白酒發(fā)酵過程中高級醇影響因素的研究

張小娜，宋翠穎，郭世鑫，姚孟琦，馬文瑞，張鳳杰，賈士儒*，李紅*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300222)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)3(國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京，100015)

白酒是以糧食谷物為原料，以酒曲為糖化劑和發(fā)酵劑，經(jīng)過糖化、發(fā)酵、蒸餾和勾兌而成的蒸餾酒[1]。高粱是制作白酒的主要原料，且不同產(chǎn)地高粱產(chǎn)出白酒酒體的風格不同[2]。白酒中含有豐富的風味物質(zhì)，高級醇就是其中重要的一類，高級醇具有高沸點、強揮發(fā)性，其主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇等，是2個碳以上的一元醇類物質(zhì)的總稱，又被稱作雜醇油[3-4]。研究表明，高級醇的代謝包括埃里希(Ehrlich)途徑[5]和合成代謝(Harris)[6]途徑，Ehrlich代謝機制是在酵母細胞間氨基酸轉(zhuǎn)氨，再脫羧(去CO2)，最后生成比原氨基酸少1個碳原子的高級醇；Harris途徑是酵母利用糖以α-酮酸及醛為重要中間產(chǎn)物合成高級醇。

高級醇作為風味物質(zhì)對酒體的貢獻很大[7]，高級醇的種類和含量決定了白酒的香氣特征[8]和口感[9]，適量的高級醇可以使得酒體更加協(xié)調(diào)、豐滿，高級醇含量過少則會使酒體過于單薄、不夠飽滿，然而過量的高級醇會破壞酒體質(zhì)量，飲后會產(chǎn)生苦、澀等不愉快的感受，還會因不容易代謝而對神經(jīng)造成難以修復(fù)的損傷，使人產(chǎn)生頭痛、惡心等上頭現(xiàn)象，對人們身體健康造成威脅[10]。因此，調(diào)控高級醇的含量對白酒的生產(chǎn)極其重要。

在白酒發(fā)酵過程中，白酒的發(fā)酵條件影響著雜醇油的含量，如氮源種類[11]、曲糧比例[12]、加糠量以及投糧量[13]等。白酒是通過多種微生物混合發(fā)酵、共同作用的產(chǎn)物，雜醇油是酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量的多少與酵母代謝途徑息息相關(guān)[14]，通過調(diào)控微生物來控制高級醇含量也是一個潛在的突破點。因此，可通過工藝條件和微生物的優(yōu)化來調(diào)控高級醇的含量。

本文通過模擬白酒工藝進行固態(tài)發(fā)酵，對比大曲和小曲對酒體高級醇的影響，進行液態(tài)發(fā)酵對比酒曲微生物利用葡萄糖發(fā)酵的能力，研究不同產(chǎn)地粳高粱、不同加曲量以及曲與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)3種菌協(xié)同合作對白酒高級醇含量的影響，以期為白酒釀造過程中高級醇產(chǎn)生量的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N-1、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)J-1、米曲霉(Aspergillusoryzae)Q-1均為工業(yè)生產(chǎn)用優(yōu)良菌株，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院實驗室保存。

1.1.2 原料

山西粳高粱、東北粳高粱、小曲、大曲，市售；α-淀粉酶(≥3 700活力單位/g)、糖化酶(≥10萬單位/g)，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

1.1.3 儀器

固相微萃取進樣器、固相微萃取柱(50/30 μm，DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；Clarus 600型GC-MS聯(lián)用儀、AutoSystem XL氣相色譜儀、CP-Wax 57CB毛細管色譜柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)，美國PerkinElmer公司。

1.2 測定方法

1.2.1 氣相色譜分析方法[15]

柱溫程序：起始溫度40℃，恒溫2 min，以10 ℃/min程序升溫至60 ℃，以20 ℃ /min程序升溫至120 ℃，以40 ℃/min程序升溫至220 ℃；載氣(高純N2)：流速8 mL/min，分流比1∶1；H2流速45 mL/min；空氣流速450 mL/min；檢測器溫度250 ℃；進樣器溫度240 ℃。

1.2.2 GC-MS對微量風味成分的定量分析[16]

將分析酒樣用超純水降度至10%，移取一定量稀釋后的酒樣于20 mL的頂空瓶中，加入NaCl至飽和后再加入內(nèi)標儲備液，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)，密封。插入萃取頭，纖維頭置于距離酒樣表面約20 mm的上部空間，攪拌約15 min，在50 ℃水浴溫度下萃取，先預(yù)熱15 min，萃取30 min后，取出手柄，直接進樣分析。

GC-MS條件：DB-WAX ETR型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱升溫程序：初始溫度35 ℃，恒溫2 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，不分流。電子轟擊(electron impact，EI)離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度240 ℃，離子源溫度240 ℃，質(zhì)量掃描m/z55～500。

1.3 菌液及培養(yǎng)基的制備

1.3.1 酵母種子液制備[17]

一級種子液：從試管斜面接種一環(huán)酵母菌于5 mL YPD培養(yǎng)基的20 mL試管中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。

二級種子液：將1 mL一級種子液轉(zhuǎn)接入裝有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，至菌液濃度為107CFU/mL左右。

1.3.2 米曲霉孢子懸浮液制備[18]

霉菌孢子懸浮液的制備：于活化的菌株斜面倒入10 mL無菌水，用接種環(huán)刮下斜面上孢子，將孢子打散混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)，進行稀釋，至孢子濃度為108CFU/mL左右[15]。

1.3.3 高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基

高梁汁發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取100 g粉碎高粱(粒度0.45 mm)加入800 mL自來水，蒸煮2 h，冷卻后加入1.35 g α-淀粉酶、0.05 g糖化酶進行糖化、液化處理，攪拌均勻放置于60 ℃水浴鍋中保溫2～3 h，期間使用稀碘液試紙不變藍，繼續(xù)加熱煮沸5 min，冷卻后過濾，調(diào)整糖度為7°Bx。115 ℃滅菌20 min備用。

1.4 發(fā)酵工藝

實驗室模擬白酒固態(tài)發(fā)酵采取陶罐發(fā)酵，工藝如下所示：

原料→粉碎→潤糧→蒸糧→攤晾加水→加曲→入缸發(fā)酵→出缸拌糠→裝甑蒸餾→風味檢測

工藝要點如下：將高粱粉碎，粉碎粒度至1.5 mm，稱取粉碎好的1 000 g高粱加入600 mL的85 ℃熱水潤糧24 h，第2天將高粱蒸煮80 min后，加入300 mL冷水，冷卻待溫度降到25～30 ℃時，添加160 g的大曲粉或者小曲粉，將曲和料拌勻后，裝入罐內(nèi)發(fā)酵，將陶罐完全密封，發(fā)酵30 d后拌糠蒸餾[19]。

實驗室模擬液態(tài)白酒發(fā)酵采取三角瓶發(fā)酵，根據(jù)實驗設(shè)計將菌液或曲粉接種于含100 mL高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃靜置培養(yǎng)數(shù)天，發(fā)酵結(jié)束后樣液用1.2.1方法測定高級醇含量，每個實驗重復(fù)3次。

1.4.1 小曲、大曲對固態(tài)發(fā)酵酒的影響

利用小曲、大曲2種酒曲分別按照實驗室模擬固態(tài)白酒發(fā)酵方法進行，用1.2.2方法檢測酒樣風味成分。

1.4.2 粳高粱產(chǎn)地對液態(tài)發(fā)酵小曲酒的影響

按照1.3.1方法分別制備山西粳高粱、東北粳高粱發(fā)酵培養(yǎng)基。加入清香小曲2 g，按照實驗室模擬液態(tài)白酒發(fā)酵方法發(fā)酵1～7 d后取樣分析。

1.4.3 加曲量對液態(tài)發(fā)酵小曲酒的影響

加曲量按曲糧比為(2%、4%、6%、8%、10%，質(zhì)量分數(shù)，下同)分別按照1.4中實驗室模擬液態(tài)白酒發(fā)酵方法進行，發(fā)酵5 d后取樣分析。

1.4.4 曲與微生物對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

按照實驗室模擬液態(tài)白酒發(fā)酵方法進行，在高粱汁中接種大曲、異常威克漢姆酵母、釀酒酵母的二級種子液和米曲霉的孢子懸浮液按照表1添加量進行發(fā)酵。

表1 微生物接種量與大曲加樣量Table 1 Microbial inoculation and Daqu dosing

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Origin、Excel 2019和SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小曲、大曲對固態(tài)發(fā)酵酒的影響

小曲、大曲對固態(tài)發(fā)酵白酒的總高級醇、總?cè)?、總酯含量如圖1所示，總酯是乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯含量的總和;總高級醇為仲丁醇、正丁醇、異戊醇、異丁醇、正丙醇、活性戊醇、苯乙醇、正己醇8種高級醇的總和；總?cè)┖渴且胰⒈?、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、苯甲醛含量的總和。大曲酒總高級醇、總酯、總?cè)┑暮烤哂谛∏疲源笄葡啾容^于小曲酒醇香馥郁、回味甘甜。由于二者中所富含的微生物種類、數(shù)量、性能不同，利用小曲、大曲釀出的酒的高級醇含量也有很大差異的，酒曲的種類不同會影響到白酒中高級醇的含量。

圖1 小曲、大曲酒的高級醇總和、總酯、總?cè)Ρ菷ig.1 Comparison of the total higher alcohols, total ester and total aldehyde of Xiaoqu and Daqu Baijiu

小曲、大曲對固態(tài)發(fā)酵白酒的高級醇含量影響如表2所示，總高級醇含量是仲丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、苯乙醇、正己醇的含量的總和。大曲酒的總高級醇含量為(1 099.47±113.71) mg/L，小曲酒總高級醇含量為(857.50±78.13) mg/L，高出了28.2%。大曲酒中正丙醇、異丁醇、異戊醇的含量高于小曲酒，而正丁醇、苯乙醇和活性戊醇的含量低于小曲酒。

表2 小曲、大曲對固態(tài)發(fā)酵白酒醇類物質(zhì)的影響 單位：mg/LTable 2 Effects of Daqu and Xiaoqu on alcohols of solid fermented Baijiu

2.2 不同產(chǎn)地粳高粱對液態(tài)發(fā)酵小曲酒的影響

如圖2所示，同樣是粳高粱，小曲在不同產(chǎn)地的粳高粱汁中發(fā)酵時產(chǎn)高級醇的含量不同。隨著發(fā)酵時間的變化，小曲在山西粳高粱汁中發(fā)酵了2 d達到峰值后總高級醇含量呈遞減趨勢，到第5天時總高級醇含量升高后繼續(xù)下降，而在東北粳高粱汁中發(fā)酵時總高級醇含量呈遞減趨勢，東北粳高粱發(fā)酵1天所產(chǎn)高級醇含量比山西粳高粱高3.5倍，總高級醇含量相差最大。

圖2 液態(tài)發(fā)酵中不同產(chǎn)地粳高粱產(chǎn)總高級醇含量Fig.2 Content of total higher alcohol produced by japonica sorghum of different origins during liquid fermentation注：總高級醇為異戊醇、異丁醇、正丙醇3種主要高級醇的總和

造成此現(xiàn)象原因可能是不同高粱的淀粉結(jié)構(gòu)和含量間的差異，東北粳高粱所含的淀粉更容易被微生物分解利用，同時產(chǎn)生酒精和副產(chǎn)物高級醇[20]。發(fā)酵前期可能由于淀粉含量較高，利用較充分，發(fā)酵到5 d時山西粳高粱中淀粉含量略高于東北粳高粱，也可能是由于不同高粱中的單寧含量不同從而對微生物種群產(chǎn)生了一定的影響[21]。

2.3 不同加曲量對液態(tài)發(fā)酵小曲酒的影響

以山西高粱為原料用小曲進行液態(tài)發(fā)酵，通過添加不同曲料比探究對高級醇含量的影響(圖3)。曲料比在4%時3種高級醇的含量最高，而曲料比在2%時產(chǎn)高級醇含量最少，曲料比在6%、8%、10%時3種高級醇的總含量相差不大。曲料比在2%時所產(chǎn)的3種高級醇含量的總和比曲料比在4%時低98.4%。造成該現(xiàn)象的原因可能是在曲料比為2%時，由于加曲量太少，富集的微生物含量過少從而產(chǎn)高級醇較少。在曲料比為6%、8%、10%時，由于加曲量過多從而富集微生物過多，導致微生物之間相互競爭進而生長受到抑制，最終導致產(chǎn)高級醇的微生物存活量較少，進一步減少了微生物分解氨基酸或利用葡萄糖過程中高級醇的生成。曲料比為4%時，各微生物之間可能達到平衡或互利模式，使得微生物的生長到達最適狀態(tài)，從而產(chǎn)高級醇較高。因此在工藝優(yōu)化中可以通過調(diào)節(jié)曲料比來控制高級醇含量。

圖3 不同加曲量對產(chǎn)高級醇的影響Fig.3 Effect of Daqu content on the production of higher alcohols

2.4 曲與微生物對液態(tài)發(fā)酵大曲酒的影響

不同曲與菌種液態(tài)發(fā)酵的高級醇含量如圖4-a～圖4-c所示，在大曲、各菌種單獨發(fā)酵時，異常威克漢姆酵母J-1產(chǎn)異戊醇和異丁醇的能力低于釀酒酵母N-1，產(chǎn)正丙醇的能力高于釀酒酵母N-1。米曲霉Q-1高級醇產(chǎn)量最低，釀酒酵母N-1發(fā)酵產(chǎn)3種高級醇總含量最高(圖4-d)，說明釀酒酵母N-1充分利用高粱汁的碳源生成高級醇的能力最強。

a-異戊醇；b-異丁醇；c-正丙醇；d-3種高級醇總含量圖4 大曲和菌種液態(tài)發(fā)酵對高級醇的影響Fig.4 Effect of liquid fermentation of Daqu and strains on higher alcohols注：G-大曲；J-異常威克漢姆酵母J-1；N-釀酒酵母N-1；Q-米曲霉Q-1；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

如圖4-d所示，大曲和米曲霉Q-1共同發(fā)酵時相對于大曲單獨發(fā)酵，高級醇含量有所提高，可能因為米曲霉Q-1與大曲中微生物協(xié)同產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物高級醇[22]；大曲和釀酒酵母N-1共同發(fā)酵時，高級醇含量相比大曲單獨發(fā)酵時有顯著的上升，但比釀酒酵母N-1菌種單獨發(fā)酵時的產(chǎn)量低，可能由于其過度增殖，而大曲中的微生物與其有競爭關(guān)系，導致釀酒酵母N-1細胞量減少，從而降低了高級醇含量；大曲和異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵時產(chǎn)高級醇量相比大曲單獨發(fā)酵時低，是因為微生物間相互抑制，導致產(chǎn)高級醇的微生物存活率較低，降低了高級醇的含量。

酵母與大曲中產(chǎn)高級醇的微生物共同發(fā)酵時有抑制作用，大曲與釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1混合發(fā)酵時高級醇含量顯著低于大曲單獨發(fā)酵時。釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵產(chǎn)高級醇的含量明顯要低于釀酒酵母N-1單獨發(fā)酵時，說明2種酵母共同發(fā)酵時存在競爭關(guān)系。

大曲與米曲霉Q-1、釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵時比3種菌株混合發(fā)酵時產(chǎn)異戊醇、異丁醇和正丙醇的含量分別降低了53.88%、47.77%、88.57%，但比大曲和釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1混合發(fā)酵時的異戊醇和異丁醇含量分別增加了73.79%和60.30%，說明米曲霉Q-1產(chǎn)生的蛋白酶對大曲和釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵時利用氨基酸產(chǎn)異戊醇和異丁醇起到了促進作用。米曲霉Q-1、釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵時與釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1混合發(fā)酵時相比，所產(chǎn)異戊醇、異丁醇分別降低了5.17%和4.20%，正丙醇增加了1.96%，說明米曲霉Q-1對2種酵母混合發(fā)酵產(chǎn)高級醇沒有顯著影響。

3 結(jié)語

通過改變酒曲種類、產(chǎn)地釀酒原料、加曲量以及微生物等多個因素模擬白酒發(fā)酵實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：利用小曲釀酒和大曲釀酒酯類和醇類物質(zhì)產(chǎn)量差別較大，小曲發(fā)酵產(chǎn)高級醇含量較少，可能是因為小曲富含的微生物種類、數(shù)量、性能與大曲的不同，因此后期可通過篩選小曲中優(yōu)良菌種再添加到大曲中進行發(fā)酵釀酒進而調(diào)控酒中高級醇含量。

隨著發(fā)酵時間的變化，小曲在山西粳高粱汁中發(fā)酵2 d時達到峰值后總高級醇含量呈持續(xù)遞減趨勢，到發(fā)酵5 d時總高級醇含量升高后繼續(xù)下降，而在東北粳高粱汁中發(fā)酵時總高級醇含量呈遞減趨勢，東北粳高粱發(fā)酵1 d所產(chǎn)高級醇含量比山西粳高粱高3.5倍，總高級醇含量相差最大。

曲料比的不同對高級醇含量有一定的影響，實驗發(fā)現(xiàn)曲料比為4%時3種高級醇的含量最高，曲料比在2%時產(chǎn)高級醇含量最少，曲料比在6%、8%、10%時3種高級醇的總含量相差不大，而曲料比在2%時所產(chǎn)的3種高級醇含量的總和比曲料比在4%時低98.4%。

與大曲單獨發(fā)酵時相比，大曲和米曲霉Q-1共同發(fā)酵、大曲和釀酒酵母N-1共同發(fā)酵時，產(chǎn)高級醇的量有所增加；大曲和異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵，大曲與釀酒酵母N-1、異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵的高級醇產(chǎn)量降低。米曲霉Q-1、釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1共同發(fā)酵時與釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1混合發(fā)酵時相比高級醇產(chǎn)量沒有顯著變化，說明米曲霉Q-1對2種酵母混合發(fā)酵產(chǎn)高級醇沒有顯著影響。米曲霉Q-1產(chǎn)生的蛋白酶對大曲和釀酒酵母N-1和異常威克漢姆酵母J-1發(fā)酵利用氨基酸產(chǎn)異戊醇和異丁醇起到了促進作用。