海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化交聯(lián)漆酶及在鼓泡式反應(yīng)器中降解雙酚A

魏勝華，沈琪，秦夢茹，張慧云，湯中勛，李松，孟娜

(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

雙酚A(bisphenol A, BPA)，又名二酚基丙烷，是一種具有雌激素效應(yīng)的環(huán)境污染物，微量的BPA就可對(duì)水體生物和人類健康產(chǎn)生極大的危害，該物質(zhì)與許多疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[1]。然而，在現(xiàn)實(shí)生活中BPA與人們的生活又緊密相關(guān)，是制造嬰兒奶瓶、食品包裝盒以及微波爐飯盒的起始材料。伴隨著BPA生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，制造與應(yīng)用過程中產(chǎn)生的廢水排放以及BPA制品分解導(dǎo)致的環(huán)境污染越來越引起人們的重視[2]。目前人們采取了多種方法來消除水體中BPA的污染，包括化學(xué)氧化[3]、物理吸附[4]、光催化[5]及生物降解等手段[6-7]。

漆酶(laccase, E.C.1.10.3.2)是一種含有銅離子的多酚氧化酶，該酶能利用分子氧為最終電子受體，實(shí)現(xiàn)多種化合物的高效氧化，在治理環(huán)境污染方面具有廣闊的應(yīng)用前景[8-10]。漆酶能夠催化BPA形成苯氧自由基的中間體，而后這些具有活性的中間體在酶促反應(yīng)位點(diǎn)外發(fā)生共價(jià)耦合，生成不同形態(tài)的多聚體，其往往是高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量的混合物，高分子質(zhì)量的不溶性低聚物常沉淀在水溶液中，可以采用過濾、沉淀或者離心等方法與水相分離，低分子質(zhì)量的化合物一般可以進(jìn)一步代謝成為有機(jī)酸，總體上看，所降解產(chǎn)物的毒性都較低或者無毒，且后期易于處理，具有去除效果顯著和環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)[11-13]。然而由于漆酶的穩(wěn)定性差，難以重復(fù)使用，使其在含BPA廢水的處理中的應(yīng)用受到了限制。

提高酶穩(wěn)定性最有效的方法是酶的固定化，包埋法是常用的技術(shù)手段之一，通過將酶蛋白限制在高聚物的網(wǎng)格之中實(shí)現(xiàn)酶的固定化。其制備過程較為簡單，酶蛋白本身的特性改變小，固定化顆粒適合在多種反應(yīng)器中進(jìn)行催化反應(yīng)。海藻酸鈉是一種常用的固定化材料，是由古洛糖酸與甘露糖醛酸為單元結(jié)構(gòu)連接而成的一種多糖，其與二價(jià)陽離子反應(yīng)時(shí)可以很快形成多孔凝膠從而實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的包埋[14]。為了有利于物質(zhì)的傳遞，擴(kuò)大膠體顆粒的內(nèi)部的固定化空間，提高其機(jī)械強(qiáng)度，人們往往采用海藻酸鈉和明膠進(jìn)行協(xié)同固定化，目前在果糖轉(zhuǎn)移酶[15]、L-阿拉伯糖異構(gòu)酶[16]、S-腺苷甲硫氨酸合成酶[17]等酶的固定化中都有應(yīng)用的報(bào)道，然而由于其孔徑的增大，會(huì)造成反應(yīng)過程中酶的泄露，從而使酶活力損失、催化效率下降。

本文采用戊二醛預(yù)先處理漆酶溶液，使酶分子預(yù)先交聯(lián)形成較大的體積，然后以海藻酸鈉-明膠為材料進(jìn)行包埋，所制備的固定化交聯(lián)酶顆粒具有不易泄露、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，而且底物和產(chǎn)物的傳遞受到的阻遏作用較小，有助于酶對(duì)底物的快速降解。重點(diǎn)研究了影響固定化交聯(lián)酶制備的主要因素，探究了固定化交聯(lián)酶的穩(wěn)定性，考察了固定化交聯(lián)酶在鼓泡式反應(yīng)器中對(duì)BPA的降解能力，為漆酶在治理內(nèi)分泌干擾物污染方面提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漆酶，來源于Trametessp.LS-10C(CCTCC NO:M2015191)通過固態(tài)發(fā)酵制得[18]；BPA(分析純)阿拉丁試劑有限公司；海藻酸鈉、明膠、戊二醛、愈創(chuàng)木酚、醋酸和醋酸鈉等其他試劑，均為分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化交聯(lián)酶的制備

海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化交聯(lián)漆酶制備的過程見圖1，具體過程如下：將一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液加入10 mL的粗漆酶溶液中，在25 ℃下磁力攪拌反應(yīng)2 h后，然后在4 ℃下透析去除未反應(yīng)的戊二醛，得到交聯(lián)的漆酶溶液；分別稱取明膠0.4 g、海藻酸鈉0.4 g于100 mL燒杯中加入20 mL純凈水，85 ℃加熱攪拌溶解，待溶解完全后，冷卻至室溫，將上述得到的交聯(lián)漆酶溶液以10%(體積分?jǐn)?shù))的量加入其中，充分?jǐn)嚢锜o氣泡后用注射器通過16號(hào)針頭將明膠-海藻酸鈉和交聯(lián)漆酶混勻的溶液滴入500 mL的質(zhì)量濃度為15 g/L CaCl2溶液中，過程中采用磁力攪拌使顆粒之間不黏連在一起，并保持固化1 h后過濾洗滌，得到固定化交聯(lián)酶的顆粒，所制備的固定化酶稱為固定化交聯(lián)酶；作為對(duì)照，以不經(jīng)過戊二醛處理后的酶而直接制備的固定化酶稱為固定化游離酶。

圖1 海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化交聯(lián)漆酶的過程Fig.1 Process of immobilized cross-linked laccase by sodium alginate-gelatin

1.2.2 固定化交聯(lián)酶穩(wěn)定性的研究

pH穩(wěn)定性：取一定量的固定化酶和游離酶分別放置在pH 3.0(50 mmol/L檸檬酸鹽)緩沖液和pH 8.0(50 mmol/L醋酸鹽)緩沖液中，靜置不同的時(shí)間后取樣測定酶活力，計(jì)算其剩余的催化活力。

溫度穩(wěn)定性：取一定量的固定化酶和游離酶放置在40～70 ℃的恒溫水浴中，靜置60 min后取樣測定酶活力，計(jì)算其剩余的催化活力。

操作穩(wěn)定性：將固定化酶置于pH 4.0的醋酸鹽緩沖溶液中室溫下進(jìn)行振蕩，定時(shí)取樣，然后過濾洗滌，考察其剩余的催化活力。

1.2.3 BPA的降解

固定化酶降解BPA的反應(yīng)在鼓泡式反應(yīng)器中進(jìn)行，反應(yīng)器規(guī)格為高22 cm，直徑9 cm，置于水浴鍋中保持溫度恒定，空氣用壓縮機(jī)通過濾膜從底部打入，采用空氣流量計(jì)控制進(jìn)氣的速率。反應(yīng)體系中含有1 L的質(zhì)量濃度為10 μg/mL的BPA溶液，20 g固定化酶顆粒，反應(yīng)pH為4.0，溫度30 ℃，通氣量0.5 L/min。

1.2.4 分析檢測

漆酶活力的測定采用比色法，以愈創(chuàng)木酚為底物[19]，固定化率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

BPA的含量采用4-氨基安替吡啉顯色法檢測[20]，降解率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化交聯(lián)漆酶條件的選擇

2.1.1 戊二醛的濃度對(duì)固定化的影響

圖2顯示了戊二醛對(duì)固定化酶制備的影響，隨著戊二醛濃度的增加，固定化酶的活力和固定化率都是逐漸增加的，當(dāng)戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時(shí)，固定化酶的活力和固定化率都達(dá)到最高。但是由于戊二醛的活性較強(qiáng)，進(jìn)一步增加戊二醛的濃度會(huì)使酶蛋白過度交聯(lián)，影響活性中心的構(gòu)象，造成酶的活力有較大的損失[21]。通常包埋法是直接將游離酶與固定化的載體材料混合在一起，由于單個(gè)酶分子直徑較小，很容易從固定化凝膠顆粒的網(wǎng)格中游離出去，因此在反應(yīng)的過程中會(huì)有酶的泄露，從而造成酶活力的損失，在本實(shí)驗(yàn)中利用戊二醛與酶蛋白反應(yīng)形成席夫堿可以使酶分子之間形成交聯(lián)，從而增大了酶分子的體積，這樣就降低了酶蛋白從固定化顆粒中泄露的幾率[22]。戊二醛作為一種交聯(lián)劑常用在酶的固定化中，其常規(guī)操作是在酶被包埋以后，再加入戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，這種方法雖然能夠增加酶與載體的結(jié)合強(qiáng)度，但是在固定化過程中酶的流失依然無法避免[23]。

圖2 戊二醛濃度對(duì)固定化的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on immobilization

2.1.2 載體對(duì)固定化的影響

圖3顯示了海藻酸鈉和明膠的質(zhì)量比對(duì)固定化效果的影響，添加一定量的明膠對(duì)于改善固定化的效果是比較明顯的，但是明膠的含量不能太高，否則會(huì)使固定化凝膠的網(wǎng)格過大和凝膠的強(qiáng)度下降，當(dāng)兩者質(zhì)量比為1∶1時(shí)效果最好。近年來，復(fù)配材料越來越多地應(yīng)用在酶和細(xì)胞的固定化中，復(fù)配可結(jié)合各種固定化載體材料的優(yōu)點(diǎn)，使固定化效果達(dá)到最佳[24]。包埋法固定化酶由于聚合物的阻遏作用，使其難以有效調(diào)控傳質(zhì)，影響底物、產(chǎn)物和氧的傳遞，特別是漆酶降解BPA以及其他化合物過程中會(huì)形成大分子的聚合體，必須要及時(shí)地從固定化酶凝膠顆粒內(nèi)部擴(kuò)散出來。添加明膠可以在保持固定化顆粒完整性和強(qiáng)度的基礎(chǔ)上減少海藻酸鈉的使用量，相應(yīng)地增大了凝膠網(wǎng)格的孔徑，有利于提高固定化酶的催化效率[25]。

圖3 海藻酸鈉和明膠質(zhì)量比對(duì)固定化酶的影響Fig.3 Effect of the mass ratio of sodium alginate to gelatin on immobilized enzyme

2.1.3 CaCl2濃度對(duì)固定化的影響

圖4顯示了CaCl2濃度對(duì)固定化的影響，多孔隙網(wǎng)狀空間的海藻酸鈣凝膠結(jié)構(gòu)形成的過程是Na+與溶液中Ca2+在羧基部位進(jìn)行離子交換，隨后Ca2+將兩側(cè)海藻酸分子鏈上的羧酸基團(tuán)相連從而形成交聯(lián)，當(dāng)CaCl2質(zhì)量濃度達(dá)到15 g/L時(shí)，固定化率與固定化酶活力趨于穩(wěn)定，表明此時(shí)形成的海藻酸鈣致密網(wǎng)格結(jié)構(gòu)能夠?qū)⒚傅鞍籽杆侔?，酶的流失較少。Ca2+濃度不足，其與Na+不能實(shí)現(xiàn)有效的交換而導(dǎo)致交聯(lián)的程度不高，固定化顆粒整體的機(jī)械強(qiáng)度較低，無法耐受后期反應(yīng)過程中剪切力的作用；隨著Ca2+濃度的增加，固定化顆粒的交聯(lián)度也隨之上升，機(jī)械強(qiáng)度也逐步增強(qiáng)；但是過高的Ca2+濃度使滴入海藻酸鈉液珠的表面迅速交聯(lián)形成致密的凝膠層，造成后續(xù)的Ca2+較難進(jìn)一步滲入到凝膠內(nèi)部，形成外硬內(nèi)軟的空心結(jié)構(gòu)[26]。

圖4 CaCl2濃度對(duì)固定化酶的影響Fig.4 Effect of CaCl2 concentration on immobilized enzyme

綜上，固定化交聯(lián)漆酶時(shí)戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%、m(海藻酸鈉)∶m(明膠)=1∶1、CaCl2質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)的效果最好，固定化酶的酶活力為0.13 U/g。

2.2 固定化交聯(lián)酶穩(wěn)定性的研究

2.2.1 pH穩(wěn)定性

圖5為固定化酶的pH穩(wěn)定性。

a-pH 3.0；b-pH 8.0圖5 固定化酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of immobilized enzyme

經(jīng)固定化的處理后，酶對(duì)酸堿的耐受性得到了一定程度的提高，這得益于載體所構(gòu)建的微環(huán)境的保護(hù)作用，相比較而言固定化交聯(lián)漆酶的穩(wěn)定性要好于固定化游離酶，這可能是由于戊二醛的交聯(lián)作用增強(qiáng)了酶的剛性結(jié)構(gòu)，使其更能抵抗環(huán)境中的pH的變化。

2.2.2 溫度穩(wěn)定性

由圖6可知，固定化交聯(lián)酶對(duì)高溫的耐受性更強(qiáng)，在70 ℃時(shí)處理60 min后游離酶活力損失較大，固定化酶耐熱性較強(qiáng)，還剩余58.84%的酶活力，而固定化交聯(lián)酶剩余68.75%的酶活力，這可能是一方面戊二醛交聯(lián)增加了酶分子的穩(wěn)定性，另一方面可能是海藻酸鈉作為多糖本身就可以提高酶蛋白的抗逆性[27]。

圖6 固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of immobilized enzyme

2.2.3 操作穩(wěn)定性

圖7顯示了固定化酶在連續(xù)振蕩的操作條件下酶活力保留情況。

圖7 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.7 Operation stability of immobilized enzyme

通過振蕩作用可以加速凝膠內(nèi)部的酶分子向顆粒外部擴(kuò)撒，長時(shí)間的振蕩會(huì)使固定化酶活力降低，在固定化顆粒保持完整的情況下，這只能是振蕩作用使酶的擴(kuò)散泄露所造成的結(jié)果。隨著時(shí)間的延長，酶的泄露也會(huì)越多，從而造成酶活力的進(jìn)一步降低。但與固定化游離酶相比，固定化交聯(lián)酶的剩余酶活力相對(duì)要高些，說明其酶蛋白的泄露較少。在30 h的振蕩后，固定化交聯(lián)酶的剩余酶活力為62.52%，高于固定化游離酶的45.28%，顯示其操作的穩(wěn)定性得到了進(jìn)一步地提高。

2.3 鼓泡式反應(yīng)器中降解BPA

鼓泡式反應(yīng)器具有傳質(zhì)效果好、剪切力小，反應(yīng)過程中固定化顆粒不易破裂的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于機(jī)械強(qiáng)度一般的固定化酶的顆粒[28]。如圖8所示，固定化交聯(lián)酶和固定化游離酶的催化性能基本相似，反應(yīng)3 h后的降解率達(dá)到85%以上。

圖8 BPA的降解過程Fig.8 Degradation process of BPA

圖9顯示了固定化酶在連續(xù)批次反應(yīng)中的情況， 2種固定化酶的穩(wěn)定性差別較大，連續(xù)5個(gè)批次的反應(yīng)以后固定化交聯(lián)酶剩余酶活力為34.93%，BPA的降解率仍能達(dá)到71.13%，分別是固定化游離酶的7.97倍和4.43倍，這說明采用先交聯(lián)后包埋的固定化策略，可以有效地解決酶的泄露，保持固定化酶的穩(wěn)定性，有利于催化劑的反復(fù)使用。

圖9 固定化酶重復(fù)使用的性能Fig.9 Reusability of immobilized enzyme

3 結(jié)論

本文以海藻酸鈉與明膠按照1∶1的質(zhì)量比例為載體材料協(xié)同固定化漆酶，吸取了2種固定化材料的優(yōu)點(diǎn)，通過添加明膠，增大了固定化酶凝膠顆粒的孔徑，克服了常規(guī)的海藻酸鈉固定化酶中由于凝膠孔徑較小而對(duì)傳質(zhì)的阻遏。

在常規(guī)的包埋法固定化的基礎(chǔ)上，通過預(yù)先將酶用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的戊二醛經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚?，使酶聚集在一起，增大酶蛋白的體積，有效地解決了現(xiàn)有的酶在固定化以及反應(yīng)過程中，由于酶流失造成的活力下降，使固定化酶的操作穩(wěn)定性得以提高，而且酶分子所形成的較大體積更適用于大孔徑的固定化凝膠，有利于大分子物質(zhì)的進(jìn)出。

通過對(duì)固定化酶的各項(xiàng)穩(wěn)定性研究表明，所制備的固定化交聯(lián)漆酶在穩(wěn)定性上較固定化游離酶有了較大的提高；在鼓泡式反應(yīng)器中對(duì)BPA進(jìn)行降解試驗(yàn)，結(jié)果表明，連續(xù)5個(gè)批次的反應(yīng)以后固定化交聯(lián)酶剩余酶活力為34.93%，BPA的降解率仍能達(dá)到71.13%，分別是固定化游離酶的7.97倍和4.43倍，表明本文所建立的海藻酸鈉-明膠協(xié)同固定化交聯(lián)漆酶的方法適合重復(fù)性和連續(xù)性的操作，具有一定的應(yīng)用潛力。