雙香豆素誘導(dǎo)斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞程序性死亡的機理研究

秦子昕, 邵雪花, 梁 赫, 溫雪梅, 路 偉*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,棉花教育部工程研究中心, 自治區(qū)農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點實驗室, 烏魯木齊 830052; 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室, 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室, 廣州 510640)

斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae[1]。其幼蟲可取食蔬菜、果樹、煙草、棉花及其他作物的葉、花蕾、花及果實等[2-3],對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅。目前,斜紋夜蛾等鱗翅目害蟲的防控主要依靠化學(xué)農(nóng)藥[4],但部分化學(xué)農(nóng)藥毒性高、殘留嚴(yán)重,施藥后無法及時轉(zhuǎn)運至嫩梢葉片,使得施藥部位與害蟲為害部位存在位差,需要頻繁施藥防控?；瘜W(xué)農(nóng)藥的頻繁使用,不僅對生物多樣性造成了極大威脅,而且導(dǎo)致了害蟲抗藥性、農(nóng)藥殘留超標(biāo)、土壤板結(jié)、環(huán)境污染等諸多問題[5-7];此外,近年來化學(xué)農(nóng)藥的大量及不合理使用加大了斜紋夜蛾的選擇壓,對其防治效果日趨下降[8-9],故挖掘針對斜紋夜蛾等鱗翅目害蟲的天然活性化合物具有重要現(xiàn)實意義。

香豆素(coumarin)又稱香豆精、香豆內(nèi)酯、1,2-苯并吡喃酮,廣泛存在于自然界中,在蕓香科、傘形科及桑科植物中含量較高,在豆科、蘭科、木樨科、茄科和菊科植物中也有廣泛分布,同時還是部分微生物代謝的主要產(chǎn)物[10-12]。近年來,香豆素因具有多種生物活性,已成為醫(yī)藥、農(nóng)藥等行業(yè)的開發(fā)研究熱點。雙香豆素(dicoumarin,DIC)屬于香豆素類,也是一種1,2-苯并吡喃酮類化合物,最早作為一種抗凝血劑應(yīng)用于醫(yī)學(xué)。隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)雙香豆素還具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗HCV、抗HIV、抗老年癡呆、抗瘧疾、抗寄生蟲、細(xì)胞毒性等多種生物活性[13-14]。

魏靜等的研究表明,人肝癌細(xì)胞(Hep G2)對雙香豆素表現(xiàn)出較強的敏感性,IC50為(3.19±0.68)μmol/L,且雙香豆素對Hep G2細(xì)胞的抑制作用呈劑量和時間依賴性[15]。Mazumder等研究了一系列雙香豆素衍生物的抗病毒活性,發(fā)現(xiàn)雙香豆素衍生物NSC 158393對HIV-2、貓和猴免疫缺陷病毒整合酶具有良好的抑制活性,IC50為0.8～2.3 μmol/L[16]。Katsori等的研究顯示,香豆素的物理化學(xué)性質(zhì)與其生物活性強弱密切相關(guān),在C3、C4和C7位置具有多種藥效基團的合成香豆素已用于抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗炎、抗真菌、抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)和抗痤瘡活性研究[17]。Reddy等的研究表明,硫代香豆素、3-芳基-8-烯丙基-7-羥基-香豆素、三唑基香豆素和肽偶聯(lián)香豆素甲酰胺的雜化物對哺乳動物癌細(xì)胞系表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒性和抗菌活性[18]。楊麗君等的研究顯示,呋喃香豆素類和雙香豆素類化合物具有良好的殺線蟲活性,在病害防治方面也展現(xiàn)出廣闊的探索價值[19]。

利用離體細(xì)胞進行毒性測定是一種穩(wěn)定、高效、靈敏的檢測方法,該方法具備耗藥量少、靈敏、簡便、周期短、適宜于快速篩選、試驗條件易于控制、節(jié)約人工等優(yōu)點[20-23]。故本文以斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞系SL-221和雙香豆素為研究對象,擬通過CCK-8法檢測不同濃度下雙香豆素對SL-221細(xì)胞的毒性,并采用流式細(xì)胞術(shù)測定該化合物對細(xì)胞周期、線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡的影響;最后,利用實時熒光定量PCR技術(shù)探索營養(yǎng)信號通路(PI3K/TOR)上關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。旨在從細(xì)胞水平上初步探討雙香豆素對SL-221細(xì)胞增殖的抑制活性及其作用機理,以期為雙香豆素的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ),同時為斜紋夜蛾的生物防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑及細(xì)胞

雙香豆素,分子式C19H12O6,分子量336.30,CAS號:66-76-2,由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所資源與環(huán)境實驗室提供,結(jié)構(gòu)式見圖1。印楝素購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;佛手柑內(nèi)酯、茴芹內(nèi)酯、異茴芹內(nèi)酯、異歐前胡素、甲氧基香豆素、檸檬油素、傘形花內(nèi)酯、異牡荊黃素、番石榴苷、東莨菪苷、根皮苷、(-)-沒食子兒茶素、(-)-表沒食子兒茶素、(+)-表兒茶素、香葉木素7-O-beta-D-葡萄糖苷、(±)-兒茶精、(-)-兒茶素、槲皮素、沒食子酸、沒食子酸甲酯購自四川維克奇生物科技有限公司。斜紋夜蛾Spodopteralitura卵巢細(xì)胞SL-221,由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所資源與環(huán)境實驗室培養(yǎng)。

圖1 雙香豆素結(jié)構(gòu)式

1.2 試驗方法

1.2.1斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞SL-211培養(yǎng)

將SL-211凍存管從液氮中取出,迅速投入37℃水浴使細(xì)胞融化,細(xì)胞融化后用酒精棉球擦拭凍存管表面以消毒,之后在超凈工作臺中將細(xì)胞液轉(zhuǎn)入離心管,800 r/min離心3 min。去上清,加入1 mL SIM SF昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液接入培養(yǎng)瓶中,補足培養(yǎng)液至3 mL,放入27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到85%～90%時,棄去原培養(yǎng)基,加入3 mL新的SIM SF昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(含5%胎牛血清),用一次性吸管輕柔吹打細(xì)胞使其脫壁分散,并分裝傳代。之后每2 d傳代細(xì)胞一次,定期觀察記錄細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.2CCK-8法檢測化合物對斜紋夜蛾SL-211細(xì)胞的毒性

用Cell Counting Kit(簡稱CCK-8試劑盒，北京聚合美生物科技有限公司)檢測雙香豆素等21個酚類化合物對SL-221細(xì)胞的毒性。取對數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的SL-221細(xì)胞,用吸管將貼壁細(xì)胞輕柔吹打脫壁,并用SIM SF昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×105個/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板,每孔100 μL,置于27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。用細(xì)胞培養(yǎng)級二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)將供試化合物配制成母液。試驗前用無血清SIM SF培養(yǎng)基將藥液倍比稀釋至0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL。棄去96孔板中原有培養(yǎng)基,分別加入不同濃度含藥培養(yǎng)基,每個濃度4個重復(fù)。以含0.1% DMSO無血清培養(yǎng)基作為空白對照,相同濃度的印楝素作為陽性對照,置于27℃恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h。48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,之后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)避光孵育2 h,用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度,并按照公式計算細(xì)胞抑制率,細(xì)胞抑制率為50%的值即為IC50。

細(xì)胞抑制率=(A零加藥-A加藥)/(A零加藥-A空白)×100%。

式中,A零加藥表示含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8溶液、0.1% DMSO,無待測化合物的孔的吸光度。A加藥表示含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8溶液、待測化合物的孔的吸光度。A空白表示含培養(yǎng)基、CCK-8溶液、待測化合物,無細(xì)胞的孔的吸光度。

1.2.3雙香豆素處理后斜紋夜蛾SL-211細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)CCK-8法篩選,雙香豆素對SL-221細(xì)胞增殖活性的抑制率最高,選用雙香豆素做后續(xù)機理研究。6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中接種2 mL對數(shù)生長期的SL-221細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約為5×105個/mL),置于27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后吸去SIM SF培養(yǎng)基,更換為含有4 μg/mL雙香豆素的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。藥劑分別處理細(xì)胞0、3、6、12、24、48 h,其中0 h為對照,于倒置顯微鏡下觀察,并拍照記錄細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細(xì)胞周期的影響

配制含1 μg/mL雙香豆素的無血清SIM SF培養(yǎng)基備用。取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的SL-221細(xì)胞以5×106個/mL密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。棄去原有培養(yǎng)基,加入含藥培養(yǎng)基,以含0.1% DMSO無血清培養(yǎng)基為對照。27℃恒溫培養(yǎng)箱分別孵育0、3、6、12、24、48 h后收集細(xì)胞,其中0 h為對照,每板設(shè)為1組,其中每孔對應(yīng)1個處理時間,每個處理時間重復(fù)3組。采用DNA含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)檢測細(xì)胞各個時期DNA含量。用PBS洗滌細(xì)胞2次,70%乙醇固定細(xì)胞,4℃冰箱過夜。次日用PBS洗滌細(xì)胞2次,之后加入100 μL RNaseA溶液,37℃水浴30 min,再加入400 μL PI染色液4℃避光孵育30 min。完成后立即用流式細(xì)胞儀(BD FACS)在激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長617 nm處檢測PI(紅色)熒光,FlowJo軟件統(tǒng)計分析G0/G1(DNA合成前期)、S(DNA合成期)、G2/M(DNA合成后期)的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5JC-1熒光標(biāo)記法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細(xì)胞線粒體膜電位的影響

細(xì)胞處理方法同1.2.4。分別收集經(jīng)1 μg/mL雙香豆素處理0、3、6、12、24、48 h的細(xì)胞,其中0 h為對照,用PBS清洗細(xì)胞2次。按照線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，北京索萊寶科技有限公司)使用說明,加入1 mL JC-1染色工作液,37℃避光孵育30 min,后用JC-1染色緩沖液清洗細(xì)胞2次,1 mL JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長585 nm,發(fā)射波長590 nm處的PE(紅色)熒光;激發(fā)波長515 nm,發(fā)射波長529 nm處FITC(綠色)熒光,并計算紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體膜電位的變化情況(紅綠熒光的相對比例=紅色熒光百分比/綠色熒光百分比)。

1.2.6Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞處理方法同1.2.4。分別收集經(jīng)1 μg/mL雙香豆素處理0、3、6、12、24、48 h的細(xì)胞,其中0 h為對照,800 r/min離心3 min,用PBS清洗細(xì)胞2次。之后用Binding buffer重懸細(xì)胞,然后按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)說明書加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液與10 μL PI染液,室溫避光雙染細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長535 nm,發(fā)射波長615 nm處的PI(紅色)熒光;激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm處的FITC(綠色)熒光,并用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7RT-qPCR法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-211細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況的影響

采用RT-qPCR檢測斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬相關(guān)基因(SL-Bcl-2、SL-PI3K、SL-TOR、SL-P53、SL-CytoC、SL-Atg8)的表達(dá)情況,以SL-Actin為內(nèi)參基因。引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。細(xì)胞處理方法同1.2.4,收集經(jīng)1、2、4 μg/mL雙香豆素分別處理0、3、6、12、24、48 h的SL-221細(xì)胞,其中0 h為對照,用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Applied Biosystems實時熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng),體系(10 μL):cDNA 1 μL、2×M5 HiPer Real time PCR Super mix with Low Rox 5 μL、上、下游引物共0.5 μL,RNase Free ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。重復(fù)3次。通過RT-qPCR可以得到目的基因與內(nèi)參基因的Ct值,Ct值表示熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù),Ct值與樣本起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,即Ct值越小,起始拷貝數(shù)就越多,利用2-ΔΔCt(ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組)計算出不同處理時間下的SL-221細(xì)胞基因相對表達(dá)量。

表1 斜紋夜蛾生長發(fā)育相關(guān)基因 RT-qPCR 所需引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗結(jié)果均為3次以上重復(fù)試驗統(tǒng)計獲得,運用IBM SPSS Statistics 26軟件分析數(shù)據(jù),結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,各處理組所得平均值之間的差異通過單因素方差分析及Duncan氏多重比較進行檢驗評估,P<0.05表示在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8法檢測化合物對斜紋夜蛾SL-211細(xì)胞的毒性

21個供試藥劑中雙香豆素對SL-221細(xì)胞的抑制活性最高[48 h抑制中濃度(IC50)為0.85 μg/mL],是陽性對照印楝素(48 h IC50為7.20 μg/mL)的8.47倍(表2)。在21個化合物中,檸檬油素、甲氧基香豆素、茴芹內(nèi)酯、異歐前胡素、傘形花內(nèi)酯也展現(xiàn)出良好的細(xì)胞抑制活性,其IC50分別為7.23、8.76、8.81、9.62、9.63 μg/mL。異牡荊黃素、根皮苷、沒食子酸、沒食子酸甲酯、東莨菪苷、(±)-兒茶精、異茴芹內(nèi)酯、(-)-兒茶素、番石榴苷的細(xì)胞抑制活性次之,其IC50分別為10.24、11.64、11.81、12.44、13.12、15.73、17.05、17.21、18.38 μg/mL;佛手柑內(nèi)酯、(+)-表兒茶素、槲皮素、(-)-表沒食子兒茶素、(-)-沒食子兒茶素、香葉木素7-O-beta-D-葡萄糖苷的細(xì)胞抑制活性較差。

表2 21種酚類化合物對斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞SL-211的毒力

0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL雙香豆素作用于SL-221細(xì)胞,48 h后細(xì)胞抑制率分別為49.00%、65.00%、68.94%、80.82%、91.60%、93.55%、95.13%(圖2)。表明雙香豆素對SL-221細(xì)胞具有良好的抑制增殖活性,且呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖2 雙香豆素處理斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞48 h的細(xì)胞抑制率

2.2 雙香豆素處理后斜紋夜蛾SL-221細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

利用倒置顯微鏡觀察4 μg/mL雙香豆素處理SL-221細(xì)胞不同時間其形態(tài)的變化(圖3)。結(jié)果顯示,0 h時細(xì)胞外部形態(tài)飽滿,細(xì)胞膜光滑通透,呈不規(guī)則圓形或梭形,貼壁生長狀態(tài)良好;處理3 h和6 h時少部分細(xì)胞脫壁變圓,細(xì)胞膜光滑度減小;處理12 h后,細(xì)胞膜表面粗糙,出現(xiàn)腫脹細(xì)胞,細(xì)胞增殖受到抑制;處理24 h后,細(xì)胞不能貼壁生長,細(xì)胞膜破裂,出現(xiàn)凋亡小體;處理48 h后,細(xì)胞腫脹破裂,內(nèi)容物溢出,凋亡小體增多,大量細(xì)胞死亡。通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)48 h內(nèi),隨著藥劑處理時間的延長,細(xì)胞凋亡現(xiàn)象趨于明顯。由此可見,雙香豆素對SL-221細(xì)胞增殖抑制作用呈現(xiàn)時間依賴性。

圖3 雙香豆素誘導(dǎo)的斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞形態(tài)變化

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細(xì)胞周期的影響

經(jīng)1 μg/mL雙香豆素處理0、3、6、12、24、48 h的SL-221細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況見圖4。處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例的統(tǒng)計分析結(jié)果見圖5。處理48 h與0 h相比,G0/G1期的細(xì)胞比例由(46.37±2.61)%下降至(19.77±1.56)%,S期的細(xì)胞比例由(28.60±1.71)%下降至(20.90±5.87)%,而G2/M期的細(xì)胞比例由(24.73±2.11)%增加至(59.67±4.94)%。由此可見,雙香豆素可誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。

圖4 雙香豆素處理不同時間斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞細(xì)胞周期的分布情況

圖5 雙香豆素誘導(dǎo)的斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯分析

2.4 JC-1熒光標(biāo)記法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細(xì)胞線粒體膜電位的影響

利用線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)和流式細(xì)胞儀檢測雙香豆素處理不同時間,SL-221細(xì)胞線粒體膜電位的變化情況(圖6)。線粒體膜電位較高時,JC-1在線粒體基質(zhì)中形成聚合物,呈紅色熒光;而當(dāng)線粒體膜電位較低時,JC-1為單體,呈綠色熒光,其變化情況統(tǒng)計結(jié)果見圖7。1 μg/mL雙香豆素處理3 h后細(xì)胞內(nèi)的紅/綠熒光比例與0 h相比顯著降低(P<0.05),并隨處理時間延長,線粒體膜電位持續(xù)降低。處理時間至48 h時,細(xì)胞內(nèi)的紅/綠熒光比例由0 h時的10.58降至0.04,下降了99.62%。由此表明,雙香豆素能夠明顯降低SL-221細(xì)胞的線粒體膜電位。

圖6 雙香豆素對斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖7 雙香豆素對斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞線粒體膜電位影響情況的統(tǒng)計分析

2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細(xì)胞凋亡的影響

1 μg/mL雙香豆素處理SL-221細(xì)胞0、3、6、12、24、48 h后,采用流式細(xì)胞儀檢測FITC,PI通道熒光強度,獲得處理不同時間下各類細(xì)胞的分布情況(圖8)。其中左上象限(Q1)表示壞死細(xì)胞、右上象限(Q2)表示晚期凋亡細(xì)胞、右下象限(Q3)表示早期凋亡細(xì)胞、左下象限(Q4)表示正常細(xì)胞。經(jīng)Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染統(tǒng)計各類細(xì)胞的比例(圖9),可以看出,雙香豆素處理48 h與0 h相比,正常細(xì)胞比例由(74.33±1.03)%降低至(25.90±6.61)%,早期凋亡細(xì)胞比例由(7.25±3.33)%增加到(23.37±4.34)%,晚期凋亡細(xì)胞比例由(14.49±5.06)%增加到(46.40±1.35)%。由此可見,雙香豆素可誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞凋亡率與處理時間呈正相關(guān)。

圖8 Annexin V-FITC/PI雙染檢測雙香豆素誘導(dǎo)的斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞凋亡

圖9 Annexin V-FITC/PI雙染檢測雙香豆素誘導(dǎo)斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞凋亡情況的統(tǒng)計分析

2.6 RT-qPCR法檢測雙香豆素對斜紋夜蛾SL-221細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)情況的影響

進一步通過RT-qPCR法檢測SL-221細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)情況。由結(jié)果(圖10)可知,1、2、4 μg/mL雙香豆素處理SL-221細(xì)胞3～48 h,SL-PI3K、SL-TOR和SL-Bcl-2基因表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢,且藥物處理濃度越高,下降越明顯。其中,處理48 h,SL-PI3K基因表達(dá)量分別較對照下調(diào)了86.42%、90.11%、93.36%;SL-TOR基因表達(dá)量分別較對照下調(diào)了98.08%、98.66%、98.81%;SL-Bcl-2基因表達(dá)量分別較對照下調(diào)了92.25%、97.69%、98.49%;SL-Atg8、SL-CytochromeC和SL-P53基因表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。其中,處理48 h,SL-Atg8基因表達(dá)量分別較對照上調(diào)12.31倍、13.21倍、14.83倍;SL-CytochromeC基因表達(dá)量分別較對照上調(diào)了11.08倍、23.81倍、26.57倍;SL-P53基因表達(dá)量分別較對照上調(diào)了21.59倍、33.36倍、91.18倍。

圖10 不同濃度雙香豆素誘導(dǎo)斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞6種基因表達(dá)變化情況

3 結(jié)論與討論

雙香豆素最早因其具有干擾維生素K代謝循環(huán)的作用,在臨床上被廣泛用作抗凝血劑。已有研究表明,雙香豆素在抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗結(jié)核和抗精神病等方面具有良好活性,但針對農(nóng)業(yè)害蟲方面的研究卻未見報道。本文以斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞為靶標(biāo),研究雙香豆素對細(xì)胞的毒力及相關(guān)作用機理,結(jié)果表明,雙香豆素對斜紋夜蛾卵巢細(xì)胞具有良好的增殖抑制活性,IC50為0.85 μg/mL,其活性是陽性對照印楝素(IC50為7.20 μg/mL)的8.47倍,且抑制活性具有濃度依賴趨勢,顯示出優(yōu)于印楝素的發(fā)展?jié)摿?進一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)雙香豆素不僅阻斷SL-221細(xì)胞周期,同時促使線粒體膜電位下降,誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期是控制細(xì)胞生長的主要調(diào)控機制,由于正常細(xì)胞不斷增殖,細(xì)胞總是處于G0/G1,S,G2/M連續(xù)的細(xì)胞周期中。在細(xì)胞周期的各階段,細(xì)胞分別進行著DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞分裂等重要的生理活動。其中G2/M期主要進行DNA復(fù)制,DNA復(fù)制完成后細(xì)胞分裂并啟動下一個細(xì)胞周期,經(jīng)雙香豆素處理的大多數(shù)細(xì)胞的周期停留在G2/M期,細(xì)胞無法進行正常有絲分裂,進而抑制了細(xì)胞的增殖。

PI3K在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用,PI3K可直接激活蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和TOR,導(dǎo)致其磷酸化,磷酸化后的Akt促使轉(zhuǎn)錄因子FOXO入核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,進而調(diào)控營養(yǎng)信號通路(PI3K/TOR)下游關(guān)鍵基因Atg8、P53及Bad等的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞自噬(autophagy)與細(xì)胞凋亡(apoptosis)[24]。本研究發(fā)現(xiàn),雙香豆素誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞的SL-PI3K、SL-TOR基因相對表達(dá)量顯著下調(diào),提示雙香豆素能夠抑制PI3K/TOR營養(yǎng)信號通路的信號傳導(dǎo),促進細(xì)胞自噬和凋亡的產(chǎn)生。細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡是兩種重要的細(xì)胞自我消化過程,在真核生物的進化過程中高度保守,又被稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD),是為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動死亡過程[25]。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)存在于線粒體內(nèi)、外膜之間,細(xì)胞外源性損傷和自身衰老均可引起MPTP開放。在環(huán)境脅迫下,當(dāng)MPTP不可逆地過度開放時,線粒體跨膜電位崩解,細(xì)胞色素C(Cyto C)等促凋亡活性蛋白釋放至胞漿內(nèi)促使細(xì)胞凋亡。在該過程中,線粒體膜電位下降是凋亡的早期表現(xiàn),一旦線粒體膜電位損耗,細(xì)胞就會進入不可逆的凋亡過程[26-28]。目前已發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白家族包括25種家族同源蛋白,其中抑制凋亡因子Bcl-2、Bcl-x和Bcl-w能阻止Cyto C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),而促凋亡因子Bad、Bid和Bax可促進Cyto C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[29]。本研究發(fā)現(xiàn),雙香豆素處理SL-221細(xì)胞48 h后,線粒體膜電位顯著下降,且凋亡相關(guān)基因SL-CytoC、SL-P53上調(diào),SL-Bcl-2下調(diào),表明雙香豆素可誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。

綜上,天然產(chǎn)物雙香豆素對SL-221細(xì)胞的抑制活性優(yōu)于印楝素,且原材料易獲取,深入研究發(fā)現(xiàn)雙香豆素可通過PI3K/TOR營養(yǎng)信號通路,誘導(dǎo)SL-221細(xì)胞自噬和凋亡,從而抑制細(xì)胞增殖,但其具體的調(diào)控機制及對蟲體的生物活性仍需深入探討。