穩(wěn)定同位素內(nèi)標的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳制品中唾液酸的含量

何姝，曹晶

(上海師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海，200234)

唾液酸(sialic acid, SA)是指一類含9個碳原子的羧基化單糖?；苌?圖1)。由于在大部分哺乳動物組織中N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)是SA的主要存在形式，因此通常將SA稱為Neu5Ac[1-3]。研究表明SA具有抗炎、抗病毒、抗菌和抗腫瘤等生物學(xué)作用[4]，也有研究表明SA是一種腦部營養(yǎng)素，能促進嬰幼兒大腦發(fā)育、增強學(xué)習(xí)和發(fā)育能力[5]。母乳是嬰兒營養(yǎng)的主要來源，其中含量豐富的SA和幼兒早期的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、抵抗力密切相關(guān)。目前，多以牛乳和羊乳為基礎(chǔ)的嬰幼兒奶粉來作為母乳的替代品，然而有研究表明牛乳和羊乳中含有的SA遠遠不如母乳[6-7]，所以國內(nèi)外市場已將奶粉中SA的含量作為接近母乳的一個重要參數(shù)，通過在奶粉或者牛奶中添加SA，使其更接近母乳SA含量，有利于促進嬰兒早期的認知發(fā)育。因此，定量奶制品尤其是嬰幼兒奶粉中SA的含量可以為乳制品的生產(chǎn)質(zhì)量把控和質(zhì)量鑒定提供技術(shù)支持。

圖1 唾液酸的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of sialic acid*表示主要形式

目前，測定SA含量的方法主要有分光光度法[8-11]、高效液相色譜法[12-14]、氣相色譜法[15]、核磁法[16]、酶聯(lián)免疫分析[17]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18-20]及其他方法[21]。其中分光光度法、色譜法和核磁法的靈敏度不高、定量準確性不高。酶聯(lián)免疫法靈敏度高，但其成本較高，操作方法較為復(fù)雜，線性范圍較窄。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)因質(zhì)譜靈敏度較高，且具有分離鑒定同時進行的優(yōu)點，無需衍生就可以對復(fù)雜樣品中的SA進行定性定量。目前，已有研究者采用LC-MS/MS法測定乳制品中SA的含量[18-20]，但這些研究均采用外標定量法，其定量準確性受基質(zhì)效應(yīng)限制。穩(wěn)定同位素內(nèi)標定量法因同位素標記的化合物在理化性質(zhì)上與待測化合物有很大的相似性，可以有效地消除基質(zhì)干擾效應(yīng)。目前該方法作為LC-MS/MS定量的金標準方法被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境、食品、臨床、檢測等分析領(lǐng)域。然而，采用基于穩(wěn)定同位素內(nèi)標的LC-MS/MS法定量乳制品中的SA的研究尚未報道。因此，在本研究中使用穩(wěn)定同位素標記的化合物13C123-SA作為同位素內(nèi)標，開發(fā)了一種基于穩(wěn)定同位素內(nèi)標的LC-MS/MS法，用于準確定量乳制品中的SA的含量。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Ultivo高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，MassHunterC1.1數(shù)據(jù)處理軟件，美國Agilent公司；電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器；超聲波水浴，寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫混勻儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；移液槍、漩渦振蕩器、臺式離心機，美國Thermo公司；Millipore超純水凈化器，美國MILLIPORE公司。

1.2 樣品與試劑

嬰幼兒奶粉、奶酪、酸奶、鮮牛奶、脫脂高鈣奶粉、全脂高鈣奶粉，市售；乙酸銨(LC-MS級，99%)，北京百靈威科技有限公司；乙酸(LC-MS級，99.5%)，東京化成工業(yè)株氏會社；甲酸(LC-MS級)、乙腈(LC-MS級，99%)，賽默飛公司；唾液酸標準品(99%)，Adamas-beta公司；[1,2,3-13C3]-N-乙?；?D-神經(jīng)氨酸,上海甄準生物科技有限公司；試驗用水均為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取SA標準品14 mg，用超純水溶液配制成1 mg/mL的標準儲備液，于-20 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

將5 mg的SA同位素標準品用超純水溶液配制成1 mg/mL的內(nèi)標標準儲備液，于-20 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

混合內(nèi)標標準工作液的制備：準確移取一定量的標準儲備液和內(nèi)標標準儲備液用體積分數(shù)0.05%甲酸水溶液逐級稀釋成質(zhì)量濃度5、2.5、0.5、0.25、0.05、0.025、0.012 5 μg/mL的唾液酸標準工作液，其中內(nèi)標濃度均為0.25 μg/mL，于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

取供試品樣品，精密稱取20 mg(精確至0.000 1 g)于離心管中，加入1 mL體積分數(shù)50%的乙酸(pH 2)溶液，混勻振蕩，水浴超聲5 min，使其充分溶解。在恒溫混勻儀中80 ℃反應(yīng)2 h，水解后冷卻至室溫，15 000 r/min下離心10 min(×2)。離心后取上清液稀釋1 000倍，其中加入同位素內(nèi)標工作液使其濃度和標準工作液內(nèi)標一致為0.25 μg/mL。接著用10 kDa的超濾管14 000×g離心10 min，過0.22 μm的有機濾膜，上機待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫40 ℃；流速為0.3 mL/min，進樣量1 μL；以含體積分數(shù)0.05%甲酸水溶液為流動相A，以含體積分數(shù)0.05%甲酸的乙腈為流動相B，按照體積比進行梯度洗脫:0.0～1.0 min，3% B；1.0～2.5 min，3%～80% B；2.5～4.0 min，80% B；4.0～8.0 min，80%～90% B；8.0～10.0 min，90%～3% B。

1.3.4 MS條件

電噴霧模式(electronic spray ionization, ESI)：負離子模式(ESI-)；質(zhì)譜掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)；毛細管電壓3 000 V，噴嘴電壓500 V；鞘氣流量11.0 L/min；鞘氣溫度325 ℃；霧化器壓力30 psi；干燥器溫度250 ℃；干燥器流量7 L/min；MRM參數(shù)見表1。

表1 唾液酸及其內(nèi)標在MRM模式下的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Main mass spectrum parameters of sialic acid and its internal standard in MRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

由于唾液酸1號碳上的羧基使得唾液酸分子帶負電荷，推測ESI-較ESI+模式更利于SA檢測，因此本研究嘗試了用ESI-和ESI+2種模式對0.5 μg/mL的唾液酸標準液和內(nèi)標標準液進行母離子全掃描，結(jié)果表明較ESI+模式，ESI-模式下母離子豐度更高，且背景干擾峰較少，因此本實驗選擇ESI-模式檢測。在ESI-模式下，對所選定的母離子進行子離子掃描，最終選擇含量較高的子離子m/z87和子離子m/z90為定量離子，子離子m/z170和子離子m/z173為定性離子，最后在ESI-模式下優(yōu)化電壓，碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)，最大程度地提高了檢測的靈敏度。優(yōu)化后的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1，唾液酸標準液和內(nèi)標標準液的子離子質(zhì)譜圖見圖2。

a-SA;b-iSA圖2 SA和iSA的子離子掃描圖Fig.2 Product ion scan diagrams of SA figure and iSA figure

在使用LC-MS/MS法檢測樣品中唾液酸時，唾液酸的響應(yīng)會受到樣品基質(zhì)的影響，導(dǎo)致響應(yīng)信號被抑制，因此使用外標法定量不準確?；诖耍x擇了[1,2,3-13C3]-N-乙?；?D-神經(jīng)氨酸作為內(nèi)標，在預(yù)處理之前加入待測樣品中，由于[1,2,3-13C3]-N-乙酰基-D-神經(jīng)氨酸具有與SA相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，并且它們具有相同的穩(wěn)定性、色譜保留、質(zhì)譜響應(yīng)和斷裂模式，因此它們的特異性和靈敏檢測可以通過質(zhì)譜在MRM模式下基于它們的m/z值的差異來獲得(圖3)，因此可以校正由基質(zhì)響應(yīng)所帶來的干擾，實現(xiàn)了高靈敏度和精確定量。結(jié)果表明，選用穩(wěn)定同位素內(nèi)標既降低了基質(zhì)效應(yīng)又能校正樣品前處理過程的誤差。

a-SA的色譜圖；b-iSA的質(zhì)譜圖圖3 SA和iSA的MRM色譜圖和質(zhì)譜圖Fig.3 MRM chromatograms and mass spectra of SA figure and iSA figure

2.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

通常選擇C18色譜柱分離樣品，鑒于唾液酸的高親水性，本研究比較了Poroshell 120 HILIC Column (150 mm×2.1 mm,2.7 μm)和Eclipse Plus C18 Column (50 mm×2.1 mm,1.8 μm)這2種色譜柱。結(jié)果表明選用HILIC色譜柱分離效果欠佳，峰形有明顯拖尾。而C18色譜柱分離效果較好，峰形較好，無嚴重的拖尾現(xiàn)象。故本實驗最終選擇C18色譜柱來進行分離(圖4)。

a-HILIC；b-C18圖4 HILIC (150 mm) column、C18 (150 mm) column的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of HILIC (150 mm) column figure and C18 (150 mm) column figure

2.2.2 流動相條件的優(yōu)化

由于唾液酸的極性較大，通常使用乙腈和水作流動相，在流動相中有無添加劑也會影響峰的強度和峰形，因此研究了在水中加入乙酸銨和甲酸對峰的影響。使用C18色譜柱在負離子模式下對5 mmol/L的乙酸銨水溶液/乙腈、體積分數(shù)0.05%甲酸的水溶液/0.05%甲酸的乙腈溶液2種流動相進行篩選，并篩選最優(yōu)梯度洗脫。結(jié)果表明流動相含有甲酸時，SA響應(yīng)較好，峰形較好(圖5-b)。為縮短檢測時間以更好地滿足快速檢測的要求，最終選擇了50 mm的同類型C18色譜柱用于后續(xù)樣品的測定(圖5-c)，最優(yōu)洗脫梯度為0.0～1.0 min，3%B；1.0～2.5 min，3%～80%B；2.5～4.0 min，80%B；4.0～8.0 min，80%～90%B。

a-5 mmol/L乙酸銨水溶液；b-0.05%甲酸水溶液(150 mm)；c-0.05%甲酸水溶液(50 mm)圖5 5 mmol/L乙酸銨水溶液、0.05%甲酸水溶液(150 mm)和0.05%甲酸水溶液(50 mm)的流動相的優(yōu)化Fig.5 Optimization of mobile phase of 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution figure and 0.05% formic acid aqueous solution figure

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

乳制品中除了游離的SA，更多的是與蛋白質(zhì)結(jié)合的SA，乳制品成分復(fù)雜，含有大量乳糖、半乳糖、低聚糖等碳水化合物復(fù)雜基質(zhì)，這使得奶粉中唾液酸的檢測極具挑戰(zhàn)性[23]，故需要對樣品進行水解以釋放唾液酸。唾液酸的水解有2種：酶水解、酸水解。由于酶水解需要溫和的條件，水解不完全。本研究采用酸水解法，目前已報道硫酸、磷酸、三氟乙酸、鹽酸等酸解條件[3,22-23]，但硫酸、磷酸等無機酸與質(zhì)譜不兼容?？紤]到與質(zhì)譜的兼容性，本研究考察了乙酸和甲酸，結(jié)果表明相較甲酸，乙酸的水解效果更好，能較好地將唾液酸游離出來，故本研究選擇50%的乙酸(pH 2)作為水解酸。

由于奶粉樣品中含有許多蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子，這就需要對所得到的唾液酸粗品進行預(yù)分離純化。樣品經(jīng)0.22 μm的有機濾膜過濾后，選擇用超濾法(10 kDa超濾膜)進行分離純化，以除去樣品中雜質(zhì)和大分子。用超濾法預(yù)分離純化樣品，不僅操作簡單，唾液酸的損失較小。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標準曲線、檢出限與定量限

SA標準品系列濃度為0.0125、0.025、0.05、0.25、0.5、2.5、5 μg/mL，同位素內(nèi)標質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL。以SA標準品的濃度(X)為橫坐標，對應(yīng)的SA標準品與同位素內(nèi)標峰面積的比值(Y)為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示在0.0125～5 μg/mL線性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 9。以信噪比S/N(signal to noise ratio)≥10計算方法的定量下限為1.6 ng/mL,S/N≥3計算方法的檢出限為0.4 ng/mL。該方法的靈敏度足以滿足乳制品中SA的檢測要求。

2.4.2 加標回收率與相對標準偏差

精密稱取已知唾液酸含量的樣品20 mg，按照先前建立的方法處理后進行測定。依次在原含量樣品的基礎(chǔ)上分別添加0.025、0.25、2.5 μg/mL的唾液酸標準品溶液，在優(yōu)化實驗條件下，每個加標水平平行進樣6次，計算加標回收率，結(jié)果如表2。該方法的平均回收率(n=6)為76%～96%。相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)分別為0.6%～6.35%，有較高的回收率。

表2 乳制品中唾液酸的加標回收實驗Table 2 Labeled recovery experiment of sialic acid in the dairy products

2.4.3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性

取200 μL含有內(nèi)標的唾液酸標準液(質(zhì)量濃度0.5 μg/mL)，重復(fù)進樣6次，RSD為2.71%，精密度良好。同一樣品和標品檢測數(shù)據(jù)的日間和夜間平行性很好(RSD≤4.30%)，表明唾液酸標準品在24 h內(nèi)穩(wěn)定(表3)。

表3 唾液酸標準品穩(wěn)定性Table 3 Stability of sialic acid standard

2.5 樣品測定

應(yīng)用本實驗所建立的方法對超市中售賣的嬰幼兒奶粉、高鈣奶粉及其他奶制品進行SA定量檢測，測定結(jié)果如表4所示。

表4 樣品中SA的含量Table 4 Content of SA in the samples

3 結(jié)論

本文建立了基于穩(wěn)定同位素內(nèi)標高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量乳制品中SA含量的方法，該方法重現(xiàn)性和精密度良好，試劑用量少，操作簡單，無需衍生，避免了復(fù)雜的樣品前處理過程。并且由于穩(wěn)定同位素內(nèi)標的引入極大地降低了復(fù)雜樣品中基質(zhì)的干擾，因此，該方法可準確地測定嬰幼兒配方奶粉及其他奶制品中SA的含量，為乳制品的生產(chǎn)質(zhì)量把控和質(zhì)量鑒定提供有力和有效的手段。