中國毛蝦二肽基肽酶-IV抑制肽的分離純化與結構鑒定

孫潔，李燕，鄭昌亮，汪之和

(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，因其發(fā)病率高、危害性大，現(xiàn)已成為繼惡性腫瘤、心血管疾病之后的世界第三大慢性疾病，是21世紀患病人數(shù)增長最多的疾病之一。其中II型糖尿病患病人數(shù)占患病總人數(shù)的90%～95%[1]，患者體內出現(xiàn)胰島素拮抗作用或胰島素分泌異常而導致血糖持續(xù)增加[2]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)和葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)是2種腸促胰島素激素，二者在抑制胰高血糖素產生的同時刺激胰島β細胞的增值和分化，促進胰島素的分泌[3]，對維持血糖穩(wěn)態(tài)有著十分重要的作用。二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)是一種在生物體內普遍存在的脯氨酰寡肽酶，可參與人體多種生理功能，主要能夠快速代謝GLP-1和GIP，從而升高血糖，所以人們發(fā)現(xiàn)可以通過抑制DPP-IV的酶活性來達到降血糖的作用。目前，西格列丁(Sitagliptin)等人工合成的DPP-IV抑制劑在治療糖尿病的過程中會產生諸多輕微不良反應，從天然蛋白質中提取得到的食源性DPP-IV抑制肽無毒副作用和選擇性降血糖作用等突出優(yōu)勢，因而備受關注。

中國毛蝦(Aceteschinensis)又稱為蝦米、海米等，是我國沿海地區(qū)特有的一種蝦類品種，廣泛分布于中國渤海、黃海以及東南沿岸的淺海近海水域。毛蝦形體偏小、甲殼較薄，不易貯存，主要經晾曬、發(fā)酵、蒸煮等簡單加工制作成蝦皮、蝦醬等低值加工食品，部分毛蝦因在捕撈后易腐而被丟棄，造成水產資源浪費，同時也對水體環(huán)境產生一定污染。然而，中國毛蝦富含蛋白質和礦物元素，其蛋白質中疏水性氨基酸含量較高[4]，具有制備生物活性肽的良好基礎。王海濤等[5]以中國毛蝦為原料，通過精準酶解和分離純化制備出了具有抑制流感病毒神經氨酸酶的高活性多肽。付雪艷等[6]對中國毛蝦經堿性蛋白酶和中性蛋白酶水解所得多肽的降血壓作用進行初探，結合體外血管緊張素轉化酶抑制活性測定和大鼠體內試驗表明中國毛蝦酶解多肽具有顯著的降血壓作用。這些結果表明基于中國毛蝦的生物活性肽可以作為一種潛在的功能性配料應用于食品藥品行業(yè)。

本研究以中國毛蝦為原料，通過使用動物蛋白酶水解和膜分離、色譜分離等純化制備DPP-IV抑制肽，并對活性多肽的氨基酸組成和結構進行鑒定，通過探究其對DPP-IV的抑制作用機理，為中國毛蝦的高值化利用和功能性食品開發(fā)等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：中國毛蝦，浙江省舟山國際水產城；10 kDa超濾膜(MSC 80010)、3 kDa(MSC 80001)超濾膜，上海摩速科學器材有限公司；制備型C18柱(XBridge Prep，19 mm×250 mm，5 μm)，沃特世科技(上海)有限公司。

試劑：動物蛋白水解酶(20 U/mg，食品級)，南寧東恒華道生物科技有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-15、DPP-IV抑制劑篩查檢測試劑盒、乙腈、三氟乙酸、甲酸(HPLC級)，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

MSC 300超濾杯，上海摩速科學器材有限公司；HDB-7 L核酸蛋白檢測儀、CBA-A程控多功能全自動部分收集器，上海滬西分析儀器有限公司；CHRIST ALPHA1-2真空冷凍干燥機，德國Marin Christ公司；WATERS E2695高效液相色譜儀，沃特世科技有限公司；P 270制備型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；FLEXSTATION 3多功能讀板機，美國Molecular Devices公司；RE-52AA真空旋轉蒸發(fā)儀，上海予華儀器有限公司；ULTIMATE 3000毛細管高效液相色譜儀、Q EXACTIVE四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；ZORBAX300SB C18peptide traps，安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 中國毛蝦酶解液的制備

中國毛蝦4 ℃自然解凍后使用破碎機打成蝦糜，與pH 7.5的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液以1∶10.5(g∶mL)比例混合，首先在90 ℃水浴中加熱15 min除去內源酶，冷卻后加入動物蛋白酶5 100 U/g(原料)，55 ℃水解5.1 h。酶解結束后經90 ℃水浴滅酶15 min，冷卻至室溫后在4 ℃、10 000 r/min離心20 min。經4層紗布過濾取上清液，即為中國毛蝦酶解液(Aceteschinensishydrolysates，ACH)，儲存于4 ℃冰箱。

1.3.2 ACH的超濾分離

將ACH導入超濾杯中，在冰浴下分別通過10和3 kDa的超濾膜，在最大工作壓力0.2 MPa的條件下，經超濾得到3個不同分子質量范圍的組分。收集各超濾組分冷凍干燥后測定DPP-IV抑制活性。

1.3.3 葡聚糖凝膠色譜分離

使用超純水將多肽凍干粉復溶為30 mg/mL的溶液，經0.22 μm水相膜過濾后上樣至經過平衡的Sephadex G-15凝膠柱(80 cm×1.6 cm)。樣品上樣量1 mL，以去離子水為流動相，0.5 mL/min流速洗脫分離，使用核酸蛋白檢測儀測定洗脫液在檢測波長為254 nm處的吸光值。收集各洗脫組分冷凍干燥備用，測定各洗脫組分的DPP-IV抑制活性。

1.3.4 反相高效液相色譜(reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)分離

使用RP-HPLC將經Sephadex G-15凝膠色譜柱分離得到的體外DPP-IV抑制活性最高的組分進行進一步分離純化。液相分離條件如下：流動相A為含0.1%(體積分數(shù)，下同)三氟乙酸的水溶液，流動相B為含0.1%三氟乙酸的乙腈。梯度洗脫設置為：0～5 min為20%乙腈；5～15 min為45%乙腈；15～20 min為20%乙腈。樣品質量濃度40 mg/mL，進樣量2 mL，流動相流速4 mL/min，檢測波長214 nm。按照出峰時間和分離程度收集各峰洗脫液，經真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥，測定各洗脫組分DPP-IV抑制率。

1.3.5 質譜鑒定

參考LANG等[7]的方法，使用液相色譜-質譜聯(lián)用儀(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)鑒定DPP-IV抑制肽的氨基酸序列。樣品經高效液相色譜分離后使用四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯(lián)用儀進行分析。電噴霧離子源采用正離子模式，使用全掃描(Full MS)和數(shù)據依賴二級掃描(dd-MS2)，分析時間60 min，母離子掃描范圍300～1 800m/z。其中一級質譜分辨率為7 000；靜電軌道阱離子捕獲器門限值(AGC target)為1×106；一級最大注入捕獲時間為10 ms。二級質譜分辨率為17 500，二級最大注入捕獲時間為60 ms；歸一化碰撞能量27 eV；底部填充率0.1%。

1.3.6 DPP-IV抑制率的測定

采用熒光底物法測定DPP-IV抑制率。利用DPP-IV催化底物生成帶有熒光基團的7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin，AMC)或7-氨基-4-三氟甲基香豆素，測定樣品在激發(fā)波長360 nm和發(fā)射波長460 nm處的熒光強度，以此計算樣品對DPP-IV的抑制程度。采用DPP-IV抑制劑篩查檢測試劑盒，具體操作如下：首先在96孔板中加入50 μL DPP-IV酶和10 μL樣品混勻，在37 ℃反應10 min后加入25 μL底物，再經37 ℃孵育15 min后檢測熒光強度記為F樣品。DPP-IV抑制率(WDPP-IV)的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：F對照，對照組的熒光強度；F樣品，樣品組的熒光強度；F空白，空白組的熒光強度。

1.3.7 DPP-IV抑制肽的合成及活性驗證

經LC-MS/MS鑒定和多肽結構特征篩選所得的5條DPP-IV抑制肽委托武漢丹港生物科技有限公司使用固相合成法進行合成，多肽純度均大于95%。

按照1.3.6的方法對合成肽DPP-IV抑制率進行測定，并計算合成多肽對DPP-IV的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration,IC50)。

1.3.8 DPP-IV抑制肽的抑制動力學實驗

參照陳宏[8]的方法使用酶抑制動力學方法探究DPP-IV抑制肽對DPP-IV的抑制作用類型。DPP-IV酶活力為10 U/L，使用緩沖液配制不同質量濃度(0、0.1、0.2 mg/mL)的DPP-IV抑制肽和不同濃度(2、2.5、5、10 mmol/L)Gly-Pro-AMC底物溶液，測定在不同抑制劑濃度和不同底物濃度的水平下吸光度的變化率。繪制Lineweaver-Buck雙倒數(shù)圖，并計算動力學參數(shù)，以此判斷不同DPP-IV抑制肽的抑制作用類型。

1.3.9 分子對接

參考WANG等[9]的方法，通過同源對比和檢索從Protein Data Bank數(shù)據庫(http://www.rcsb.org/pdb)獲取DPP-IV(PDB ID：5 J3 J)的三維晶體結構，使用Pymol軟件刪除DPP-IV結構中的水分子和配體。使用ChemOffice軟件搭建能量最小化的多肽結構，然后使用AutoDock軟件對DPP-IV受體蛋白進行添加氫、平衡電荷等處理，AutoGrid程序下設置網格間距為0.375 ?，將多肽配體和DPP-IV受體進行對接并尋找穩(wěn)定結構。

1.4 數(shù)據分析

所有測定進行3次平行。各組數(shù)據采用SPSS 23進行方差分析，以Duncan多重比較法進行顯著性分析(P<0.05)。采用Origin 2018進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 ACH的超濾分離

超濾是以具有不同大小孔徑的超濾膜為介質，依靠膜兩側的壓力差對混合物質進行分離和濃縮的分子級膜分離技術[10]，在多肽分離純化過程中可以使用超濾膜將蛋白酶解產物分成分子質量不同的組分，并分別探究各組分的生物活性。ACH經10 kDa和3 kDa超濾膜分離后得到分子質量不同的3個組分ACH-1(>10 kDa)、ACH-2(3～10 kDa)和ACH-3(<3 kDa)，各組分在20 mg/mL質量濃度下的DPP-IV抑制率如圖1所示。

圖1 中國毛蝦酶解產物超濾組分的DPP-IV抑制率Fig.1 DPP-IV inhibition rate of each ultrafiltration fraction of the enzymatic hydrolysate of Acetes chinensis注：不同字母代表在P<0.05水平上的顯著性差異(下同)

3個超濾組分DPP-IV抑制活性均高于原始酶解液，其中分子質量<3 kDa的ACH-3組分DPP-IV抑制率為(53.14±1.10)%，與ACH相比提高了8.82個百分點，并且顯著高于ACH-1的(46.81±1.39)%和ACH-2的(50.36±0.54)%。研究表明，生物活性肽的分子質量大小與其DPP-IV抑制活性之間存在一定聯(lián)系，即超濾后得到的分子質量較低的組分往往對DPP-IV的抑制作用較大。JIN等[11]使用胰蛋白酶水解三文魚皮凝膠制備DPP-IV抑制肽，超濾結果顯示分子質量<3 kDa的組分抑制效果更好；尹劍等[12]使用木瓜蛋白酶水解鱘魚皮膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)通過超濾得到的F-IV(<3 kDa)具有更高的DPP-IV抑制活性。這些結果均表示超濾有助于富集低分子質量多肽并提高酶解產物的DPP-IV抑制活性，因此選擇ACH-3組分進行下一步分離。

2.2 葡聚糖Sephadex-G15分離

凝膠過濾層析是一種分子篩技術，基于凝膠內部網孔能夠分離不同分子質量的蛋白質，已被廣泛用于不同種類生物活性肽的分離純化[13]。超濾得到的ACH-3組分通過葡聚糖凝膠Sephadex G-15分離后得到F1、F2、F3、F4和F5組分的凝膠色譜圖見圖2-a。各組分DPP-IV抑制率見圖2-b，在5個組分中F2抑制DPP-IV的效果最好，抑制率達到(53.76±0.57)%，與ACH-3組分的抑制率相近，顯著高于其他4個組分。F4和F5組分對DPP-IV的抑制作用較弱，抑制率均小于20%。在凝膠色譜中分子質量較大的組分最先被分離出來，可知F2的分子質量大于F3-F5組分，其中F4和F5被洗脫的時間更久，可能存在大量游離氨基酸從而降低DPP-IV抑制率。LANG等[7]使用Sephadex G-15凝膠色譜分離南極磷蝦粉酶解液分子質量<3 kDa的組分(C4)后得到了3個分離組分，其中分子質量較高的C4-2組分DPP-IV抑制活性高于C4-3。陳宏等[14]將牡蠣蛋白酶解液3 kDa超濾組分經Sephadex G-15分離后得到的4個不同組分，其中分子質量最小的F4組分IC50值反而較高。這些實驗結果證明了DPP-IV抑制活性與分子質量不完全呈負相關關系，可能還受氨基酸組成和序列等其他因素影響，所以有必要對凝膠分離組分進行下一步分離純化和結構鑒定。為此，在Sephadex G-15凝膠層析分離后選擇F2組分進行RP-HPLC分離純化。

a-Sephadex G-15凝膠色譜分離結果；b-各組分的DPP-IV抑制率圖2 Sephadex G-15凝膠色譜分離結果及各組分的DPP-IV抑制率Fig.2 Sephadex G-15 gel chromatography separation results and DPP-IV inhibition rate of each component

2.3 RP-HPLC分離

RP-HPLC具有柱效高、分離效果好、靈敏度高等優(yōu)點，是分析蛋白質和多肽的常用方法之一。多肽通過流動相進入反相色譜柱后，利用肽段的疏水性，根據不同分配系數(shù)依次流出，達到分離多肽的目的[15]。F2組分經RP-HPLC進行離純化，如圖3-a所示，F(xiàn)2組分按照分離時間和分離程度被分為F2-1、F2-2和F2-3。3個分離組分在20 mg/mL時DPP-IV抑制率如圖3-b所示，可知F2-3組分對DPP-IV的抑制率最高，為(75.17±1.06)%，顯著高于其他2個組分，證明RP-HPLC對多肽分離純化和增強活性效果比較明顯。GU等[16]以小米蛋白為原料制備DPP-IV抑制肽，對未超濾的酶解液直接采用Sephadex G-25分離，再經RP-HPLC純化后得到2條新型降血糖肽。AMINI SARTESNIZI等[17]通過超濾和RP-HPLC分離純化沙丁魚不同蛋白酶水解物分離出具有抗氧化和抗糖尿病的組分。這些實驗結果表明生物活性肽需要進行多次分離純化，可以明顯提高多肽的生物活性。

a-F2組分RP-HPLC圖；b-各組分的DPP-IV抑制率圖3 F2組分RP-HPLC圖和各組分的DPP-IV抑制率Fig.3 RP-HPLC chromatogram of F2 component and DPP-IV inhibition rate of each component

2.4 LC-MS/MS鑒定

LC-MS/MS是一種分離分析復雜混合物質的有效方法，常用于鑒定生物活性肽的結構序列。采用LC-MS/MS對反相液相色譜柱分離得到體外DPP-IV抑制活性最高的F2-3組分進行結構鑒定，將獲得的質譜信息與蛋白質數(shù)據庫進行對比后得到42條多肽，多肽長度從8～23個氨基酸不等。研究表明，高活性食源性DPP-IV抑制肽一般由10個以內氨基酸組成[18]且具有一定的結構特征，即N末端有疏水性氨基酸，N末端第二為Pro或Ala，且C末端為Pro[19]。根據這些結構特征，從已鑒定出的42條多肽序列中篩選出5條DPP-IV抑制肽，5條多肽的二級質譜圖如圖4所示。

a-YGGQFPTRPD;b-PALPSIPH;c-IFTAPQVP;d-PAFPHPLP;e-LGDAPGEVP圖4 DPP-IV抑制肽的MS/MS圖譜Fig.4 The MS/MS spectra of DPP-IV inhibitory peptides

在二級質譜中，母離子發(fā)生碰撞使得肽鏈中的肽鍵斷裂形成不同離子，在使用質譜分子多肽結構的過程中，N端離子碎片用b表示，C端離子碎片用y表示。根據二級質譜圖分析可知5條多肽的氨基酸序列分別為(a)YGGQFPTRPD、(b)PALPSIPH、(c)IFTAPQVP、(d)PAFPHPLP和(e)LGDAPGEVP。

2.5 合成肽的活性驗證

固相合成所得的5條中國毛蝦DPP-IV抑制肽之間氨基酸組成和結構存在不同程度的差異，可能導致多肽的生物活性不同。為驗證合成多肽對DPP-IV抑制作用的強弱，測定5條多肽在不同濃度下的DPP-IV抑制率，并以此計算多肽的半抑制濃度(IC50值)。由表1可知，5條DPP-IV抑制肽均含有Pro殘基且具有一定的DPP-IV抑制活性，IC50值分別為(188.63±0.25) mg/mL(YGGQFPTRPD，1 136.5 Da)，(2.68±0.06) mg/mL(PALPSIPH，830.5 Da)，(157.82±0.71) mg/mL(IFTAPQVP，871.5 Da)，(1.61±0.06) mg/mL(PAFPHPLP，874.5 Da)，(10.45±0.26) mg/mL(LGDAPGEVP，853.4 Da)，其中PALPSIPH和PAFPHPLP的IC50值較小，表明二者對DPP-IV的抑制作用較好。而陽性對照抑二肽素Ile-Pro-Ile(Diprotin A)的IC50值為1.25×10-2mmol/mL，比合成肽的IC50值低，這說明中國毛蝦DPP-IV抑制肽的活性與IPI相比較低。

表1 中國毛蝦DPP-IV抑制肽序列及對DPP-IV的IC50Table 1 Sequences and IC50 of DPP-IV inhibitory peptides from A. chinensis

PALPSIPH和PAFPHPLP相對較高的DPP-IV抑制活性可能歸因于其特殊的氨基酸序列，可以看出二者的N末端第二位氨基酸均為Ala，這一特征與腸促胰島素激素GLP-1的多肽結構相似[20]，說明它們可能具有DPP-IV的酶切位點易與DPP-IV結合，保護GLP-1不被降解，從而有效調節(jié)機體血糖。在對方鯛蛋白DPP-IV抑制肽的研究中，經RP-HPLC分離純化得到的22條序列中N端第二位氨基酸為Pro或Ala的多肽顯示出比較強的潛在DPP-IV抑制活性[21]。GARZN等[22]從高粱酒糟蛋白質水解物中分離得到的6條DPP-IV抑制肽中也有4條多肽具有該結構特征，且特征結構抑制肽與DPP-IV的結合能力更強，因而具有更好的DPP-IV抑制能力。此外，研究表明N末端前2位氨基酸對DPP-IV抑制特性起著決定性作用，而其他位置的氨基酸殘基則起到次要作用，所以PALPSIPH和PAFPHPLP的DPP-IV抑制活性相近，且DPP-IV抑制作用也顯著高于其他3條多肽(P<0.05)。

2.6 DPP-IV抑制肽對DPP-IV抑制作用類型研究

酶抑制劑通常與酶的特定部分在結構、電荷、疏水性等方面相匹配，酶抑制動力學是分析抑制劑與酶的作用機理的常用方法之一。抑制劑對酶的抑制作用包括競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。本文選擇DPP-IV抑制活性較高的PALPSIPH和PAFPHPLP對DPP-IV的作用類型進行探究，通過觀察同一條DPP-IV抑制肽在不同濃度下線性回歸曲線的交點位置來推測該抑制肽的作用類型。由圖5-a可知，PALPSIPH在不同樣品濃度下的線性回歸曲線相交于縱坐標軸的正半軸，屬于典型的競爭性抑制劑。在該抑制劑的作用下DPP-IV催化Gly-Pro-AMC的酶反應中米氏常數(shù)Km的值隨著抑制肽濃度增大逐漸增加，而最大反應速率Vm不隨抑制肽濃度的增加而改變。PAFPHPLP表現(xiàn)出競爭/非競爭性混合型抑制類型(圖5-b)，即不同抑制肽濃度的線性回歸線交點位于坐標軸的第2象限內，說明加入抑制劑后反應中的Km增大，而Vm不變。這表明PAFPHPLP在發(fā)揮抑制作用時，不僅與DPP-IV酶活性中心部位結合，還與活性中心以外的其他位點結合，通過這2種結合方式共同作用來抑制DPP-IV。

圖5 DPP-IV抑制肽PALPSIPH(a)和PAFPHPLP(b)的Lineweaver-Buck雙倒數(shù)圖Fig.5 Lineweaver-Buck double-reciprocal plot of peptides PSLPSIPH(a) and PAFPHPLP(b)

同時，PAFPHPLP比PALPSIPH表現(xiàn)出更高的DPP-IV抑制活性，這表明2種抑制方式的共同作用對DPP-IV的抑制效果可能更強。WANG等[9]通過研究羊皮基膠原蛋白肽發(fā)現(xiàn)，競爭/非競爭性混合型抑制肽GPAGPIGPV和GPAGPOFPG比其他合成肽的DPP-IV抑制活性更高；張穎[23]從牛乳蛋白中經分離純化得到YPVEPF、APGPAGP和LPIIDI，這3條DPP-IV抑制肽表現(xiàn)出競爭/非競爭性混合型抑制劑的特點，它們對DPP-IV的抑制作用也較高，均與本實驗結果一致。可能因為具有競爭/非競爭性混合型特征的抑制肽不被DPP-IV分解從而能夠以原始的結構與DPP-IV活性位點結合，這種有效結合可能會對DPP-IV產生很大的抑制作用。

2.7 分子對接

為探究中國毛蝦DPP-IV抑制肽的作用機理，使用分子對接分析多肽和DPP-IV受體間的相互作用位點和作用力類型。研究表明，DPP-IV是1種同源二聚體，每個亞基由2個催化結構域組成，即包含催化三聯(lián)體(Ser630、Asp708和His740)的α/β水解酶結構和八葉β-螺旋槳折疊結構[24]?；钚晕稽c主要有疏水口袋S1和疏水口袋S2。疏水口袋S1包括疏水氨基酸殘基(Try631、Val656、Trp659、Tyr662、Tyr666和Val711)和氧陰離子孔(Tyr547和Tyr631)，S2口袋除了包括疏水性殘基(Arg125、Phe357、Arg358、Tyr547、Pro550和Asn710)和氨基末端識別區(qū)(Glu205和Glu206)之外[25]，還有1個位置在S2口袋之外的延伸口袋(Val207、Ser209、Phe357和Arg358)[26]。這些活性位點與多肽上的氨基酸殘基結合后可以發(fā)揮DPP-IV抑制作用。PALPSIPH和PAFPHPLP與DPP-IV對接模型如圖6所示。

圖6 PALPSIPH(a)和PAFPHPLP(b)與DPP-IV分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram of PSLPSIPH(a) and PAFPHPLP(b) with DPP-IV注：紫紅色短棒狀模型表示DPP-IV抑制肽，藍色/淺藍色短棒狀模型表示DPP-IV殘基，黃色虛線表示氫鍵

可以看出2條DPP-IV抑制肽主要依靠氫鍵與DPP-IV殘基連接來發(fā)揮潛在抑制作用的。PALPSIPH與DPP-IV之間的結合部位共有3處，且均為DPP的活性中心，即S2口袋中的Arg358和Try547、S2延伸口袋中的Ser209，這也證明了PALPSIPH與已知的DPP-IV活性位點之間形成氫鍵，表明該抑制肽對DPP-IV的作用類型屬于競爭性抑制。PAFPHPLP與Gln533之間通過氫鍵作用力結合，而Gln33殘基并不屬于已報道的DPP-IV活性中心，也說明PAFPHPLP與DPP-IV之間存在非競爭性抑制。

PSLPSIPH和PAFPHPLP 2條DPP-IV抑制肽可以與DPP-IV結合從而起到抑制作用，表2展示了多肽經分子對接模擬得到的對接能量參數(shù)結果。其中結合能的絕對值越大，配體和受體結合釋放的能力越多，說明對接效果越好[27]。PSLPSIPH和PAFPHPLP與DPP-IV酶之間的對接結合能分別為-8.45 kcal/mol和-8.55 kcal/mol，其中PAFPHPLP其他能量參數(shù)值均小于PSLPSIPH，這表明PAFPHPLP與DPP-IV結合形成的復合物更穩(wěn)定，對DPP-IV抑制效果也更好。這一對接結果與體外DPP-IV抑制活性結果相印證，即表明PAFPHPLP對DPP-IV的抑制作用更強。

表2 多肽與DPP-IV分子對接模擬的能量參數(shù)Table 2 Binding energy parameters of peptides and DPP-IV obtained by molecular docking simulation

3 結論

中國毛蝦經動物蛋白酶水解得到的酶解液具有一定的DPP-IV抑制活性，其中對DPP-IV酶有抑制作用的組分主要富集在低分子質量多肽(分子質量<3 kDa)中。超濾組分ACH-3再經Sephadex G-15和RP-HPLC分離純化和LC-MS/MS技術對抑制活性最高的組分進行結構鑒定，經數(shù)據庫檢索和結構特征對比，最后篩選出YGGQFPTRPD、PALPSIPH、IFTAPQVP、PAFPHPLP和LGDAPGEVP 5條DPP-IV抑制肽。通過固相合成和活性驗證可知PALPSIPH和PAFPHPLP對DPP-IV的抑制效果較強，結果表明PALPSIPH，分子質量為830.5 Da，IC50值為(2.68±0.14) mmol/mL，與DPP-IV活性位點中的Arg358、Try547和Ser209通過氫鍵相結合，屬于競爭性抑制；PAFPHPLP，分子質量為874.5 Da，IC50值為(1.61±0.06) mg/mL，通過氫鍵連接DPP-IV活性中心以外的Gln533殘基，說明二者之間存在非競爭性抑制。本文以中國毛蝦為原料制備得到了2條活性較好的DPP-IV抑制肽，不僅為中國毛蝦的高值化利用和資源開發(fā)提供了新的方向，同時為天然來源的食源性DPP-IV抑制肽研究提供了基礎理論依據，以期為中國毛蝦作為潛在的功能性水產原料奠定基礎。