靈芝雙向發(fā)酵液凍干粉抑制環(huán)氧化酶-2及抗氧化活性的研究

張影，孟憲瑤，李忠峰，楊云麗，郭苗苗，李麗*，周衛(wèi)強

1(北京工商大學 化學與材料工程學院，北京，100048)2(北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室，北京，100048)3(戰(zhàn)略支援部隊興城特勤療養(yǎng)中心，遼寧 興城，125105)4(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京，102209)

靈芝(Ganodermalucidum)又被稱為“仙草”、“瑞草”、“還陽草”等，在《神農本草經》還被稱為“神芝”[1]，為多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬 (Ganoderma)真菌[2]。作為我國藥食兩用傳統(tǒng)珍貴中藥，靈芝具有很高的藥用價值[3]。靈芝化學成分復雜，其中的活性成分主要為靈芝多糖、靈芝多肽、靈芝三萜類化合物、蛋白質、氨基酸等[4-5]，具有清除自由基、抗炎[6]、抗過敏、保濕、延緩皮膚衰老、祛斑美白等功效[7-9]。

來源于子實體的靈芝原料成本普遍較高，產品質量不穩(wěn)定[7,10]，將靈芝的菌絲體接種于液體培養(yǎng)基中，以一定轉速和溫度進行培養(yǎng)，菌絲體在培養(yǎng)基中獲得合成代謝產物或生長繁殖所需營養(yǎng)物質的培養(yǎng)方式稱為靈芝液體深層發(fā)酵培養(yǎng)。液體深層發(fā)酵技術因其生產周期短、效率高、產量大、品質穩(wěn)定，已經成為開發(fā)利用靈芝資源的重要途徑[11-13]。添加人參等藥材進行靈芝液體深層發(fā)酵，既為菌絲體提供大量營養(yǎng)活性成分，同時其藥效成分又可被菌絲體產生的酶催化產生大量新的活性物質[14]。利用真空冷凍干燥技術將發(fā)酵液制備成凍干粉，通過降低水分含量以實現(xiàn)對發(fā)酵液營養(yǎng)物質的保存，從而適當延長存儲時間，有利于運輸。

本研究利用液體深層發(fā)酵技術對靈芝進行培養(yǎng)，通過添加玉竹、樺樹茸、人參及三七藥材粉末，制備靈芝以及靈芝與上述藥材的發(fā)酵液凍干粉，采用顯色法結合紫外分光光度法測定發(fā)酵液凍干粉總糖、總皂苷及總多肽的含量。為篩選出靈芝雙向發(fā)酵液凍干粉抗氧化及抗炎效果最優(yōu)的組合方式，測定各發(fā)酵液凍干粉對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力及對環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase，COX-2)的抑制能力，COX-2是誘導型酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，是將花生四烯酸轉化為前列腺素的關鍵酶。COX-2在正常組織表達量極低，在炎癥、疼痛及腫瘤等刺激下可顯著表達，因此可作為藥物抗炎效果的指標[15]。通過以上實驗，評價靈芝雙向發(fā)酵體外抗氧化及抗炎活性，進而篩選出最優(yōu)的抗氧化、抗炎發(fā)酵組合方式，為進一步研究發(fā)酵液各個成分含量與其活性的關系奠定基礎，也為靈芝雙向發(fā)酵工業(yè)化生產提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝[Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Kars]CICC 14024，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.)Druc]，中國北京同仁堂有限責任公司；樺樹茸(Inonotusobliquus)、人參(PanaxginsengC.A.Mey.)、三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]，河北安國東方藥城。

葡萄糖、CuSO4，佛山西隴化工有限公司；苯酚、HClO4、濃硫酸，國藥集團化學試劑有限公司；人參皂苷Re、香蘭素，上海源葉生物科技有限公司；NaOH，上海麥克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；COX-2抑制劑篩選試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；冰乙酸、三氯乙酸、酒石酸鉀鈉、乙醇，天津福晨化學試劑有限公司；ABTS，Biotopped公司；DPPH，梯希愛化成工業(yè)；K2S2O8，西隴化工股份有限公司；抗壞血酸(99%)，北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；KYC-100B搖床，上海福馬實驗設備有限公司；Epoch酶標儀，美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液凍干粉制備工藝

發(fā)酵基礎培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖35、蛋白胨5、酵母粉2.5、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、維生素B10.05。

在S1～S5發(fā)酵罐中加入發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，然后在S2、S3、S4、S5發(fā)酵罐中分別加入玉竹、樺樹茸、人參及三七藥材粉末10 g/L，121 ℃，滅菌20 min，按照10%(體積分數)的接種量接種，在28 ℃，150 r/min的搖床中發(fā)酵7 d后，超聲波30 min后滅菌處理，4 ℃冰箱中靜置1～2 d，抽濾，收集濾液，制備靈芝(S1)、靈芝-玉竹(S2)、靈芝-樺樹茸(S3)、靈芝-人參(S4)以及靈芝-三七(S5)發(fā)酵液凍干粉。

1.3.2 總糖含量檢測[16]

葡萄糖標準曲線的制作：準確稱取標準葡萄糖50 mg，加蒸餾水定容至50 mL的容量瓶中，混勻，再從中吸取2.0 mL于8.0 mL蒸餾水中稀釋，混合均勻后得到質量濃度為0.2 mg/mL的標準葡萄糖溶液。分別準確吸取標準葡萄糖溶液50、100、200、300、400、500 μL并補水至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%(體積分數，下同)苯酚，混勻，再加入5.0 mL濃硫酸混勻，放入沸水浴中反應30 min，反應結束后，放入冷水中冷卻至室溫，在490 nm處用酶標儀測量其吸光度值，以吸光度(Y)為縱坐標，葡萄糖濃度(X)為橫坐標，建立回歸方程。

樣品總糖含量的測定：吸取樣品S1～S5溶液(0.05 mg/mL)2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚，混勻，再加入5.0 mL濃硫酸混勻，放入沸水浴中反應30 min，反應結束后，放入冷水中冷卻至室溫，在490 nm處用酶標儀測量其吸光度值，根據葡萄糖標準溶液曲線計算其總糖含量。

1.3.3 總皂苷含量檢測[17]

人參皂苷Re標準曲線的制作：分別吸取人參皂苷Re標準溶液(2.0 mg/mL)25、50、100、150、200 μL，置于60 ℃水浴揮干。在已揮干的蒸發(fā)皿中準確加入0.2 mL 5%(體積分數，下同)香草醛冰乙酸溶液，使蒸發(fā)皿上的殘渣全部溶解，再加入0.8 mL HClO4，混勻后加入到10 mL的離心管中，60 ℃水浴10 min，取出，用涼水冷卻后，準確加入冰乙酸5.0 mL，于560 nm波長處用酶標儀進行測定，以吸光度(Y)為縱坐標，人參皂苷Re濃度(X)為橫坐標，建立回歸方程。

樣品總皂苷的測定：準確吸取樣品S1～S5溶液(10 mg/mL)各400 μL，置于60 ℃水浴揮干，在已揮干的蒸發(fā)皿中準確加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，使蒸發(fā)皿上的殘渣全部溶解，再加入0.8 mL HClO4，混勻后加入到10 mL的離心管中，60 ℃水浴10 min，取出，用涼水冷卻后，準確加入冰乙酸5.0 mL，于560 nm波長處用酶標儀進行測定。根據人參皂苷Re標準溶液曲線計算皂苷含量。

1.3.4 總多肽含量檢測[18]

雙縮脲試劑：試劑A：0.15 g CuSO4、0.60 g酒石酸鉀鈉、50 mL蒸餾水混合均勻；試劑B：30 mL 100 g/L NaOH溶液(使用時將A與B混勻)。

牛血清白蛋白標準曲線制作：配制適量10 mg/mL牛血清白蛋白溶液，分別取50、100、200、300、400、500 μL于離心管中，補水至1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，室溫反應30 min，540 nm處測其吸光度，制作標準曲線。

樣品溶液的測定：取樣品S1～S5溶液(10 mg/mL)1 mL于離心管中，加入1 mL 10%(體積分數)的三氯乙酸，離心，將蛋白沉淀下來，取1 mL上清液，加入4 mL雙縮脲試劑，室溫反應30 min，540 nm處測其吸光度，根據標準曲線計算樣品多肽含量。

1.3.5 DPPH自由基清除率檢測[19-20]

DPPH乙醇溶液的配制：稱取20 mg DPPH，加入無水乙醇溶解并定容于250 mL容量瓶中，DPPH濃度為2×10-4mol/L；0～4 ℃下避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用，4 h內有效；陽性對照選用維生素C(0.5 mg/mL)；陰性對照為蒸餾水。

樣品待測液的配制：樣品S1～S5分別配制成5個質量濃度：10、8、4、2、1 mg/mL

取1.0 mL的待測液與1.0 mL的2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液混勻(A管)；取1.0 mL的無水乙醇與1.0 mL的2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液混勻(B管)；取1.0 mL的無水乙醇與1.0 mL的待測液混勻(C管)。室溫反應30 min后，在517 nm下測A、B、C管吸光度值。DPPH自由基清除率按照公式(1)計算。

(1)

1.3.6 ABTS陽離子自由基清除率檢測[19,21]

主要試劑配制：儲備液1(7 mmol/L ABTS水溶液)：精密稱取0.038 41 g ABTS，溶解定容于10 mL水中；儲備液2(2.45 mmol/L K2S2O8水溶液)：精密稱取0.066 2 g K2S2O8，加蒸餾水溶解定容于100 mL容量瓶中；ABTS陽離子自由基工作液：將儲備液1和儲備液2等體積混合，低溫避光反應12～16 h，無水乙醇稀釋至OD734=0.7±0.02；陽性對照選用維生素C(0.5 mg/mL)。

樣品待測液的配制：樣品S1～S5分別配制成5個質量濃度：10、8、4、2、1 mg/mL。

用移液槍分別準確吸取0.2 mL不同濃度的待測液和0.8 mL ABTS陽離子自由基工作液，充分混勻后，在室溫條件下避光反應30 min，用酶標儀測定其在734 nm下的吸光值A；用0.2 mL蒸餾水代替待測溶液，其他條件不變，測定吸光值A0。ABTS陽離子自由基清除率按照公式(2)計算。

(2)

1.3.7 COX-2抑制率檢測

根據COX-2抑制劑篩選試劑盒的操作說明書進行測定。

1.4 分析方法

總糖、總皂苷、總多肽、COX-2、DPPH自由基及ABTS陽離子自由基清除率檢測實驗均設置3組平行，檢測結果采用Excel軟件作圖，SPSS 25軟件分析，采用T-test統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總糖含量檢測結果

葡萄糖標準曲線回歸方程為y=8.144 5x+0.087 2，R2=0.997 3，曲線擬合性較好，根據葡萄糖標準曲線計算得到樣品S1～S5中總糖的含量(圖1)，結果顯示，與S1相比，S2及S3的總糖含量極顯著降低(P<0.01)，S4總糖含量增加，S5總糖的含量極顯著升高(P<0.01)。

圖1 各組凍干粉總糖含量Fig.1 Total sugar content of lyophilized powder注：*表示與S1對比，P<0.05；**表示與S1對比，P<0.01(下同)

2.2 總皂苷含量檢測結果

人參皂苷Re標準曲線回歸方程為y=2.331 8x+0.025 2，R2=0.999 5，曲線擬合性較好，根據人參皂苷Re標準曲線計算得到樣品S1～S5中總皂苷的含量(圖2)，結果表明，與S1相比，S5中總皂苷的含量極顯著下降(P<0.01)，S2、S3及S4的總皂苷含量極顯著升高(P<0.01)，其中，S2中總皂苷的含量最高，是S1總皂苷含量的1.26倍。

圖2 各組凍干粉總皂苷含量Fig.2 Total saponin content of lyophilized powder

2.3 總多肽含量檢測結果

牛血清白蛋白標準曲線回歸方程為y=0.031 4x+0.117 5，R2=0.999 3，曲線擬合性較好，根據牛血清白蛋白標準曲線計算得到樣品S1～S5中多肽的含量(圖3)。與S1相比，S5中總多肽含量降低，S4中總多肽含量極顯著降低(P<0.01)，S2及S3中總多肽含量升高，其中S2中總多肽含量顯著升高(P<0.05)，是S1總多肽含量的1.27倍。

圖3 各組凍干粉總多肽含量Fig.3 Total polypeptide content of lyophilized powder

2.4 DPPH自由基清除率檢測結果

陽性對照維生素C(0.5 mg/mL)的DPPH自由基清除率為95.01%，陰性對照蒸餾水的DPPH自由基清除率為1.48%，說明實驗結果具有一定的可信度及參考價值。

如圖4所示，隨著樣品S1～S5濃度的降低，其DPPH自由基清除能力也逐漸降低，其中S2降低的幅度最小，且S2在其相應濃度的DPPH自由基清除能力都強于其他樣品，因此相比于S1及其他樣品，S2清除DPPH自由基的能力最強。

圖4 各組凍干粉DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH free radical scavenging rate trend of lyophilized powder

2.5 ABTS陽離子自由基清除率檢測結果

陽性對照維生素C(0.5 mg/mL)的ABTS陽離子自由基清除率為92.28%，陰性對照蒸餾水的ABTS陽離子自由基清除率為-4.53%，說明實驗結果具有一定的可信度及參考價值。

如圖5所示，除S2外，樣品S1、S3、S4及S5 ABTS陽離子自由基清除能力都有隨著濃度的降低而降低的趨勢，相比于S1，S2在各個濃度都有著穩(wěn)定且較強的ABTS陽離子自由基清除能力，因此，綜合來說S2 對ABTS陽離子自由基的清除效果最好。

圖5 各組凍干粉ABTS陽離子自由基清除率Fig.5 ABTS cation free radical scavenging rate trend of lyophilized powder

2.6 COX-2抑制率檢測結果

陽性對照Celecoxib溶液(1 μmol/L)的COX-2抑制率為63.92%，說明實驗結果具有一定的參考價值。如圖6所示，與S1及其他樣品相比，S2在其相應濃度的COX-2抑制能力都強于其他樣品，且隨著濃度的降低，S2的COX-2抑制能力降低幅度較小，有著穩(wěn)定且較強的COX-2抑制能力。因此，相比于S1來說，S2的COX-2抑制能力最強。

圖6 各組凍干粉COX-2抑制率Fig.6 COX-2 inhibition rate trend of lyophilized powder

3 討論與展望

研究結果發(fā)現(xiàn)，相比于靈芝發(fā)酵液凍干粉，靈芝-玉竹發(fā)酵液凍干粉中總皂苷及總多肽的含量顯著升高(P<0.05)，其總皂苷及總多肽的含量分別為靈芝發(fā)酵液凍干粉的1.26、1.27倍。并且靈芝-玉竹發(fā)酵液凍干粉抗氧化及抑制COX-2的活性最強，其可能與總皂苷以及總多肽的含量的提高有關，靈芝-玉竹發(fā)酵液凍干粉較強的COX-2抑制能力說明其可能存在較好的抗炎效果。因此添加了玉竹的靈芝發(fā)酵組合是符合預期的最優(yōu)發(fā)酵組合方式，這為后續(xù)進一步研究靈芝-玉竹發(fā)酵液中各個成分含量與其活性的關系奠定了基礎，為研究開發(fā)抗氧化及抗炎的靈芝雙向發(fā)酵原料提供了新的思路，為靈芝雙向發(fā)酵的工業(yè)化生產提供了前提和基礎。

同時，本研究也存在一定的局限性，藥材-靈芝的雙向液體深層發(fā)酵與直接提取是不同的，藥材粉末主要作為培養(yǎng)基被靈芝真菌吸收和代謝，分泌到胞外的是經過靈芝真菌代謝后的成分。由于是胞外成分，所以靈芝中的主要三萜類成分并沒有被檢測到，因此本研究目前只能以總成分變化為主。