多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展

劉源，張開惠，王瑩瑩，吳昊芬，崔艷，徐永俊，向怡涵，季艷偉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊陵，712100)

食品安全傳統(tǒng)檢測(cè)大多以色譜法、光譜法、質(zhì)譜法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法等儀器分析方法為主，它們雖然具有靈敏度高、特異性好，結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但也同時(shí)存在樣品處理繁瑣、檢測(cè)成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，難以滿足“快、準(zhǔn)、靈、廉、簡(jiǎn)”的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和市場(chǎng)監(jiān)督需求[1-4]。此外，由于當(dāng)今食品組分復(fù)雜、干擾雜質(zhì)繁多，故對(duì)食品中特定污染物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)成為分析領(lǐng)域的主要難點(diǎn)之一。

免疫層析檢測(cè)技術(shù)是一種基于免疫檢測(cè)與層析分離相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，具有檢測(cè)快速(10～20 min)、操作簡(jiǎn)易、成本低廉、攜帶便捷等特點(diǎn)，在基層大樣本篩查中可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)[5-6]。然而，傳統(tǒng)免疫層析檢測(cè)技術(shù)僅能對(duì)單一待檢物進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多種待檢物的同時(shí)檢測(cè)，故只能提供有限的樣本信息。隨著對(duì)快速檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)效率日益增長(zhǎng)的現(xiàn)實(shí)需求，多重免疫層析檢測(cè)法逐漸成為研究熱點(diǎn)[7-9]。相較于多次單一待檢物的檢測(cè)，單次多重檢測(cè)既能提高檢測(cè)效率，降低成本，又能節(jié)約被測(cè)樣品，對(duì)某些需要進(jìn)行多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的微量樣品具有很大的應(yīng)用價(jià)值，尤其適合在基層實(shí)驗(yàn)室推廣與應(yīng)用。此外，采用上述方法可以獲得被測(cè)樣品更豐富的信息，有助于提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

近年來(lái)，食品安全領(lǐng)域?qū)τ诙喾N物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)的需求越來(lái)越大，推進(jìn)了多重免疫層析檢測(cè)法的發(fā)展。本文首先對(duì)多重免疫層析檢測(cè)法中不同信號(hào)輸出探針的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，闡述了各類探針的增敏作用及其優(yōu)缺點(diǎn)。然后，系統(tǒng)綜述了多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用，最后對(duì)該技術(shù)在食品安全快速分析檢測(cè)中所面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展前景進(jìn)行研討，以期為食品安全多重快速檢測(cè)方法的建立提供理論支撐。

1 多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)

多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)因具有低成本、高效率、操作簡(jiǎn)單、讀取方便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、環(huán)境檢測(cè)、食品安全檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域中，原理如圖1所示。多重免疫層析檢測(cè)平臺(tái)由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC 膜)和吸水墊在有一定硬度的底板上拼接組合而成，并且在 NC 膜上固化有控制線(control line，C 線)和多條檢測(cè)線(test line， T 線)，其中 C 線顯色表示檢測(cè)有效，而 T 線顯色則指示陰性或陽(yáng)性，其檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)視覺(jué)直接識(shí)別或閱讀器進(jìn)行定性或半定量分析。

圖1 多重免疫層析平臺(tái)原理圖Fig.1 Schematic of the multiplex immunochromatography platform

2 不同標(biāo)記材料在多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用

多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)其核心是免疫探針，不同標(biāo)記材料所制備探針的信號(hào)表現(xiàn)方式及效果不同，而免疫探針信號(hào)的強(qiáng)度及其穩(wěn)定性是影響檢測(cè)靈敏度的最重要因素[6]。隨著材料科學(xué)的發(fā)展，納米材料因其獨(dú)特的尺寸效應(yīng)、高比表面積、量子效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等特性成為了研究熱點(diǎn)，且納米材料具有較高的光、電、磁敏感性以及較好的表面穩(wěn)定性，進(jìn)而相繼涌現(xiàn)出各式各樣的新型納米材料應(yīng)用于免疫層析檢測(cè)中。納米材料的引入為免疫層析檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高特異性、高效率、高速度奠定了較好的基礎(chǔ)。不同的標(biāo)記材料用于多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)中時(shí)，其信號(hào)檢測(cè)模式不同。目前，研究者們所聚焦的新型納米材料主要包括如以比色信號(hào)為讀取信號(hào)的金納米粒子、碳基納米材料等標(biāo)記材料，以熒光信號(hào)為讀取信號(hào)的量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換熒光納米材料等標(biāo)記材料以及以拉曼信號(hào)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)等為檢測(cè)信號(hào)的復(fù)合材料等。

2.1 比色型納米材料在多重免疫層析檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

比色信號(hào)檢測(cè)作為免疫層析檢測(cè)技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的信號(hào)讀取模式，在多重免疫層析檢測(cè)領(lǐng)域中也受到了大量關(guān)注，其檢測(cè)原理是通過(guò)特異性的免疫結(jié)合使各種顏色的納米探針在檢測(cè)線上產(chǎn)生可供讀取分析的顏色條帶，然后通過(guò)肉眼或者借助讀取儀即可對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性及半定量分析。目前常用的比色型納米標(biāo)記材料主要包括納米金、乳膠微球、碳納米材料等。

2.1.1 納米金

納米金(gold nanoparticle，AuNPs，又稱為膠體金，colloidal gold)是由氯金酸通過(guò)還原法制備而成的締合膠體，由基礎(chǔ)金核和兩層雙離子層構(gòu)成，外層離子層在靜電作用下形成懸浮穩(wěn)定的膠體分散狀態(tài)[10]。納米金因具有獨(dú)特的尺寸效應(yīng)、高比表面積、高生物相容性、高穩(wěn)定性且易于制備、易于功能化修飾、易于裸眼判讀等特點(diǎn)，成為目前免疫層析法中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記材料，具有不可替代的商業(yè)地位。WANG等[11]以傳統(tǒng)的球型納米金分別偶聯(lián)5種單克隆抗體作為探針，對(duì)牛奶中5種金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin A、B、C、D、E)進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限分別為2.5、2.5、2.5、1和5 ng/mL。XU等[12]基于傳統(tǒng)納米金建立了可同時(shí)檢測(cè)牛奶中己烯雌酚和雌二醇的免疫層析檢測(cè)法，其檢出限分別為25 和65 ng/g。傳統(tǒng)的小粒徑球型納米金發(fā)光強(qiáng)度較低，需要大量聚集其信號(hào)才能被檢測(cè)識(shí)別，往往導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度較低，無(wú)法滿足對(duì)樣品中目標(biāo)物的痕量檢測(cè)。

近年來(lái)，研究者們開始關(guān)注異型且粒徑相對(duì)較大的納米金顆粒，常見的有棒狀納米金、花狀納米金、錐形納米金等。相較于球形納米金，異型納米金常常具有更大的比表面積使其可承載更多的抗體分子等生物分子，同時(shí)由于具有更高的光學(xué)亮度和更好的膠體穩(wěn)定性，以其制備的標(biāo)記探針往往具有較高的檢測(cè)靈敏度。如JI等[13-14]使用花狀納米金作為標(biāo)記材料制備了超靈敏定量檢測(cè)黃曲霉毒素 B1的免疫層析試紙條，花狀納米金的采用使得該方法的抑制濃度比傳統(tǒng)基于球型納米金的免疫層析試紙條檢測(cè)法低10倍。HUANG等[15]采用多分支的花狀納米金作為探針構(gòu)建了能夠同時(shí)檢測(cè)伏馬菌素 B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)2種真菌毒素的免疫層析檢測(cè)法，其檢出限為5 ng/mL，較球型納米金提高了4倍。WU等[16]采用4種不同顏色的異形納米金作為標(biāo)記材料用于同時(shí)檢測(cè)玉米樣品中 FB1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA) 和黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)4種真菌毒素，其原理如圖2所示，其檢出限分別為3.27、0.70、0.10和0.06 ng/mL。

圖2 基于不同顏色納米金構(gòu)建同時(shí)檢測(cè)4種真菌毒素的免疫層析檢測(cè)法原理圖(a)；定性檢測(cè)結(jié)果圖(b、c)[16]Fig.2 Schematic diagram of an immunochromatography assay for simultaneous detection of four mycotoxins based on gold nanoparticles of different colors(a); Qualitative test results(b，c)[16]

2.1.2 乳膠微球

乳膠微球(latex microsphere，LMs)是通過(guò)高聚合材料合成的納米標(biāo)記材料，與膠體金相比，乳膠微球顏色豐富，能夠滿足多種檢測(cè)的要求。此外，乳膠微球大小均勻，比表面積大，為偶聯(lián)抗體提供了豐富的位點(diǎn)，具有良好的穩(wěn)定性與較高的靈敏度。CHEN等[17]以紅色、綠色和藍(lán)色表面為羧基的聚苯乙烯乳膠微球作為探針，構(gòu)建了一種與智能手機(jī)設(shè)備相結(jié)合的彩虹“紅綠燈”型免疫層析檢測(cè)法，可同時(shí)檢測(cè) AFB1、T-2 毒素和 ZEN 三種真菌毒素，原理如圖3所示，其在谷物中檢出限分別為0.04、0.40和1.21 μg/kg。

圖3 基于乳膠微球的多重免疫層析檢測(cè)法檢測(cè)3種真菌毒素原理圖[17]Fig.3 Schematic diagram of multiplex immunochromatography based on latex microspheres for the detection of three mycotoxins[17]

2.1.3 碳納米材料

碳納米顆粒(carbon nanoparticles，CNPs)具有制備簡(jiǎn)單、無(wú)毒性、不需要活化以及原材料成本低廉等顯著優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為繼膠體金后最重要的標(biāo)記材料之一，且與傳統(tǒng)金納米顆粒相比，碳納米顆粒還具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和環(huán)保性，在許多領(lǐng)域都顯示出了巨大的應(yīng)用潛力[18]。在檢測(cè)靈敏度方面，由于其黑色信號(hào)可與白色背景的層析膜形成強(qiáng)烈的對(duì)比，從而具有較高的視覺(jué)靈敏度，其裸眼可判讀最低檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于膠體金。ZHANG等[19]以無(wú)定形碳納米顆粒(amorphous carbon nanoparticles，ACNs)作為探針，建立了可同時(shí)檢測(cè) DON，T-2毒素和 ZEN 的免疫層析檢測(cè)方法，原理圖如圖4所示，其檢測(cè)限分別為20、13和1 μg/kg，與以膠體金和量子點(diǎn)作為探針的免疫層析檢測(cè)方法相比，其靈敏度提高了8倍和2倍。為了能夠?qū)εＤ虡悠分?2種β-內(nèi)酰胺類抗生素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，ZHANG等[20]采用無(wú)定形碳納米顆粒作為探針構(gòu)建了多重免疫層析檢測(cè)法，其對(duì)此類抗生素檢測(cè)的相應(yīng)阻斷值均低于歐盟設(shè)定的最大殘留量水平。

圖4 基于碳基納米材料的多重免疫層析檢測(cè)法檢測(cè)3種真菌毒素原理圖[19]Fig.4 Schematic diagram of multiplex immunochromatography assay based on carbon nanoparticles for the detection of three mycotoxins[19]

2.2 熒光型納米材料在多重免疫層析檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

比色信號(hào)在檢測(cè)過(guò)程中易受待測(cè)樣品環(huán)境本底顏色的干擾，從而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低、檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題，難以用于有色食品中有害物質(zhì)的檢測(cè)。為解決此類問(wèn)題，熒光信號(hào)逐漸成為研究熱點(diǎn)?；跓晒庑盘?hào)的多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)因其具有可視化、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品安全快速檢測(cè)的重要技術(shù)。近年來(lái)，用于開發(fā)多重免疫層析試紙條的熒光型標(biāo)記材料主要包括量子點(diǎn)、量子點(diǎn)微球、時(shí)間分辨熒光微球、上轉(zhuǎn)換熒光納米材料等。

2.2.1 量子點(diǎn)及量子點(diǎn)微球

量子點(diǎn)(quantum dots，QDs)是一類由 Ⅱ～Ⅵ 族或 Ⅲ～Ⅴ 族元素組成的半導(dǎo)體熒光無(wú)機(jī)晶體，直徑通常在1～10 nm。由于其具有熒光量子產(chǎn)率高、抗光漂白能力強(qiáng)、熒光壽命長(zhǎng)、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、顏色可調(diào)等優(yōu)良光學(xué)特性，在免疫層析檢測(cè)法中獲得了廣泛關(guān)注[21]。量子點(diǎn)的多色性常用于同一體系中多種食品污染物的同時(shí)檢測(cè)[22]。TARANOVA等[23]利用紅色、黃色和綠色3種不同顏色的 QDs 分別標(biāo)記3種單克隆抗體建立了基于3條檢測(cè)線的“交通信號(hào)燈”模式的免疫層析方法，用于檢測(cè)牛奶樣品中氧氟沙星、氯霉素和鏈霉素3種常見抗生素的殘留，最低檢測(cè)限分別為0.3、0.12和0.2 ng/mL，比采用相同抗體的酶聯(lián)免疫吸附劑檢測(cè)法靈敏度高80～200倍。ZHAO等[24]合成了具有超高熒光亮度的聚合物碳量子點(diǎn)作為信號(hào)探針，在最佳條件下，氯氰菊酯、3-苯氧苯甲酸的檢測(cè)限分別為0.35和0.04 ng/mL。量子點(diǎn)在多重免疫層析方法中展現(xiàn)了其優(yōu)越的性能，但 QDs 標(biāo)記抗體會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生氧自由基，對(duì)抗體活性有一定毒性；且 QDs 與抗體等蛋白結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致其熒光減弱或淬滅，使信號(hào)減弱或消失；由于量子點(diǎn)粒徑較小，與蛋白偶聯(lián)后分離步驟復(fù)雜，回收不便，這一系列缺陷限制了其廣泛應(yīng)用。

量子點(diǎn)微球是通過(guò)物理或化學(xué)方法將量子點(diǎn)與二氧化硅球、高聚合物球等微納米球體結(jié)合起來(lái)構(gòu)建的量子點(diǎn)熒光微球。相比于量子點(diǎn)，量子點(diǎn)微球具有如下優(yōu)勢(shì)：(1)單個(gè)量子點(diǎn)微球可包裹數(shù)百甚至上萬(wàn)的量子點(diǎn)，具有更高的熒光強(qiáng)度；(2)通過(guò)高聚物材料對(duì)量子點(diǎn)的包裹，減少外界對(duì)量子點(diǎn)的影響，提高了熒光的穩(wěn)定性；(3)量子點(diǎn)微球粒徑較大，進(jìn)行生物偶聯(lián)后，低轉(zhuǎn)速就能實(shí)現(xiàn)微球探針的分離純化。REN等[25]采用聚甲基丙烯酸甲酯包裹 QDs 制備量子點(diǎn)熒光微球，其熒光強(qiáng)度比 QDs 提高了約2 863倍，且熒光穩(wěn)定性也得到了顯著提升，以其作為探針建立 AFB1的免疫層析檢測(cè)方法，其半抑制率比以 QDs 作為探針的低39倍，比傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條低約100倍。DUAN等[26]以此方法通過(guò)調(diào)節(jié)2種量子點(diǎn)的比例合成黃色、橙色和紅色3種不同顏色的量子點(diǎn)微球，將其作為探針，構(gòu)建了多色熒光免疫層析試紙條同時(shí)檢測(cè)玉米中的 ZEN、OTA 和 FB1，其原理如圖5所示，其可視檢測(cè)靈敏度為 10、5和 20 ng/mL。

圖5 三色量子點(diǎn)微球合成示意圖(a);免疫層析檢測(cè)法原理圖(b)；有關(guān)檢測(cè)結(jié)果示意圖(c)[26]Fig.5 Schematic diagram of the three-color quantum dot microsphere synthesis(a); Schematic diagram of the three-color quantum dot microsphere spherical immunochromatography detection method(b); Schematic diagram of the relevant test results(c)[26]

為了改善量子點(diǎn)的功能特性以及克服其缺陷，科學(xué)家們開始將量子點(diǎn)與其他材料復(fù)合使用。如XIONG等[27]利用SiO2和量子點(diǎn)制備成新型納米復(fù)合材料(SiO2@QDs)作為先進(jìn)的信號(hào)探針，提出了一種多重?zé)晒鈾M向流動(dòng)免疫分析法，可同時(shí)檢測(cè)豬尿液和豬肉樣品中的雷克托巴胺和沙丁胺醇，其檢測(cè)限分別為0.007 和0.032 ng/mL，該新型復(fù)合材料的靈敏度優(yōu)于金納米顆粒和熒光微球，同時(shí)克服了量子點(diǎn)容易聚集和離心后收集困難的缺點(diǎn)。ZHENG等[28]將具有捕獲/檢測(cè)雙功能的磁性量子點(diǎn)納米珠復(fù)合材料作為探針，建立了可同時(shí)檢測(cè)食品中AFB1、OTA和FB1的多重免疫層析檢測(cè)法，由于探針具有富集能力可捕獲靶分子從而消除雜質(zhì)的干擾，且雙層量子點(diǎn)外殼可使信號(hào)得到進(jìn)一步放大，磁珠外的多層羧基化 QDs 不僅大大增加了 QDs 進(jìn)入納米結(jié)構(gòu)的數(shù)量，而且提高了探針在復(fù)雜環(huán)境中的分散性以及穩(wěn)定性，原理如圖6所示，其檢測(cè)限分別為0.42、11.48和4.21 pg/mL[28]。

圖6 雙功能磁性量子點(diǎn)的制備(a)；不同免疫探針的制備(b)；免疫磁富集靶真菌毒素(c)；基于磁性量子點(diǎn)復(fù)合納米材料的多重免疫層析檢測(cè)法檢測(cè)三種真菌毒素原理圖(d)[28]Fig. 6 Preparation of bifunctional magnetic quantum dots(a); Preparation of different immune probes(b); Immunogagnetic enrichment of target mycotoxins(c); Schematic diagram of three mycotoxins detected by multiplex immunochromatography assay based on magnetic quantum dot composite nanomaterials(d)[28]

2.2.2 時(shí)間分辨熒光微球

時(shí)間分辨熒光微球(time-resolved fluorescent microspheres，TRFMs)采用高分子聚合物如聚苯乙烯材料或螯合二氧化硅納米粒子包裹鑭系稀土離子(如銪Eu3+、鋱Tb3+、鏑Dy3+和釤Sm3+)而構(gòu)成。鑭系元素跟普通熒光物質(zhì)相比，具有 Stocks 位移大，熒光壽命長(zhǎng)，寬激發(fā)窄發(fā)射等特點(diǎn)，因此可較好地避免激發(fā)光的干擾，同時(shí)解決生物材料自發(fā)熒光及熒光染料易淬滅等問(wèn)題，并進(jìn)一步提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。

TANG等[29]以Eu/Tb 時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記納米抗體作為探針，建立可同時(shí)檢測(cè)玉米樣品中 AFB1和 ZEN 兩種真菌毒素的免疫層析檢測(cè)法，其檢出限分別為0.05和0.07 ng/mL。在相同濃度下，Eu/Tb 熒光微球比不含 Tb 的熒光微球的熒光強(qiáng)度更高，說(shuō)明以此制備的信號(hào)探針能有效提高檢測(cè)靈敏度。盧迪莎等[30]采用銪系時(shí)間分辨熒光微球分別標(biāo)記AFB1和OTA的單克隆抗體作為探針，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)AFB1和OTA的免疫層析試紙條。在最佳條件下，其檢測(cè)限分別為 3.70 和5.55 μg/kg。JIANG等[31]基于時(shí)間熒光分辨微球建立動(dòng)物性食品中鏈霉素(streptomycin，STR)和雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin，DHSTR)免疫層析檢測(cè)法，在牛奶中的檢測(cè)限分別為3.62和2.48 μg/kg。

2.2.3 上轉(zhuǎn)換熒光納米材料

上轉(zhuǎn)換熒光納米材料(upconversion nanoparticles，UCNPs)是由稀土金屬元素(Er、Yb、Sm 等稀土離子)摻雜在某些惰性材料中構(gòu)成可上轉(zhuǎn)換發(fā)光的熒光納米材料。由于其長(zhǎng)波激發(fā)和短波發(fā)射的特性，具有良好的組織穿透性，可避免生物樣本中的背景熒光對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，從而顯著提高檢測(cè)信號(hào)的信噪比，故適合復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量分析物的檢測(cè)。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料和量子點(diǎn)相比，UCNPs 獨(dú)特的反斯托克斯位移發(fā)光信號(hào)可用于區(qū)分食物、環(huán)境、生物組織等復(fù)雜基質(zhì)的自發(fā)熒光，從而降低背景干擾和提高檢測(cè)靈敏度[32]。此外，UCNPs 顯示出更窄的發(fā)射光譜，因此可根據(jù)吸收和發(fā)射光譜進(jìn)行自由組合，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)[33]。XU等[34]開發(fā)了一種基于銪納米顆粒(europium nanoparticles，EuNPs)的雙熒光免疫層析法，用于同時(shí)檢測(cè)玉米樣品中的橘霉素和ZEN，其檢測(cè)限分別為0.06和0.11 ng/mL。雖然通過(guò)摻雜各種稀土元素或過(guò)渡金屬離子，可以制備具有不同顏色的 UCNPs，從而設(shè)計(jì)具有多檢測(cè)線的多重免疫層析檢測(cè)方法。然而，摻入稀土元素的 UCNPs 發(fā)光光譜寬度最多只能控制在30 nm以內(nèi)，因此只能合成4、5種顏色的 UCNPs[35]。另外，由于 UCNPs 發(fā)光效率偏低、制備復(fù)雜且需對(duì)表面進(jìn)行親水性修飾等劣勢(shì)限制了該材料的應(yīng)用。

2.2.4 有機(jī)染料熒光微球

有機(jī)染料熒光微球指采用聚苯乙烯等將具有熒光特性的有機(jī)染料包裹在內(nèi)而形成的熒光微球。ZHANG等[36]選擇商品化的紅、綠雙色熒光微球與單克隆抗體偶聯(lián)作為熒光探針，對(duì)魚肉樣品中的微囊藻毒素(microcystin-LR，MC-LR)和岡田酸(okadaic acid，OA)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，原理如圖7所示，其檢出限分別為0.074和2.42 μg/kg。LI等[37]使用熒光微球取代傳統(tǒng)納米金，對(duì)牛奶樣品中多肽抗生素黏菌素(colistin，COL)和桿菌肽(bacitracin，Baci)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，其檢測(cè)限分別為1.89和7.85 ng/mL。

圖7 熒光探針合成示意圖(a)；免疫層析試紙條示意圖(b)；基于有機(jī)染料熒光微球構(gòu)建可同時(shí)檢測(cè)食品中微囊藻毒素和岡田酸的免疫層析檢測(cè)法原理圖(c)[36]Fig.7 Schematic diagram of fluorescent probe synthesis(a); Schematic diagram of the immunochromatography test strip(b); Schematic diagram of an immunochromatographic assay for simultaneous detection of microcystin and okadic acid in food based on organic dye fluorescent microspheres(c)[36]

2.3 其他信號(hào)納米材料在多重免疫層析檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

除了常見的比色信號(hào)、熒光信號(hào)外，表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)(surface enhanced Raman scattering，SERS)因其極高的靈敏度在多重免疫層析檢測(cè)中掀起了研究浪潮?；赟ERS的檢測(cè)方法不但可以達(dá)到單分子水平適合用于食品中對(duì)痕量物質(zhì)的檢測(cè)還非常適用于多重檢測(cè)。ZHANG等[38]設(shè)計(jì)合成了帶雙拉曼標(biāo)簽的Au@Ag芯殼納米顆粒用于制備探針，建立了基于多重表面增強(qiáng)拉曼散射的橫向流動(dòng)免疫傳感器，同時(shí)檢測(cè)玉米中的6種主要霉菌毒素，該方法可在20 min內(nèi)完成，且該免疫傳感器的LOD值低于儀器分析和大多數(shù)其他生物傳感器。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度的多重免疫層析檢測(cè)，研究者們也開始考慮在簡(jiǎn)單納米材料的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾和組合，以期使標(biāo)記材料同時(shí)具有多重功能或多重信號(hào)的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，穩(wěn)定性，同時(shí)還能在一定程度上簡(jiǎn)化檢測(cè)操作。這些復(fù)合納米材料一般集合了2種或2種以上材料的優(yōu)勢(shì)功能，且具備2種及2種以上類型的信號(hào)，使得檢測(cè)效果得以提升或檢測(cè)步驟得以優(yōu)化。CHAI等[39]設(shè)計(jì)出一種基于金納米顆粒和辣根過(guò)氧化物酶相結(jié)合的復(fù)合納米材料作為探針標(biāo)記物，開發(fā)了能夠識(shí)別雙重信號(hào)的側(cè)流免疫檢測(cè)平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)樣本中多種抗生素和霉菌毒素的同時(shí)定量檢測(cè)?；谠摲椒ǖ牧蛎顾睾?FB1的檢出限分別比以前所報(bào)道過(guò)的方法低8和40倍。LIU 等建立了一種磁性普魯斯藍(lán)納米酶介導(dǎo)的雙信號(hào)讀出多重側(cè)流免疫分析法，該方法采用納米酶作為信號(hào)標(biāo)簽，將其原始顏色產(chǎn)生的視覺(jué)比色信號(hào)與納米酶優(yōu)異的過(guò)氧化物酶模擬催化活性產(chǎn)生的催化信號(hào)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)雙讀出策略，得到了更高的精度和更寬的檢測(cè)范圍。該檢測(cè)方法具有2種定量分析模式，可滿足不同的檢測(cè)要求，在實(shí)際樣品中具有良好的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性和實(shí)用性[40]。該團(tuán)隊(duì)還制備了一種可再生生物資源衍生的高親和力鐵基納米酶，并將其作為多重橫向流動(dòng)免疫分析中的多功能高親和信號(hào)標(biāo)簽，對(duì)模擬樣本(豬、豬肝)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，樣品中的鹽酸萊克多巴胺和克侖特羅(獸藥殘留)的檢測(cè)線性范圍分別為0～12和0～20 μg/kg，與其他方法相比擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，有利于滿足現(xiàn)場(chǎng)雙半定量判斷[41]。

3 多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)在食品安全快速檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 在真菌毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用

真菌毒素(mycotoxins)是絲狀真菌在適宜條件下產(chǎn)生的一類具有較強(qiáng)毒性的小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，其污染范圍較大，且種類繁多。其中最為常見的真菌毒素有黃曲霉毒素(aflatoxins，AFs)、赭曲霉毒素(ochratoxins，OTs)、ZEN、FB1、DON 和T-2、桔霉素(citrinin，CIT)等。在當(dāng)今實(shí)際生產(chǎn)中，由于加工途徑繁多，同一農(nóng)產(chǎn)品往往同時(shí)被多種真菌毒素污染，不但威脅到人類健康，且還會(huì)使產(chǎn)品失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立快速高效的真菌毒素多重檢測(cè)技術(shù)迫在眉睫。近年來(lái)，有關(guān)真菌毒素多重免疫層析法檢測(cè)的研究進(jìn)展如表1所示。

表1 基于免疫層析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素研究進(jìn)展Table 1 Research progress on simultaneous detection of multiple fungal toxins based on immunochromatographyassay

3.2 在食源性致病菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用

食源性致病菌是引發(fā)食源性疾病的重要因素，常見于各種食品環(huán)境與飲用水源中，此類污染已成為食品安全領(lǐng)域的重要問(wèn)題之一。常見的引起人和動(dòng)物發(fā)病的食源性致病菌有大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157:H7)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidi)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)等細(xì)菌。在實(shí)際生活中，一種食物存在同時(shí)被多種食源性致病菌污染的可能，所以同時(shí)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食品是否被多種致病菌污染對(duì)保障消費(fèi)者權(quán)益是十分重要的。關(guān)于食品中的食源性致病菌的多重免疫層析檢測(cè)部分研究進(jìn)展如表2所示。

表2 同時(shí)檢測(cè)多種食源性致病菌研究進(jìn)展Table 2 Research progress in simultaneous detection of multiple foodorne pathogens

3.3 在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)方面的應(yīng)用

面對(duì)食物中多種農(nóng)獸藥殘留帶來(lái)的檢測(cè)挑戰(zhàn)，開發(fā)出靈敏、便捷和廉價(jià)的多重檢測(cè)方法是輔助監(jiān)管農(nóng)獸藥使用及保障人民食品安全的關(guān)鍵。近年來(lái)關(guān)于農(nóng)獸藥殘留的多重免疫層析檢測(cè)法的研究進(jìn)展如表3所示。

表3 基于免疫層析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)多種農(nóng)獸藥殘留研究進(jìn)展Table 3 Research progress on simultaneous detection of various agricultural and veterinary drug residues based on immunochromatography

4 結(jié)論與展望

本文綜述了多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)不同標(biāo)記探針的特性以及多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)在快速檢測(cè)食品樣品多重污染中的應(yīng)用，與傳統(tǒng)食品安全檢測(cè)技術(shù)相比，多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)具有“更快、更準(zhǔn)、更靈、更廉、更簡(jiǎn)”的優(yōu)勢(shì)，且多重免疫層析檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)多種目標(biāo)分析物的同時(shí)檢測(cè)，獲取的樣本信息更為全面。盡管該多重檢測(cè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室研究取得了較快的進(jìn)展，但在實(shí)際食品安全快速分析檢測(cè)應(yīng)用中仍存在挑戰(zhàn)：復(fù)雜的食品基質(zhì)造成的干擾問(wèn)題、檢測(cè)探針合成的復(fù)雜性及探針?lè)€(wěn)定性問(wèn)題、多種目標(biāo)物間存在的交叉反應(yīng)導(dǎo)致的準(zhǔn)確性問(wèn)題等。對(duì)于探針標(biāo)記物而言，復(fù)合納米材料因其具有多結(jié)構(gòu)，多功能，多信號(hào)的優(yōu)勢(shì)必將會(huì)成為未來(lái)的研究熱點(diǎn)，是提高檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)性能的關(guān)鍵，但如何簡(jiǎn)化復(fù)合納米材料的制備方法及如何解決材料批次間合成質(zhì)量差異大的問(wèn)題也是非常重要的。其次，檢測(cè)中部分類別信號(hào)需要采用專業(yè)儀器進(jìn)行讀取處理，且由于讀取儀器價(jià)格昂貴使檢測(cè)成本大大增加，而基于智能手機(jī)的便捷檢測(cè)讀取平臺(tái)由于其攜帶方便、成本低廉、可聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及數(shù)據(jù)上傳，提高了檢測(cè)的效率及實(shí)效性，是未來(lái)多重快速檢測(cè)設(shè)備發(fā)展的趨勢(shì)，同時(shí)可開發(fā)智能化的檢測(cè)軟件配合使用，以簡(jiǎn)化操作，做到人人可檢測(cè)，人人會(huì)檢測(cè)，從而提升檢測(cè)速度和降低檢測(cè)成本。總而言之，未來(lái)的研究將朝著更快速、更準(zhǔn)確、更靈敏、更廉價(jià)、更高效、更智能、更自動(dòng)化、操作更簡(jiǎn)單的多重免疫層析檢測(cè)法發(fā)展，只有這樣才能解決食品安全的部分問(wèn)題，從而保證食品行業(yè)健康發(fā)展。