Harelish負(fù)向調(diào)控棉鈴蟲(chóng)性信息素生物合成機(jī)制的初步研究

姚雙艷, 張 耀, 楊 越, 舍澤龍, 王 煥, 卞會(huì)敏,吳雪明, 魏紀(jì)珍, 安世恒

(小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南省害蟲(chóng)綠色防控國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 鄭州 450002)

棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),為害棉花、小麥、煙草、花生等多種作物,在世界范圍內(nèi)廣泛分布[1-3]。長(zhǎng)期以來(lái),化學(xué)防治是防治棉鈴蟲(chóng)的重要手段之一,可以在短時(shí)間內(nèi)迅速且有效地控制棉鈴蟲(chóng)種群數(shù)量,進(jìn)而確保農(nóng)作物產(chǎn)量[1]。但化學(xué)防治中產(chǎn)生的諸多問(wèn)題,尤其是棉鈴蟲(chóng)抗藥性的快速發(fā)展,迫使研究者尋求更安全更有效的防治方法。隨著轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)殺蟲(chóng)蛋白棉花的大面積種植,棉鈴蟲(chóng)的為害再次得到了很好的控制[4]。但隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整,非轉(zhuǎn)Bt作物上棉鈴蟲(chóng)為害更加猖獗[5]。同時(shí),在轉(zhuǎn)Bt基因作物持續(xù)的高壓選擇下,棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt蛋白的抗性也逐漸凸顯[4]。因此,從多維度研究和探索棉鈴蟲(chóng)的防治方法勢(shì)在必行。

棉鈴蟲(chóng)除寄主廣、遷移能力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)外,巨大的繁殖潛能也是其暴發(fā)成災(zāi)、連年猖獗的重要原因。性信息素是昆蟲(chóng)交配繁殖的關(guān)鍵化學(xué)信號(hào)[6]。在蛾類中,主要是由雌蛾釋放性信息素吸引雄蛾前來(lái)交配[7]。因此,干擾雌蛾的性信息素生物合成可以有效影響雌雄蛾的交配,進(jìn)而降低后代種群數(shù)目,最終達(dá)到防治害蟲(chóng)的目的。所以,探索和開(kāi)發(fā)影響棉鈴蟲(chóng)性信息素生物合成的相關(guān)基因?qū)ζ浞乐尉哂兄匾饬x。

NF-κB是廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中,特異性結(jié)合免疫球蛋白,進(jìn)而促進(jìn)免疫相關(guān)基因表達(dá)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。大量研究表明,NF-κB廣泛參與多細(xì)胞動(dòng)物的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)發(fā)育[9-10]。NF-κB家族主要包括Relish、Dorsal和Dif3個(gè)成員,這些基因在進(jìn)化過(guò)程中高度保守[11]。由于獲得性免疫系統(tǒng)的缺失,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)化出一套復(fù)雜而高效的免疫體系[12]。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中,Relish不僅通過(guò)免疫缺陷(immunodeficiency,IMD)信號(hào)通路介導(dǎo)抗革蘭氏陰性菌的免疫過(guò)程[13];還可以通過(guò)靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β-活化激酶1(transforming growth factor-β-activating kinase 1,TAK1)調(diào)控c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[14];在斜紋夜蛾Spodopteralitura中也證實(shí)了IMD通路下游的Relish參與調(diào)控大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)引起的斜紋夜蛾的免疫反應(yīng)[15];在柞蠶Antheraeapernyi中,Relish通過(guò)調(diào)控自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5,ATG5)的活性進(jìn)而調(diào)控其先天性免疫[11]。在甲殼動(dòng)物三疣梭子蟹Portunustrituberculatus等和節(jié)肢動(dòng)物中國(guó)明對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis、羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii等物種也證實(shí)Relish參與其免疫過(guò)程[16-19]。

目前對(duì)Relish的研究多集中于其在先天性免疫應(yīng)答中的作用,在蛾類性信息素生物合成中的功能未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)Harelish在性信息素生物合成中的功能進(jìn)行研究,分析了Harelish對(duì)棉鈴蟲(chóng)性信息素生物合成關(guān)鍵酶鈣調(diào)磷酸酶(CaN)活性和性信息素含量的影響,以期為通過(guò)性信息素生物合成通路進(jìn)行防蟲(chóng)控蟲(chóng)提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)飼養(yǎng)

棉鈴蟲(chóng)卵購(gòu)自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司,在室內(nèi)以人工飼料于人工氣候箱[溫度(26±1)℃,相對(duì)濕度(75±1)%,光周期L∥D=14 h∥10 h]中飼養(yǎng)多代[20-21]。

1.2 時(shí)空表達(dá)樣品準(zhǔn)備

不同組織樣品準(zhǔn)備:解剖羽化后48 h的棉鈴蟲(chóng)雌蛾,分別取中腸(midgut,MG)、表皮(epidermis,EP)、腦(brain,Br)、觸角(antennae,Ant)、脂肪體(fat body,FB)、肌肉(muscle,MS)和性信息素腺體(sex pheromone gland,PG)等組織,用TRIzol試劑(Invitrogen,美國(guó))提取其RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于后續(xù)熒光定量檢測(cè)。

不同時(shí)期樣品準(zhǔn)備:解剖分離不同時(shí)期,即羽化前72 h(標(biāo)記為-72 h)、羽化前48 h(標(biāo)記為-48 h)、羽化前24 h(標(biāo)記為-24 h),新羽化(標(biāo)記為0 h)、羽化后24 h(標(biāo)記為24 h)、羽化后48 h(標(biāo)記為48 h)和羽化后72 h(標(biāo)記為72 h)的性信息素腺體,以解剖鑷在顯微鏡下處理干凈后,用TRIzol試劑提取其RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于后續(xù)熒光定量檢測(cè)。

1.3 dsRNA體外合成和RNAi

按照T7 RNAi Transcription試劑盒(TR102)(諾唯贊,中國(guó))說(shuō)明書(shū)體外合成dsRNA。首先,以性信息素腺體cDNA和包含T7啟動(dòng)子的特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,純化PCR產(chǎn)物作為后續(xù)合成dsRNA的模板。取純化PCR產(chǎn)物1 μg,加入NTP Mix 8 μL，10× Transcription Buffer 2 μL 和T7 Enzyme Mix 2 μL,以RNase-free H2O補(bǔ)足20 μL后放入PCR儀中37℃反應(yīng)2 h,以合成dsRNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合成的dsRNA質(zhì)量,然后用酚/氯仿對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行抽提純化,并用Nanodrop 2000紫外微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))測(cè)定dsHarelish的濃度。以合成的增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein gene, EGFP)的dsRNA作為對(duì)照。

表1 本試驗(yàn)所用的引物

將新羽化的棉鈴蟲(chóng)雌蛾頭部剪除,并置于室溫24 h。將體外合成的dsHarelish以10 μg/頭的量注射入預(yù)處理的雌蛾體內(nèi),置于室溫24 h后取其性信息素腺體,-20℃保存,用于后續(xù)熒光定量檢測(cè)、GC-MS和酶活測(cè)定。以注射dsEGFP的雌蛾作為對(duì)照。每處理注射15頭,3次重復(fù)。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)

使用TRIzol試劑提取樣品總RNA,并通過(guò)Nanodrop2000紫外微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和質(zhì)量。采用HiScript Ⅲ RT SuperMix試劑盒(諾唯贊,中國(guó))合成cDNA,作為熒光定量PCR的模板。采用Actin(ACT)和Elongation factor 1 alpha(EF-1α)作為內(nèi)參基因,在ABI 7500 PCR儀器上使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊,中國(guó))對(duì)Harelish的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性15 s和60℃延伸20 s,循環(huán)40次。采用雙內(nèi)參法對(duì)Harelish基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行量化[22]。

1.5 性信息素Z11-16∶Ald含量檢測(cè)

處理組和對(duì)照組分別注射dsHarelish和dsEGFP后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再依次按照10 pmol/頭的量注射體外合成的具有活性的性信息素合成激活肽(pheromone biosynthetic activating neuropeptide,PBAN)溶液,并于28℃培養(yǎng)1 h,取性信息素腺體置于200 μL正己烷中。將萃取后的正己烷樣品上機(jī)(安捷倫7890B),參照Yao等的方法設(shè)定檢測(cè)程序[23],快速升溫至60℃保持2 min,然后以5℃/min升溫至230℃,在此期間性信息素組分全部洗脫;隨后以20℃/min的速度將柱子(安捷倫HP-5MS)加熱至245℃,并在此溫度下保持15 min;最后將氫火焰離子檢測(cè)器(FID檢測(cè)器)保持在250℃,對(duì)樣品組分進(jìn)行檢測(cè)。采用面積歸一法對(duì)性信息素主要組分Z11-16∶Ald的含量進(jìn)行量化。進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣品由15頭性信息素腺體組成。

1.6 CaN酶活測(cè)定

斷頭處理的雌蛾按10 μg/頭分別注射dsHarelish和dsEGFP,室溫繼續(xù)飼養(yǎng)24 h。解剖性信息素腺體,置于昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)液(Grace’s Insect Cell Culture Medium)中,用PBAN(10 pmol/L)孵育30 min后將性信息素腺體收集到1.5 mL的離心管中進(jìn)行研磨和離心，上清分為兩份置于冰上。取其中一份,以蛋白定量測(cè)定試劑盒(南京建成,中國(guó))測(cè)定其蛋白濃度;另一份則按照鈣調(diào)磷酸酶(CaN)檢測(cè)試劑盒(南京建成,中國(guó))說(shuō)明書(shū)和Du等[6]的方法進(jìn)行CaN活性檢測(cè)。進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)重復(fù)包含40頭性信息素腺體樣品。

1.7 數(shù)據(jù)處理

本研究中,所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù),數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010整理,統(tǒng)計(jì)結(jié)果后使用GraphPad Prism 8.3.0繪制柱狀圖。不同時(shí)期和不同組織中Harelish的表達(dá)量差異采用Tukey’s test進(jìn)行多重比較(α=0.05, DPS 7.05)。Harelish基因的RNAi效果及后續(xù)的性信息素含量和CaN活性檢測(cè)均以IBM SPSS Statistics 23中的Student’st測(cè)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織中Harelish表達(dá)量分析

實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Harelish基因在棉鈴蟲(chóng)雌蛾中腸、表皮、腦、觸角、脂肪體、肌肉和性信息素腺體中均有表達(dá),在觸角中表達(dá)量最高,肌肉組織中表達(dá)量最低,在性信息素腺體中具有較高的表達(dá)量(圖1)。

圖1 棉鈴蟲(chóng)雌蛾不同組織Harelish基因的表達(dá)量

2.2 不同發(fā)育時(shí)期Harelish表達(dá)量分析

對(duì)Harelish基因在棉鈴蟲(chóng)性信息素腺體不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示Harelish在羽化前72 h和羽化前48 h具有較高的表達(dá)量,在羽化前24 h表達(dá)量最低,之后,隨著性信息素腺體發(fā)育成熟以及羽化后性信息素的釋放,Harelish的表達(dá)量不斷升高,在羽化后24 h達(dá)到最高(圖2)。

圖2 不同發(fā)育時(shí)間性信息素腺體中Harelish基因的表達(dá)量

2.3 對(duì)Harelish的干擾效果

將體外合成的EGFP和Harelish的dsRNA注射入新羽化并斷頭的棉鈴蟲(chóng)雌蛾體內(nèi),以qRT-PCR檢測(cè)RNAi效果。結(jié)果顯示,與注射dsEGFP的對(duì)照相比,注射dsHarelish顯著降低Harelish的相對(duì)表達(dá)量約54%(圖3)。

圖3 RNAi誘導(dǎo)的Harelish基因在性信息素腺體中的干涉效果

2.4 Harelish對(duì)性信息素生物合成量的影響

確認(rèn)體外合成的dsRNA具有良好的RNAi效果后,進(jìn)一步以GC-MS檢測(cè)Harelish轉(zhuǎn)錄水平的降低對(duì)棉鈴蟲(chóng)性信息素Z11-16∶Ald含量的影響。結(jié)果顯示,Harelish轉(zhuǎn)錄水平降低后,Z11-16∶Ald相對(duì)含量也顯著上調(diào)約56%(圖4)。

圖4 RNAi誘導(dǎo)的Harelish基因沉默對(duì)性信息素生物合成的影響

2.5 Harelish對(duì)CaN活性的影響

對(duì)dsEGFP和dsHarelish處理后棉鈴蟲(chóng)雌蛾性信息素腺體中的CaN活性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Harelish轉(zhuǎn)錄水平的降低可以引起CaN活性的顯著上調(diào)(圖5)。

圖5 RNAi誘導(dǎo)的Harelish基因沉默對(duì)CaN活性的影響

3 結(jié)論與討論

通過(guò)分析Harelish基因在棉鈴蟲(chóng)雌蛾不同組織中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)其在棉鈴蟲(chóng)雌蛾中腸、表皮、腦、觸角、脂肪體、肌肉和性信息素腺體等7個(gè)組織中均有表達(dá),但表達(dá)量有所差異。該結(jié)果與斜紋夜蛾、三疣梭子蟹、中國(guó)明對(duì)蝦、羅氏沼蝦等物種中的研究結(jié)果相似[16-19],均表明了該基因在不同組織中的普遍表達(dá)。Relish是NF-κB家族的重要成員,參與了斜紋夜蛾、黑腹果蠅、柞蠶等昆蟲(chóng)的IMD免疫信號(hào)通路[11, 13, 15]。脂肪體是昆蟲(chóng)重要的免疫組織,Harelish基因在脂肪體中具有較高表達(dá)量說(shuō)明該基因參與了棉鈴蟲(chóng)的免疫反應(yīng),該結(jié)果同家蠶Bombyxmori、斜紋夜蛾中的研究結(jié)果一致[15, 24]。盡管Harelish基因在各個(gè)組織或器官中均廣泛存在,但目前關(guān)于該基因的研究則集中于其參與生物體的免疫過(guò)程,對(duì)該基因在其他組織中的功能鮮有研究。該基因在棉鈴蟲(chóng)雌蛾性信息素腺體中具有較高的表達(dá)量,表明其在性信息素腺體中可能行使特定的生物學(xué)功能。

NF-κB家族是一種具有多種生理功能的轉(zhuǎn)錄因子,除參與機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)外,還參與了細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[25]。昆蟲(chóng)蛹期時(shí)其內(nèi)部進(jìn)行著劇烈的組織解離和組織發(fā)生的生理活動(dòng),這也和本研究中Harelish基因在蛹期具有較高的表達(dá)量相一致。隨著成蟲(chóng)羽化后,其表達(dá)量逐漸升高,在24 h達(dá)到最高,48 h和72 h亦具有較高表達(dá)量。在家蠶、棉鈴蟲(chóng)、亞洲玉米螟、黏蟲(chóng)Mythimnaseparata、斜紋夜蛾等鱗翅目蛾類中,雌蛾羽化后其性信息素開(kāi)始合成和釋放,但是性信息素釋放的模式卻不盡相同[6, 23, 25-26]。其中家蠶羽化后立即釋放性信息素[26-27],斜紋夜蛾在羽化后第1個(gè)暗夜其性信息素釋放達(dá)到高峰[27],棉鈴蟲(chóng)和亞洲玉米螟在羽化后3 d均大量釋放性信息素,在第2個(gè)暗夜其性信息素釋放和交配率均達(dá)到高峰[6, 23]。Harelish基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式與其性信息素釋放模式相一致。同時(shí),棉鈴蟲(chóng)、家蠶和亞洲玉米螟性信息素合成相關(guān)基因PBANR、CaN、ACC、去飽和酶、FAR等均具有相似的表達(dá)模式[6, 23, 27]。最后,基于RNAi誘導(dǎo)的Harelish基因沉默對(duì)性信息素含量的影響,進(jìn)一步證實(shí)了Harelish基因參與了棉鈴蟲(chóng)性信息素生物合成。

在家蠶、棉鈴蟲(chóng)、亞洲玉米螟等蛾類性信息素生物合成的研究中,PBANR、CaN、ACC、去飽和酶、FAR等基因轉(zhuǎn)錄水平下降引起雌蛾性信息素含量下降,即這些基因正向調(diào)控了蛾類性信息素的生物合成[6, 23, 27]。而在本研究中,Harelish基因轉(zhuǎn)錄水平降低時(shí),其性信息素含量上升。該結(jié)果意味著Harelish基因負(fù)向調(diào)控了棉鈴蟲(chóng)的性信息素生物合成,這也是鱗翅目蛾類性信息素生物合成中首次關(guān)于抑制因子的研究。

在棉鈴蟲(chóng)中,其性信息素的生物合成通路已進(jìn)行了明確而詳盡的闡述。主要的通路為:CaN由相應(yīng)的第二信使Ca2+激活后,通過(guò)激活下游信號(hào)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC),進(jìn)而調(diào)控了其性信息素的生物合成過(guò)程[6]。同時(shí)CaN也被證實(shí)參與了家蠶、美洲棉鈴蟲(chóng)Helicoverpazea、黏蟲(chóng)、亞洲玉米螟等多種蛾類的性信息素生物合成[6, 23, 27]。本研究中,Harelish基因轉(zhuǎn)錄水平降低時(shí),CaN活性升高。該結(jié)果與性信息素檢測(cè)結(jié)果一致,即Harelish基因通過(guò)抑制性信息素生物合成關(guān)鍵酶CaN,進(jìn)而抑制了棉鈴蟲(chóng)性信息素的生物合成。但是Harelish基因如何調(diào)控CaN還需要進(jìn)一步研究。