D-阿洛酮糖生物合成研究進(jìn)展

溫鑫，寧宇航，劉光文，Mesfin Angaw Tesfay，林建強(qiáng),2*，任一林，林慧彬，宋欣，林建群

1(微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(山東大學(xué))，山東 青島，266237)2(山東金宸生物科技有限公司，山東 濟(jì)南，250031)3(濟(jì)南稀有糖生物技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南，250000)4(青島龍鼎生物技術(shù)有限公司，山東 青島，266108)5(山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南，250014)

糖是一種重要食品原料，但存在高熱量、導(dǎo)致血糖升高、齲齒等不利因素。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人類(lèi)飲食更加追求營(yíng)養(yǎng)和健康。國(guó)際稀有糖協(xié)會(huì)(International Society of Rare Sugars，ISRS)定義稀有糖為自然界中存在但含量極少的一類(lèi)單糖及其衍生物[1]。某些稀有糖不僅具有純正的甜味，而且具有低熱量、低吸收等特點(diǎn)，同時(shí)具有多種生理功能，在膳食、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用潛力，吸引著越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的廣泛關(guān)注。

D-阿洛酮糖是D-果糖的C3位差向異構(gòu)體，是一種低能量甜味劑，它的甜度為蔗糖的70%，但熱量只有0.4 kcal/g，被認(rèn)為是潛在的蔗糖替代品[2]。D-阿洛酮糖，英文名為D-allulose或D-psicose，化學(xué)式為C6H12O6，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，摩爾質(zhì)量為180.16 g/mol，極易溶于水，密度為1.35 g/cm3，外觀為白色晶體，無(wú)特殊氣味，CAS號(hào)為551-68-8。在美國(guó)，D-阿洛酮糖已經(jīng)被食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認(rèn)可為GRAS的成分，可以應(yīng)用于食品中[3]。2020年，F(xiàn)DA發(fā)布行業(yè)指南，建議在食品標(biāo)簽上將D-阿洛酮糖排除在“總糖”、“添加糖”之外[4]。

圖1 D-阿洛酮糖結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of D-allulose

目前，國(guó)內(nèi)已有企業(yè)正積極申請(qǐng)D-阿洛酮糖進(jìn)入新資源食品目錄，預(yù)計(jì)2023年可以獲得國(guó)家相關(guān)部門(mén)批復(fù)。在全球范圍內(nèi)，D-阿洛酮糖生產(chǎn)企業(yè)仍不多，主要集中在日本、美國(guó)、歐洲、韓國(guó)。我國(guó)D-阿洛酮糖生產(chǎn)處于起步階段，生產(chǎn)規(guī)模較小，有待進(jìn)一步發(fā)展，增加D-阿洛酮糖產(chǎn)能。

本文介紹了D-阿洛酮糖的生理功能及應(yīng)用，綜述了D-阿洛酮糖生物合成過(guò)程中關(guān)于生物酶、生物轉(zhuǎn)化、分離純化和結(jié)晶等的研究進(jìn)展，針對(duì)當(dāng)前D-阿洛酮糖生產(chǎn)過(guò)程中存在的某些瓶頸問(wèn)題進(jìn)行了討論和分析，并提出可行的解決措施。

1 D-阿洛酮糖的生理功能及應(yīng)用

1.1 低熱量甜味劑，能夠發(fā)生美拉德反應(yīng)，可以改善食品的風(fēng)味和色澤

D-阿洛酮糖具有與蔗糖相近的口感和甜度，但所含熱量低。它能夠提高食品的凝膠度，改善食品的風(fēng)味，其可與食品中的蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，不僅能夠改善食品的色澤，還能提高食品的抗氧化性，延長(zhǎng)食品的貨架期[2，4]。

1.2 降血糖，抑制脂肪堆積，可用于研制治療肥胖和糖尿病的藥物

D-阿洛酮糖能夠抑制腸道α-糖苷酶的活性，從而降低小腸對(duì)糖的吸收，抑制脂肪堆積，提高胰島素的敏感性，降低血糖，在研制治療肥胖和糖尿病藥物方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[5-7]。

1.3 促進(jìn)谷胱甘肽的增量調(diào)節(jié)，具有神經(jīng)保護(hù)功能

TAKATA等[8]研究發(fā)現(xiàn)，D-阿洛酮糖通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽上調(diào)而在神經(jīng)退行性疾病的治療中發(fā)揮潛在的神經(jīng)保護(hù)作用。

1.4 抑制寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)，是一種潛在的驅(qū)蟲(chóng)劑

SATO等[9]研究發(fā)現(xiàn)，D-阿洛酮糖可能是通過(guò)干擾秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)的消化、吸收或代謝，從而對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)和生殖成熟產(chǎn)生抑制作用，成為一種潛在的驅(qū)蟲(chóng)劑。

1.5 生產(chǎn)其他稀有糖醇的前體

根據(jù)Izumoring策略[10]，以D-阿洛酮糖為底物經(jīng)異構(gòu)酶催化可以得到D-阿洛糖，經(jīng)氧化還原酶催化可以得到阿洛醇。D-阿洛糖和阿洛醇都是具有重要生理功能的稀有糖醇。

2 D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化所涉及的生物酶

2.1 酮糖 3-差向異構(gòu)酶

目前，D-阿洛酮糖的生物合成主要是通過(guò)酮糖 3-差向異構(gòu)酶催化D-果糖得到。酮糖 3-差向異構(gòu)酶主要包括2種：D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶(D-tagatose 3-epimerase，DTE)和D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)。酮糖 3-差向異構(gòu)酶具有高度保守的活性中心和具有相似特征的關(guān)鍵氨基酸殘基，大多數(shù)DTE或DPE的最適反應(yīng)溫度區(qū)間為40～70 ℃，最適反應(yīng)pH為7.5～9.0[11]。酶催化作用取決于每個(gè)亞基的分子排列，這些亞基暴露其活性位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)有效的酶催化反應(yīng)。相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示DPE對(duì)D-阿洛酮糖具有較高的底物親和力和催化效率。金屬離子在D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，不同來(lái)源的DTE或DPE對(duì)金屬離子的依賴(lài)性不同。

1993年，IZUMORI等[12]首次發(fā)現(xiàn)來(lái)自于PseudomonascichoriiST-24的D-酮糖 3-差向異構(gòu)酶可以催化D-塔格糖和D-山梨糖、D-阿洛酮糖和D-果糖、D-木酮糖和D-核酮糖以及L-木酮糖和L-核酮糖之間的相互轉(zhuǎn)化，特別是對(duì)D-塔格糖呈現(xiàn)出強(qiáng)特異性，因此將該酶命名為D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶。2006年，KIM等[13]首次發(fā)現(xiàn)來(lái)自于Agrobacteriumtumefaciens的DPE對(duì)D-阿洛酮糖具有較高的Kcat和Kcat/Km，30 ℃反應(yīng)，D-果糖和D-阿洛酮糖的平衡比為32∶68；50 ℃反應(yīng)100 min，可以得到230 g/LD-阿洛酮糖(底物為700 g/LD-果糖)，D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為32.9%。

近些年，已發(fā)現(xiàn)多種來(lái)自不同菌株的DTE和DPE，例如來(lái)自于Pseudomonascichorii[14]和Rhodobactersphaeroides[15]等的DTE；來(lái)自于Clostridiumsp.[1-19]，Desmosporasp.8437[20],Doreasp.CAG317[21],Treponemaprimitia[22],Flavonifractorplautii[23]，Arthrobacterglobiformis[24],Ruminococcussp.5_1_39BFAA[25],Halanaerobiumcongolense[26],Thermoclostridiumcaenicola[27]和Novibacillusthermophilus[28]等的DPE。不同微生物來(lái)源的DTE和DPE的酶學(xué)性質(zhì)列于表1。

表1 不同微生物來(lái)源的DTE和DPE酶學(xué)性質(zhì)Table 1 Enzymatic properties of DTE and DPE from different microbial sources

續(xù)表1

如表1所示，來(lái)自于Rhodobactersphaeroides的DTE最適反應(yīng)溫度較低，為40 ℃，而其他來(lái)源酶的最適溫度分布在50～70 ℃；來(lái)自于Doreasp.CAG317的DPE最適pH偏酸性，為6.0；來(lái)自于Rhodobactersphaeroides的DTE最適pH最高，為9.0，其他DPE和DTE最適pH為7.0～8.0；大多數(shù)DTE和DPE在Co2+或Mn2+存在下表現(xiàn)出最高酶活性，除了Arthrobacterglobiformis和Halanaerobiumcongolense來(lái)源的DPE在Mg2+存在時(shí)具有最高酶活力；另外，來(lái)自于Doreasp.CAG317的DPE對(duì)D-阿洛酮糖具有很強(qiáng)的特異性。

2.2 NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶

WEN等[29]首次報(bào)道了來(lái)自于GluconobacterfrateuriiNBRC 3264 的 NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶[NAD(P)-dependent alcohol dehydrogenase，ADH]可催化阿洛醇生成D-阿洛酮糖。ADH的最適溫度為50 ℃，pH為7.0～10.0 ADH的相對(duì)酶活性皆高于80%，具有較寬的pH域，Co2+能顯著提高酶的催化活性。NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶(NCBI_ID：WP_099183078.1)由345個(gè)氨基酸組成，屬于中鏈脫氫酶/還原酶，經(jīng)SDS-PAGE分析得到酶分子質(zhì)量約為36.5 kDa，是可溶性的酶。

3 D-阿洛酮糖的生物合成

D-阿洛酮糖的生物合成路徑主要有3條(圖2)：(1)經(jīng)DTE或DPE催化D-果糖得到D-阿洛酮糖；(2)經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，GI)催化D-葡萄糖為D-果糖，D-果糖再經(jīng)路徑(1)得到D-阿洛酮糖；(3)經(jīng)氧化還原酶催化阿洛醇得到D-阿洛酮糖。

GI-葡萄糖異構(gòu)酶；DTE-D-塔格糖 3-差向異構(gòu)酶；DPE-D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶；ADH，NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶；Nox-NADH氧化酶圖2 D-阿洛酮糖的生物合成Fig.2 Biosynthesis of D-allulose

3.1 利用微生物來(lái)源的DPE催化轉(zhuǎn)化D-果糖為D-阿洛酮糖

目前，生物合成D-阿洛酮糖主要是由DPE催化D-果糖得到。DPE的異源表達(dá)系統(tǒng)常用的是大腸桿菌，因?yàn)槠溥z傳背景清晰、培養(yǎng)簡(jiǎn)單且生長(zhǎng)迅速。此外，食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)，例如酵母菌、枯草芽孢桿菌等，在企業(yè)生產(chǎn)中格外受歡迎。

PARK等[30]構(gòu)建了異源表達(dá)來(lái)自于Agrobacteriumtumefaciens的DPE大腸桿菌(Escherichiacoli)工程菌株，該菌株催化D-果糖為D-阿洛酮糖的最適溫度和pH分別為60 ℃和8.5，以700 g/LD-果糖為底物，反應(yīng)40 min可以得到230 g/LD-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為33%。PARK等[23]構(gòu)建了異源表達(dá)來(lái)自于Flavonifractorplautii的DPE谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)工程菌株，該菌株催化D-果糖為D-阿洛酮糖的最適溫度和pH分別為65 ℃和7.0，以750 g/LD-果糖為底物，反應(yīng)40 min可以得到235 g/LD-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為31%。

LI等[25]構(gòu)建了異源表達(dá)來(lái)自于菌Ruminococcussp.5_1_39BFAA的DPE短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)工程菌株，該工程菌株具有較高的DPE表達(dá)量，游離DPE經(jīng)離子交換樹(shù)脂固定，所得固定化DPE的最適溫度為60 ℃，最適pH為9.0，當(dāng)以500 g/LD-果糖為底物時(shí)，經(jīng)固定化DPE催化4 h可得126.95 g/LD-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率為25%。YANG等[31]報(bào)道了1株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)工程菌株，該菌株能夠表達(dá)來(lái)自于Agrobacteriumtumefaciens的DPE，利用該工程菌株作為生物催化劑，以750 g/LD-果糖為底物，55 ℃反應(yīng)12 h得到190 g/LD-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率達(dá)到25.3%。

ZHU等[26]構(gòu)建了異源表達(dá)來(lái)自于Halanaerobiumcongolense的DPE枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)工程菌株，以750 g/LD-果糖為底物，60 ℃靜息細(xì)胞反應(yīng)得到240 g/LD-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率達(dá)到32%。同時(shí)，ZHU等[26]通過(guò)理性設(shè)計(jì)獲得具有組合突變體Y7H/C66L/I108A/R156C/K260C的DPE，溫度為70 ℃時(shí)該突變酶的半衰期增加了5.2 h，Tm值增加了6.5 ℃。通過(guò)對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，亞單元間引入了二硫化物橋梁，增加了界面交互，提高了DPE的熱穩(wěn)定性。利用異源表達(dá)具有組合突變體DPE的枯草芽孢桿菌工程菌株作為生物催化劑，同樣地，以750 g/LD-果糖為底物，60 ℃反應(yīng)可得到262.5 g/LD-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率高于32%，達(dá)到35%。

不同工程菌株催化D-果糖為D-阿洛酮糖的情況見(jiàn)表2，工程菌株催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖所得轉(zhuǎn)化率介于25%～33%，當(dāng)表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和枯草芽孢桿菌時(shí)，D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率高于30%。相比酶催化方法，利用全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)稀有糖頗受歡迎，因?yàn)樗梢员苊饷傅奶崛?、分離純化及固定化，既可以省去繁瑣的操作步驟，也能夠降低生產(chǎn)成本。另外，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行深入研究，提高酶的底物特異性和熱穩(wěn)定性，對(duì)于實(shí)現(xiàn)稀有糖的高效綠色生產(chǎn)十分重要。

表2 催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖Table 2 Production of D-allulose by catalyzing D-fructose

3.2 利用微生物來(lái)源的GI和DPE催化轉(zhuǎn)化D-葡萄糖為D-阿洛酮糖

MEN等[32]構(gòu)建了1株大腸桿菌工程菌株，能夠共表達(dá)來(lái)自于芽孢桿菌的GI酶和來(lái)自于Ruminococcussp.5_1_39BFAA的DPE，在65 ℃和pH 7.0的條件下進(jìn)行靜息細(xì)胞反應(yīng)8 h，所得D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的平衡比為3.0∶2.7∶1.0，D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為15%。

ZHANG等[33]在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)來(lái)自于Acidothermuscellulolyticus11B的GI和來(lái)自于Doreasp.CAG317的DPE，在65 ℃和pH 6.5的條件下進(jìn)行靜息細(xì)胞反應(yīng)8 h，所得D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的平衡比為2.3∶2.3∶1.0，D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為17.8%。

ZHAO等[34]在枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)來(lái)自于菌Bacillussp.的GI和來(lái)自于菌Doreasp.CAG317的DPE，在75 ℃和pH 6.5的條件下進(jìn)行靜息細(xì)胞反應(yīng)3 h，所得D-葡萄糖、D-果糖、D-阿洛酮糖的平衡比為2.8∶2.9∶0.9，D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為13.6%。

不同工程菌株催化D-葡萄糖為D-阿洛酮糖的情況見(jiàn)表3，當(dāng)以D-葡萄糖為底物時(shí)，D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率低于20%，一方面原因是受熱力學(xué)平衡的限制，另一方面多酶促反應(yīng)不同的酶最適反應(yīng)條件不同，很難充分發(fā)揮每一種酶的最高催化活性。因此，D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)還需在生物催化劑性能提高方面做出更多努力。

表3 催化D-葡萄糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖Table 3 Production of D-allulose by catalyzing D-glucose

3.3 利用微生物來(lái)源的ADH催化轉(zhuǎn)化阿洛醇為D-阿洛酮糖

GULLAPALLI 等[35]利用EnterobacteraerogenesIK7靜息細(xì)胞為生物催化劑，以30 g/L的阿洛醇為底物，在37 ℃、pH 11.0條件下反應(yīng)24 h，最終所得D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為89.3%。POONPERM 等[36]利用BacilluspallidusY25 靜息細(xì)胞為生物催化劑，以10 g/L的阿洛醇為底物，在55 ℃、pH 7.0條件下反應(yīng)16 h，最終所得D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為98%。

WEN等[29]在大腸桿菌中異源表達(dá)來(lái)自于GluconobacterfrateuriiNBRC 3264 的 NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶，對(duì)該酶進(jìn)行了純化分析，并研究了其酶學(xué)性質(zhì)，以0.05 mol/L阿洛醇為底物，在50 ℃、pH 7.0和添加0.001 mol/L Co2+的條件下反應(yīng)4 h，最終所得D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為97%。另外，筆者利用異源表達(dá)來(lái)自于GluconobacterfrateuriiNBRC 3264 的 NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶的重組大腸桿菌作為生物催化劑，以10 g/L 和100 g/L阿洛醇為底物，在50 ℃、pH 10.0、細(xì)胞用量OD600為80的條件下反應(yīng)最終所得D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率分別為80.9%和48%。同時(shí)，筆者利用制備型色譜柱對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行分離，得到阿洛酮糖溶液，通過(guò)高效液相色譜法分析、比旋光度測(cè)定和質(zhì)譜分析證實(shí)由阿洛醇生產(chǎn)所得阿洛酮糖的構(gòu)型為D型，且分子質(zhì)量與已知D-阿洛酮糖分子質(zhì)量一致。由表4可以看出，相比異構(gòu)酶催化D-葡萄糖或D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖，以阿洛醇為底物生產(chǎn)D-阿洛酮糖具有更高的轉(zhuǎn)化率。

表4 催化阿洛醇生產(chǎn)D-阿洛酮糖Table 4 Production of D-allulose by catalyzing allitol

3.4 D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化方法分析

利用DTE或DPE催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖因受熱力學(xué)平衡的限制，會(huì)導(dǎo)致D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率較低(約為30%)。并且，由于D-阿洛酮糖與其異構(gòu)體D-果糖性質(zhì)極為相似，導(dǎo)致分離純化困難，成為限制D-阿洛酮糖大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。為了克服熱力學(xué)平衡的限制，有研究人員在反應(yīng)體系中添加硼酸，與糖形成配合物，由于硼酸對(duì)D-阿洛酮糖的結(jié)合親和力遠(yuǎn)高于D-果糖，從而使反應(yīng)平衡向生成D-阿洛酮糖的方向轉(zhuǎn)變，可以大大提高D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率[37]。但是硼酸具有毒性且用量大，并且硼酸去除困難，因此難以實(shí)際應(yīng)用。另外，將生物催化過(guò)程與產(chǎn)物分離相結(jié)合，也可以克服熱力學(xué)平衡限制[38-40]。但是，該方法操作復(fù)雜且繁瑣，實(shí)際應(yīng)用比較困難。

雖然利用氧化還原酶催化阿洛醇生產(chǎn)D-阿洛酮糖可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率，但是這種方法也具有一定的局限性。一方面，底物阿洛醇也是一種稀有糖醇。根據(jù)稀有糖制備策略，經(jīng)合適的氧化還原酶催化可以實(shí)現(xiàn)阿洛醇和D-阿洛酮糖的相互轉(zhuǎn)化。利用異構(gòu)酶催化D-葡萄糖或D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率較低，需要經(jīng)分離純化后得到D-阿洛酮糖，由此帶來(lái)的分離純化成本較高；利用DPE、核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶可以實(shí)現(xiàn)由D-果糖生產(chǎn)阿洛醇，阿洛醇轉(zhuǎn)化率高，可以通過(guò)結(jié)晶的方式直接得到阿洛醇，不需要額外的分離純化，得到的阿洛醇再經(jīng)NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶催化可得D-阿洛酮糖，較高的轉(zhuǎn)化率有望通過(guò)結(jié)晶的方式直接獲得D-阿洛酮糖，此過(guò)程雖然繁瑣，但是可以省去高昂的D-阿洛酮糖分離純化步驟，當(dāng)然也會(huì)增加生物催化劑培養(yǎng)成本和生物轉(zhuǎn)化成本。雖然阿洛醇可以由廉價(jià)的底物D-葡萄糖或D-果糖催化生產(chǎn)得到，而且生產(chǎn)工藝相對(duì)成熟，但是目前國(guó)內(nèi)外還未實(shí)現(xiàn)阿洛醇的工業(yè)化生產(chǎn)，導(dǎo)致底物來(lái)源受限。

另一方面，利用氧化還原酶催化阿洛醇生產(chǎn)D-阿洛酮糖過(guò)程中輔酶 NAD+的再生是其限速步驟。隨著底物濃度的提高，輔酶供給不足，會(huì)限制D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。因?yàn)檩o酶NAD+價(jià)格昂貴，在反應(yīng)體系中額外添加輔酶NAD+是不現(xiàn)實(shí)的。因此，解決氧化還原酶催化阿洛醇生產(chǎn)D-阿洛酮糖過(guò)程中輔酶再生的問(wèn)題是難點(diǎn)和重點(diǎn)，也是決定該途徑實(shí)用性的關(guān)鍵因素。稀有糖生物合成過(guò)程中常用的輔酶再生方法是酶偶聯(lián)法。例如，將木糖醇脫氫酶與產(chǎn)水型 NADH 氧化酶偶聯(lián)，應(yīng)用于L-木酮糖的生產(chǎn)[41]，其中產(chǎn)水型 NADH 氧化酶能夠氧化 NADH 為 NAD+，為氧化還原反應(yīng)提供輔酶NAD+[42]。因此，尋找一種能夠與NAD(P)-依賴(lài)型醇脫氫酶偶聯(lián)的，可用于再生NAD+的高效NADH氧化酶是催化阿洛醇生產(chǎn)D-阿洛酮糖的重要前提。

4 D-阿洛酮糖的分離和純化

在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，D-阿洛酮糖的分離和純化相對(duì)較為困難。待分離糖液中主要包括酶或細(xì)胞催化劑、金屬鹽離子、色素和至少2種性質(zhì)極為相似的單糖。其中，酶及細(xì)胞催化劑可以通過(guò)超濾或離心等方式較容易地去除；金屬鹽離子可以通過(guò)陰陽(yáng)離心交換色譜去除；活性炭可以有效除去色素。然而，糖的分離是最困難的。特別地，生物合成D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為30%左右，最終糖液中D-果糖的濃度高于D-阿洛酮糖的濃度，而D-果糖和D-阿洛酮糖的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相似，很難分離，導(dǎo)致D-阿洛酮糖分離成本高，限制了D-阿洛酮糖的應(yīng)用。目前，糖分離的方法主要有利用模擬移動(dòng)床(simulated moving bed,SMB)技術(shù)分離和利用生物轉(zhuǎn)化法分離。

4.1 SMB技術(shù)

SMB技術(shù)是一種基于色譜分離原理而建立的連續(xù)分離色譜技術(shù)。近些年，因其具有低能耗、高溶劑利用率、高生產(chǎn)率和高分離純度等優(yōu)點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注。

WAGNER等[43]提出了一種SMB工藝的多目標(biāo)優(yōu)化方法，采用逆方法確定模型參數(shù)，并在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的SMB裝置上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，運(yùn)行溫度70 ℃，D-阿洛酮糖的產(chǎn)能為2.6 kg/(L·d)，1 kg消耗27 L解吸劑，所得D-阿洛酮糖的純度為97.6%。LI等[25]利用含有8根填充了鈣離子樹(shù)脂的色譜柱和5個(gè)壓力泵組成的SMB設(shè)備分離D-阿洛酮糖，確定了SMB運(yùn)行參數(shù)，最終得到D-阿洛酮糖的純度為98.5%(圖3)[25]。

1-D-果糖；2-D-阿洛酮糖a-模擬移動(dòng)床示意圖；b-模擬移動(dòng)床設(shè)備圖；c-D-阿洛酮糖高效液相色譜分析圖圖3 模擬移動(dòng)床分離純化D-阿洛酮糖的優(yōu)化工藝Fig.3 Optimization of separation and purification of D-allulose by SMB

為了保證分離效果和延長(zhǎng)樹(shù)脂使用壽命，需要對(duì)待分離糖液進(jìn)行預(yù)處理，包括去除雜質(zhì)和金屬離子。雖然SMB技術(shù)具有環(huán)境友好、無(wú)副產(chǎn)物生成等優(yōu)點(diǎn)，但是SMB設(shè)備價(jià)格高昂、運(yùn)行參數(shù)獲取困難，限制了其在工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用。

4.2 生物轉(zhuǎn)化法

生物轉(zhuǎn)化法分離D-阿洛酮糖是指利用生物催化劑將剩余底物D-果糖轉(zhuǎn)化為其它易于從糖液中分離的化合物。例如，LI等[40]利用固定化葡萄糖異構(gòu)酶和氧化還原酶催化底物D-果糖為葡萄糖酸，然后利用陰離子交換樹(shù)脂去除葡萄糖酸，最終D-阿洛酮糖純度達(dá)到91.2%。SONG等[44]對(duì)十字花科蔬菜殘?jiān)M(jìn)行生物加工，經(jīng)過(guò)水解、異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化和酵母菌發(fā)酵得到生物乙醇和D-阿洛酮糖，并通過(guò)滲透蒸發(fā)和陽(yáng)離子交換色譜分離純化得到生物乙醇和D-阿洛酮糖，其中D-阿洛酮糖的回收率約為86.2%(圖4)。

圖4 發(fā)酵法分離D-阿洛酮糖和D-葡萄糖[44]Fig.4 Separation of D-allulose and D-glucose by fermentation method[44]

YANG等[31]利用馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵未反應(yīng)的D-果糖為乙醇，同樣地乙醇經(jīng)滲透揮發(fā)除去，最終D-阿洛酮糖的純度高于90%(圖5)[31]。

圖5 馬克斯克魯維酵母菌循環(huán)催化示意圖[31]Fig.5 Schematic diagram of cyclic catalysis of K.marxianus[31]

雖然生物轉(zhuǎn)化法分離D-阿洛酮糖具有催化劑易得、操作方法簡(jiǎn)單、節(jié)省人力物力等優(yōu)點(diǎn)，但是該方法降低了底物(D-果糖等)的利用率。另外，酵母菌發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生代謝廢物也存在雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，并且產(chǎn)生的乙醇經(jīng)濃縮后成為易燃品，具有一定危險(xiǎn)性。總之，生物轉(zhuǎn)化純化方法在工業(yè)中未得到廣泛應(yīng)用。

5 D-阿洛酮糖的結(jié)晶

5.1 蒸發(fā)濃縮冷卻結(jié)晶法

結(jié)晶是D-阿洛酮糖生產(chǎn)的最后一步。由于D-阿洛酮糖在高溫下會(huì)變色并且溶解度高，因此常用的D-阿洛酮糖結(jié)晶方法主要是低溫真空蒸發(fā)濃縮和冷卻結(jié)晶法，即利用低溫真空蒸發(fā)將D-阿洛酮糖溶液濃縮到一定的糖度，然后降溫冷卻進(jìn)行結(jié)晶。這種方法對(duì)D-阿洛酮糖溶液的純度具有很高要求，如果D-阿洛酮糖的純度低、雜質(zhì)較多則會(huì)影響D-阿洛酮糖的結(jié)晶。LI等[25]將SMB分離得到的糖液在60 ℃下真空蒸發(fā)濃縮到糖度為75%，加入0.3% 400目的D-阿洛酮糖晶種，72 h內(nèi)降溫到1 ℃，離心收集并50 ℃烘干得到D-阿洛酮糖晶體，經(jīng)分析得到D-阿洛酮糖純度為99.1%，D-阿洛酮糖的結(jié)晶率為82%。KIM等[45]在30～40 ℃時(shí)向D-阿洛酮糖濃縮液中加入D-阿洛酮糖晶種，最終結(jié)晶得到D-阿洛酮糖的純度為98%。

5.2 有機(jī)溶劑冷卻結(jié)晶法

因?yàn)镈-阿洛酮糖在水中具有較高的溶解度，加之D-阿洛酮糖溶液濃縮后糖液黏度非常大，導(dǎo)致結(jié)晶困難。此時(shí)，可以考慮添加有機(jī)溶劑降低液體黏度，同時(shí)也可以降低糖的溶解度。常用的有機(jī)溶劑為無(wú)毒的無(wú)水乙醇。雖然D-阿洛酮糖可溶于無(wú)水乙醇，但是溶解度遠(yuǎn)低于在水中的溶解度，加入無(wú)水乙醇后不僅可以降低糖液黏度，還可以降低溶解度，有利于D-阿洛酮糖的結(jié)晶。佟毅等[46]發(fā)明了1種從乙醇溶液中結(jié)晶D-阿洛酮糖的方法，通過(guò)D-阿洛酮糖在乙醇溶液中降溫結(jié)晶，一次結(jié)晶率達(dá)到50%以上，結(jié)晶晶型均一，易于固液分離，后期干燥簡(jiǎn)單易行。

雖然添加乙醇可以改善結(jié)晶性能，但由于乙醇是易燃品，存在安全隱患，并且使用過(guò)程中需要進(jìn)行回收而且具有一定的損耗，增加成本，因此很多情況下盡量避免使用乙醇。這也進(jìn)一步對(duì)D-阿洛酮糖的結(jié)晶工藝提出了更高的要求。

6 總結(jié)與展望

D-阿洛酮糖作為一種理想的蔗糖替代品，具有廣闊的市場(chǎng)前景，對(duì)于提高人民健康水平、幸福指數(shù)和滿(mǎn)足日益升級(jí)的消費(fèi)市場(chǎng)需求具有重要意義。為了提高D-阿洛酮糖的生產(chǎn)效率，建議從以下幾個(gè)方面進(jìn)行重點(diǎn)研究：

(1)提高酶的催化活性和穩(wěn)定性，降低最適pH。一直以來(lái)，提高酶的催化活性和穩(wěn)定性是生物合成領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。催化活性高、耐熱性好、半衰期長(zhǎng)的酶是獲得高產(chǎn)能和降低酶使用成本的必要條件。另外，大多數(shù)報(bào)道的DPE或DTE最適pH為堿性，容易發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致糖液顏色加深，產(chǎn)生副產(chǎn)物，對(duì)后期產(chǎn)品分離純化不利。通過(guò)酶分子理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化的方式改造DPE或DTE以及篩選和挖掘新的具有應(yīng)用潛力的酶是未來(lái)D-阿洛酮糖生物合成的重要任務(wù)。

(2)構(gòu)建食品級(jí)宿主工程菌株，滿(mǎn)足食品安全要求。大腸桿菌作為常用的表達(dá)系統(tǒng)因產(chǎn)生內(nèi)毒素而不利于食品級(jí)D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。雖然有酵母菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒狀桿菌等食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的工程菌株生產(chǎn)D-阿洛酮糖的報(bào)道，但是這些表達(dá)系統(tǒng)具有穩(wěn)定性差、重復(fù)率低等缺點(diǎn)。因此，構(gòu)建具有高穩(wěn)定性、耐受高底物濃度、具有高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強(qiáng)度、高安全性的工程菌株是實(shí)現(xiàn)食品級(jí)D-阿洛酮糖生產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。

(3)構(gòu)建簡(jiǎn)單、高效、低成本的D-阿洛酮糖工業(yè)化生產(chǎn)工藝。開(kāi)發(fā)創(chuàng)新型工藝路線，提高轉(zhuǎn)化效率，解決D-阿洛酮糖分離純化問(wèn)題，降低分離純化工藝難度和成本，構(gòu)建適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的簡(jiǎn)單、高效、創(chuàng)新性生產(chǎn)工藝路線。

(4)開(kāi)發(fā)利用D-阿洛酮糖保健功能和生物醫(yī)藥應(yīng)用潛能。D-阿洛酮糖的醫(yī)藥價(jià)值巨大，它既能抗齲齒、降血糖、抗氧化，又具有防止脂肪堆積、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用和清除活性氧自由基等生理功能，可用于制備特醫(yī)食品、保健品和合成藥物。進(jìn)一步開(kāi)發(fā)D-阿洛酮糖的醫(yī)藥潛能，將會(huì)為糖尿病、肥胖癥以及動(dòng)脈粥樣硬化等病患帶去福音，改善他們的生活水平和質(zhì)量。