bpCOⅠ 基因序列。將序列輸入 NCBI 網站,進行 BLAST 相似性檢索,顯示與基因庫中現有昆蟲COⅠ 基因序列具有很高的同源性,可知所測序列為COⅠ 基因。后使用DNAMA NV7軟件計算基因序列片段中各堿基的平均含量、變異位點、簡約信息位點等。最后將擬帕小綠葉蟬COⅠ 序列與 GenBank 中搜索的 12種葉蟬(小綠葉蟬族Empoascini的小綠葉蟬屬Empoasca5種、芒果葉蟬屬Amrasca1種、奧小葉蟬屬Austroasca1種,叉脈葉蟬族 Dikraneurini 1種,斑葉蟬族Erythroneurini 1種,塔葉蟬族 Zyginellini 1種,眼小葉蟬族 Alebrini 1種,小葉蟬族 Typhlocybini 1種)共22個COⅠ 序列進行多重比對,利用軟件自動刪除非對齊序列輔以手動矯正,保存Fasta格式。用 MEGA7.0打開Fasta 格式,利用Kimura 2-parameter 模型計算出平均遺傳距離,并采用自舉檢驗(Bootstrap)1 000次進行進化樹檢驗,以叉脈葉蟬族 Dikraneurini等5個族的COⅠ基因序列為外群,構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 擬帕小綠葉蟬形態(tài)特征鑒定

2.1.1擬帕小綠葉蟬卵及若蟲特征

擬帕小綠葉蟬卵長0.8～0.9 mm,表面光滑,香蕉形,上細下粗,中部微彎,初產時為白色透明狀(圖1a1),后逐漸變?yōu)辄S綠色(圖1a2),孵化前可見暗紅色小眼點(圖1a3)。卵散產于嫩莖、葉柄、葉脈等組織內,以頂芽下第2與第3葉之間的莖內最多。

擬帕小綠葉蟬若蟲期共5齡,根據蟲體大小、顏色、翅芽有無及長度來區(qū)分。1齡若蟲體長0.8～0.9 mm,體乳白色,頭大,身體細小,復眼紅色,剛毛狀觸角細,體被稀疏黑色細毛(圖1b);2齡若蟲體長0.9～1.1 mm,體淡黃至黃綠色,復眼灰白色,體分節(jié)較明顯,體被稀疏黑色細毛,翅芽超過第1腹節(jié)(圖1c);3齡若蟲體長1.5～1.8 mm,體淡綠色,復眼灰白色;腹部明顯增大,翅芽超過第3腹節(jié)(圖1d);4齡若蟲體長1.8～2.0 mm,體淡綠色,翅芽逐漸明顯,超過第4腹節(jié)(圖1e);5齡若蟲體長2.0～2.2 mm,體色黃綠,翅芽伸達第5腹節(jié),第4腹節(jié)明顯膨大(圖1f)。

2.1.2擬帕小綠葉蟬雌雄成蟲形態(tài)特征

擬帕小綠葉蟬成蟲體長3.0～3.8 mm,體淡綠色或黃綠色,刺吸式口器,觸角3節(jié), 剛毛狀(圖1h、j)。頭冠表面光滑,無淺凹陷,前端鈍角凸出, 緣圓微尖,頭冠處具一條明顯的冠縫,伸達頭冠前緣,約占頭冠長度的2/3,頭冠前緣具1對淡綠色單眼,復眼灰褐至深褐色,不伸達前胸背板中部(圖1j,圖3b);前胸背板淡灰綠色,有深色斑點,不向后延伸蓋住小盾片,中胸小盾片上有特殊的淡白色斑點,中后部的盾間溝,不伸達側緣(圖1h、i,圖3a)。足淡綠色,兩邊各具一排大刺,爪褐色,跗節(jié)3節(jié)。擬帕小綠葉蟬雌雄異型, 除體型上雌成蟲較大、顏色較深外,雌雄成蟲最大的區(qū)別在蟲體腹部末端:雌成蟲背腹產卵瓣于尾節(jié)處嵌合,產卵瓣條縫處具褐色針狀產卵器(圖1g);雄成蟲腹部末端退化為三角形的尾節(jié)側瓣,其端部具上下生殖板,彎向背部,外緣著生許多大剛毛,內緣具成列小剛毛(圖1g)。卵和各齡期若蟲以及雌雄成蟲與孟召娜等[3]報道的小貫小綠葉蟬Empoascaonukii體色、體型及大小十分相似,外形上并無差別。

圖1 擬帕小綠葉蟬各齡期形態(tài)特征

有翅2對,前、后翅膜質(圖2,圖3e、f);前翅淡綠色, 基部顏色較深, 翅端煙褐色,超出身體末端;革片有R、MP、CuA 3條縱脈,均不分支,在翅端1/3處由4條端橫脈cv、MP″、CuA′、ScP+RA劃分翅端,形成4個封閉的小室,除端橫脈外無其他橫脈,端橫脈不處于同一水平處,端區(qū)有3條端縱脈:RP、MP′、MP″ +CuA′,RP與MP′脈基部分離(圖2,圖3e); 后翅大而透明,MP和R脈端部愈合,ScP+RA 脈退化,后翅CuA脈端部不分叉(圖2,圖3f)。

圖2 擬帕小綠葉蟬雄成蟲前后翅

圖3 擬帕小綠葉蟬雄成蟲分類特征

2.1.3擬帕小綠葉蟬雄成蟲腹部及外生殖器解剖特征

擬帕小綠葉蟬雄成蟲腹突發(fā)達,于腹腔內平行向后延伸,伸達第6腹節(jié)(圖3d, 4d);尾節(jié)背板和側板愈合,側板向后延伸成尾節(jié)側瓣,側面觀呈三角形,邊緣整齊著生11～14根剛毛(圖3i, 4i);尾節(jié)側瓣后緣突出,形成尾節(jié)突,尾節(jié)突狹窄略彎曲,長度超過尾節(jié)側瓣(圖3l, 4l);尾節(jié)腹部具1對分離的下生殖板,側面觀端部鈍圓,中部較狹窄,向體后方延伸,超過尾節(jié)側瓣,外緣著生許多大剛毛,內緣具成列小剛毛(圖3j, 4j);生殖腔內肛突發(fā)達,端部尖銳,中間兩處凹陷,上具不規(guī)則瘤突,伸達尾節(jié)腹部(圖3h, 4h);連索基部寬闊,端部中部微微向內凹陷,與陽莖分離(圖3g, 4g);生殖腔中央的陽莖端部側觀狹窄,腹面觀中部闊,兩端收狹,陽莖頂端具一對細長突起,陽莖膨大的基部具另一對細長突起,突起端部均不分叉,陽莖口位于陽莖端部,近頂生(圖3m、n, 4m、n);陽基側突基部闊,端半部變狹長,近端部有細剛毛,端部有4個鋸齒突(圖3k, 4k);肛突短闊,側觀略波形彎曲,具3個瘤突,端部不尖銳(圖3h, 4h)。形態(tài)鑒定結果與外生殖器解剖結果與Zhang等[4]前期鑒定的擬帕小綠葉蟬Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenis相吻合。根據文獻資料和解剖觀察喜樹上小綠葉蟬雄蟲外生殖器，根據前人關于擬帕小綠葉蟬外生殖器描述進行手繪，僅供參考(圖3)。但根據相關文獻報道，擬帕小綠葉蟬能取食茶樹等許多植株，通過多種植物葉蟬取食試驗，相關數據表明喜樹上小綠葉蟬只取食喜樹，因此推測該葉蟬可能是喜樹上一種專食性害蟲，要明確其分類地位還需對其進行分子鑒定。

圖4 擬帕小綠葉蟬雄蟲下腹部形態(tài)

2.2 擬帕小綠葉蟬分子鑒定

2.2.1COⅠ基因序列組成及種群間遺傳距離比較分析

本試驗進行了擬帕小綠葉蟬COⅠ片段的PCR擴增,電泳結果顯示得到約760 bp的PCR擴增產物(圖5)。將自測的擬帕小綠葉蟬COⅠ序列與GenBank中檢索的12種葉蟬22條COⅠ序列進行多重比對,非對齊序列剪切后的709 bp片段的分析結果顯示,該基因序列有保守位點228個,變異位點479個,占總位點的67.4%;簡約信息位點384個,占總位點的54.0%,占變異位點的80.1%;95個自裔位點,占總位點的13.3%。A、T、C、G含量分別為25.6%,43.9%,14.4%,16.0%,A+T的平均含量為69.5%,G+C的平均含量為30.5%,明顯存在A+T 含量偏向性,是典型的昆蟲線粒體 DNACOⅠ 序列堿基組成。

圖5 擬帕小綠葉蟬COⅠ基因瓊脂糖凝膠電泳圖

基于 Kimura 2-parameter 模型計算出兩兩序列之間的平均遺傳距離。計算結果顯示同是小綠葉蟬族的11種小綠葉蟬遺傳距離(TV+TS)(即d值)較小,為 0.18～3.14(d<4),其中Empoascadecipiens的一個地方亞種(isolate 2v,HM189292)與擬帕小綠葉蟬遺傳距離最小,為0.18,其次為小貫小綠葉蟬Empoasca(Matsumurasca)onukii(voucher CBY1,MH631465)和木瓜小綠葉蟬Empoascapapayae(isolate EpT,KY931024),遺傳距離分別為0.21、1.70,與同族不同屬的芒果葉蟬屬AmrascaGhauri的Amrascabiguttula和奧小葉蟬屬AustroascaLower的A.viridigrisea(KF226775)遺傳距離分別為3.14、3.05。而擬帕小綠葉蟬與外群的叉脈葉蟬族 Dikraneurini、斑葉蟬族Erythroneurini、塔葉蟬族 Zyginellini、眼小葉蟬族 Alebrini和小葉蟬族 Typhlocybini的遺傳距離除兩個特殊的葉蟬外,d值均大于4,且眼小葉蟬族>小葉蟬族>叉脈葉蟬族>斑葉蟬族,明顯大于其族內遺傳距離(表 1)。

2.2.2系統(tǒng)發(fā)育樹構建及分析

用 MEGA7.0,采用最大似然法構建ML基因進化樹。從擬帕小綠葉蟬和近緣種外群葉蟬的系統(tǒng)進化樹(圖6)可以看出,所有葉蟬科樣本分為2個大支,除小綠葉蟬族 Empoascini外,叉脈葉蟬族 Dikraneurini和小葉蟬族 Typhlocybini等5個族聚成1個穩(wěn)定進化支作為外群,擬帕小綠葉蟬Empoascaparaparvipenis、小貫小綠葉蟬Empoascaonukii、Empoascadecipiens、木瓜小綠葉蟬Empoascapapayae[5]等9個種類的葉蟬聚成一個進化支,又分開成為明顯的2個進化亞支,擬帕小綠葉蟬Empoascaparaparvipenis與小貫小綠葉蟬Empoascaonukii(voucher CBY1)的一個地方種以較高的置信度先分化出來,相聚到同一個進化亞支下,后與其他同屬的木瓜小綠葉蟬Empoascapapayae、Empoascadecipiens等聚為一支。

圖6 基于葉蟬COⅠ基因片段構建的ML系統(tǒng)進化樹

形態(tài)學上解剖后通過對照小綠葉蟬族分屬檢索表[6],擬帕小綠葉蟬體纖弱,頭冠前端鈍圓突出,冠縫明顯,未達頭冠前緣,單眼位于頭冠與顏面交界處, 顏面寬闊, 寬度略小于中長, 額唇基區(qū)隆起; 胸長大于頭長;前翅 RP、MP′脈共柄, 后翅 CuA 端部不分叉;腹突發(fā)達, 有尾節(jié)突;下生殖板具大剛毛, 大剛毛列外側常具細剛毛;陽基側突長, 近端部有細剛毛, 端部有鋸齒突;陽莖前腔較發(fā)達;肛突側觀明顯等特點將其歸屬于小綠葉蟬屬EmpoascaWalsh。再對照小綠葉蟬屬亞屬檢索表[5]來看,擬帕小綠葉蟬前翅RP、MP′脈基部起自一點,且具一對明顯的腹突,應將其歸屬于松村葉蟬亞屬Empoasca(Matsumurasca)Anufnev。分子上結合表1各物種之間的遺傳距離,說明擬帕小綠葉蟬與小貫小綠葉蟬的遺傳關系很近,但是它們之間遺傳距離大于2%的物種界限,并不是一個種。再從系統(tǒng)發(fā)育樹來看,小貫小綠葉蟬Empoasca(Matsumurasca)onukii(voucher CBY1)和Empoascadecipiens(isolate 2v)都與擬帕小綠葉蟬Empoascaparaparvipenis親緣關系很近,而小貫小綠葉蟬屬于松村葉蟬亞屬Empoasca(Matsumurasca)Anufriev,Empoascadecipiens屬于小綠葉蟬屬,但亞屬不明確。形態(tài)解剖和COⅠ序列對擬帕小綠葉蟬的分類地位一致,因此確定擬帕小綠葉蟬屬于松村葉蟬亞屬Empoasca(Matsumurasca)Anufriev。

3 結論與討論

小綠葉蟬種類繁多,寄主范圍廣,分布地域遼闊,除了對植物的直接取食為害,還傳播病毒和植原體等引起病害,對農林牧業(yè)造成巨大的經濟損失[7]。1985年趙建華等就報道了喜樹叢枝病是由一種類菌原體(植原體)引起。1990年張務民等報道了為害喜樹的幾種葉蟬,其中就有小綠葉蟬[8],但后期對于喜樹病蟲害的研究越來越少,直到2006年貴州大學的龍同等因為喜樹上小綠葉蟬為害嚴重,對其進行了生物學、生態(tài)學及防治研究[9],但對于該種具體分類地位并未明確,一直以喜樹小綠葉蟬為名。后由Zhang等[4]通過形態(tài)學鑒定后將其暫命名為Empoasca(Empoasca)paraparvipenis(擬帕小綠葉蟬)。

本研究通過形態(tài)學和分子鑒定確定了喜樹叢枝植原體主要傳播媒介是小綠葉蟬屬Empoasca松村葉蟬亞屬Empoasca(Matsumurasca)Anufriev的擬帕小綠葉蟬Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenisZhangetLiu-CA,除外生殖器上陽莖無突起,肛突端部弧形彎曲,略收狹,末端不尖銳外,各齡期及雌雄成蟲的形態(tài)及外生殖器解剖結果與小貫小綠葉蟬Empoasca(Matsumurasca)onukii十分相似,說明擬帕小綠葉蟬與小貫小綠葉蟬親緣關系很近。通過COⅠ基因的擴增和構建系統(tǒng)進化樹,擬帕小綠葉蟬與小貫小綠葉蟬以較高的置信度首先分化出來聚為一支,遺傳距離結果也表明擬帕小綠葉蟬與小貫小綠葉蟬親緣關系十分接近,但d值大于2%的物種距離,因此擬帕小綠葉蟬應該是單獨的一個種,與Zhang等[4]鑒定的結果一致,由于本文所用擬帕小綠葉蟬采集地點在云南文山,又通過取食試驗驗證了從文山捕捉的擬帕小綠葉蟬不會取食茶樹,因此可能是由于地理隔離,而進化成了另一個地方亞種,因此將其命名為EmpoascaparaparvipenisZhangetLiu-CA。

分析擬帕小綠葉蟬COⅠ基因序列,該基因序列A+T的平均含量為69.5%,G+C的平均含量為30.5%,明顯存在A+T含量偏向性。該基因序列保守位點228個,變異位點479個,占總位點的67.4%;簡約信息位點384個,占總位點的54.0%,占變異位點的80.1%;95個自裔位點,占總位點的13.3%。說明COⅠ基因能夠為小綠葉蟬系統(tǒng)發(fā)育關系提供足夠的信息簡約位點,這與肖金花的結論相吻合[10]。COⅠ基因序列不僅可用來研究科內或屬內種群的系統(tǒng)發(fā)育問題[11],且對于同屬的種間甚至地方亞種間的系統(tǒng)發(fā)育問題也可以有很準確的分析。

從本次研究可看出,同屬內不同種間遺傳距離最小,通過擬帕小綠葉蟬Empoasca(Matsumurasca)paraparvipenisZhangetLiu-CA和Empoascadecipiens(isolate 2v)的遺傳距離來看,同屬不同種的遺傳距離d<1;同屬不同亞屬間的遺傳距離14;但往往由于長期地理隔離,同屬內不同種,或者同族內不同屬會形成較遠的親緣關系,如本文中長綠葉蟬亞屬Empoasca(Kybos)Fieber的黃褐長綠葉蟬Empoasca(Kybos)purus與同族的親緣關系都很遠,卻與小葉蟬族的Typhlocybamodesta遺傳距離十分近,斑葉蟬族Erythroneurini的Erythroneuratricincta和塔葉蟬族 Zyginellini 的Zyginellaminuta與小綠葉蟬族的擬帕小綠葉蟬的遺傳距離也很近,而與同族的較遠,這與劉雲祥的地理隔離和寄主轉變對昆蟲的表型和遺傳分化具有重要影響的結論一致[12]。

經過前期試驗以及文獻報道發(fā)現喜樹似乎是擬帕小綠葉蟬的專性寄主,取食寄主的?；允欠衽c擬帕小綠葉蟬與小貫小綠葉蟬的系統(tǒng)進化有關,還有待深入研究。昆蟲的系統(tǒng)進化往往與其長期所處的環(huán)境和食物密切相關,相似的地理環(huán)境和食物可能會導致其外部形態(tài)十分相似,肉眼難以辨認[13]。隨著分子生物技術的飛速發(fā)展,利用分子技術鑒定昆蟲種類已經越來越普遍,但因為分子試驗人為因素較大,要準確鑒定新的昆蟲種類以及明確其分類地位,還需傳統(tǒng)的形態(tài)學和分子方法相結合進行鑒定,先通過外部形態(tài)觀察,大體定位其科屬,再利用分子學方法建立系統(tǒng)進化樹,分析大概的親緣關系,再根據親緣關系進行雄性外生殖器的解剖,最后綜合解剖結果對照種屬檢索表確定其分類地位。