限氧發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸工程菌株及發(fā)酵過程優(yōu)化

王加初，伍法清，吳鶴云，謝希賢*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津，300457)

纈氨酸屬于支鏈氨基酸，具有促進哺乳動物乳腺細胞的發(fā)育、改善動物的免疫狀態(tài)及加快肌肉組織修復的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)[1-4]。目前工業(yè)上主要通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)纈氨酸，隨著纈氨酸市場需求的不斷增加，持續(xù)優(yōu)化生產(chǎn)菌株的發(fā)酵性能、開發(fā)更為經(jīng)濟高效的發(fā)酵工藝以提高纈氨酸的生產(chǎn)效率也日益引起研究者的關(guān)注。

近年來，通過誘變篩選和系統(tǒng)代謝工程的方法已經(jīng)獲得了幾種高產(chǎn)纈氨酸的谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌菌株，這些菌株的主要構(gòu)建策略包括解除反饋調(diào)控，增強關(guān)鍵酶表達，減弱競爭途徑，改善氧化還原平衡，促進產(chǎn)物外排等[5-8]。同大部分的氨基酸發(fā)酵過程相同，纈氨酸最初主要是通過好氧發(fā)酵獲得，但是好氧發(fā)酵過程中，相當多的物質(zhì)和能量會進入三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)用于細胞的生長，從而降低了底物的利用效率和產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率。厭氧條件下，TCA循環(huán)被阻斷，物質(zhì)和能量的消耗大幅降低，從而會提高底物的利用率與產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率，但是容易造成還原力循環(huán)不暢而使細胞代謝失衡[9-10]。為此研究者通過改變纈氨酸合成途徑輔因子的偏好性，促進還原力的平衡，使細胞能夠在厭氧條件下高效產(chǎn)酸[7]。然而，厭氧條件下由于糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas,EMP)途徑溢流以及還原TCA途經(jīng)的加強，會導致丙氨酸、乳酸、乙酸、琥珀酸等副產(chǎn)物的積累，并且由于ATP供應(yīng)不足等原因會導致菌體生長活力差[11-13]。為了解決這些問題，一方面可通過代謝工程的方法對其副產(chǎn)物合成途徑進行阻斷。如HASEGAWA等[14]通過敲除產(chǎn)纈氨酸谷氨酸棒桿菌中的ldhA、ppc基因有效地降低了乳酸和琥珀酸的積累；HAO等[8]通過敲除產(chǎn)纈氨酸大腸桿菌中的adhE、ldhA、pflB基因有效地阻斷了乙醇、乳酸和甲酸的合成。另一方面也可通過發(fā)酵過程控制，特別是溶氧條件的優(yōu)化降低副產(chǎn)物。STEINSIEK等[15]證實了胞內(nèi)副產(chǎn)物有機酸生成速率隨氧氣的增加而降低。ZOU等[16]在利用大腸桿菌產(chǎn)泛酸的過程中發(fā)現(xiàn)相比于厭氧發(fā)酵，微溶氧條件下有機酸的積累顯著降低。

課題組在前期的研究中，通過增強纈氨酸合成途徑和輸出系統(tǒng)，提高前體物供應(yīng)，同時將合成途徑的輔因子需求從NADPH改變?yōu)镹ADH，構(gòu)建了1株高產(chǎn)纈氨酸的大腸桿菌菌株VHY18，并開發(fā)了一種新型好氧-限氧雙階段發(fā)酵工藝，5 L罐上可生產(chǎn)84 g/L纈氨酸，轉(zhuǎn)化率達到了0.41 g/g葡萄糖，生產(chǎn)強度為2.33 g/(L·h)[8]。但該菌株在發(fā)酵過程中乙酸和琥珀酸大量積累，菌體生長活力明顯衰退，限制了發(fā)酵性能的進一步提升。針對這些問題，本研究首先通過基因敲除的方法阻斷了乙酸和琥珀酸的主要合成途徑，顯著減弱了乙酸和琥珀酸合成。接著，通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化進一步降低了琥珀酸和乙酸的積累量，并提升了菌株生長穩(wěn)定性及纈氨酸產(chǎn)率。最終所得菌株在優(yōu)化后的發(fā)酵工藝控制下，副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸的積累量降低至1.2和2.7 g/L，纈氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提升至90.4 g/L和0.53 g/g葡萄糖，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑

本研究所涉及的菌株及質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

引物均由蘇州金唯智科技有限公司合成；Primer STAR HS DNA聚合酶，大連寶生物科技有限公司；2×RapidTaqMix、ClonExpress?II One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、DNA凝膠純化回收試劑盒，美國Omega公司；其余生化試劑為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl 2.5，瓊脂25。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，酵母粉2，蛋白胨2，K2HPO47，(NH4)2SO43，檸檬酸1，MgSO4·7H2O 2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，MnSO40.01，維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12、維生素H各0.001。

1.3 基因敲除

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[17]對菌株mdh、poxB和ackA基因?qū)嵤┣贸婕暗囊锶绫?所示。具體步驟以mdh基因的敲除為例：通過primer 5設(shè)計mdh基因位點的上游同源臂引物(UP-mdh-S、UP-mdh-A)和下游同源臂引物(DN-mdh-S、DN-mdh-A)。以E.coliW3110基因組為模板通過PCR擴增獲得上下游同源臂片段，上述片段通過重疊PCR的方法融合，獲得用于mdh基因敲除的重組片段；構(gòu)建含有靶位點的pGRB-mdh質(zhì)粒：使用引物gRNA-mdh-S和gRNA-mdh-A退火制得包含PAM基因靶位點的片段，將其與線性化pGRB連接后化轉(zhuǎn)至E.coliDH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)，挑取陽性菌落得到pGRB-mdh質(zhì)粒；制備E.coliVHY19的感受態(tài)細胞，先將pREDCas9質(zhì)粒化轉(zhuǎn)至E.coliVHY19中后，再制備感受態(tài)同時將mdh重組片段和pGRB-mdh質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)至感受態(tài)細胞中，于32 ℃培養(yǎng)，待長出單菌落，經(jīng)菌落PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，再消除pGRB-mdh和pREDCas9質(zhì)粒，獲得菌株E.coliVHY20。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.4 雙階段發(fā)酵工藝

菌株經(jīng)兩代斜面培養(yǎng)活化后，用100 mL無菌水將菌體轉(zhuǎn)接至裝有2.4 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中控制pH值7.0，溫度35 ℃，發(fā)酵前期通過轉(zhuǎn)速和風量的調(diào)整控制相對溶氧值為25%～35%，待發(fā)酵至16 h將轉(zhuǎn)速調(diào)整為200 r/min并阻斷通風[8](工藝優(yōu)化過程詳見結(jié)果與分析)。當罐中的葡萄糖耗盡時，開始以一定的速率流加800 g/L的葡萄糖溶液，維持罐中葡萄糖質(zhì)量濃度在0.1～2 g/L。

1.5 檢測方法

利用分光光度計測定波長600 nm下發(fā)酵液的吸光度來檢測過程生物量；采用SBA-40E生物傳感器檢測發(fā)酵液中的葡萄糖濃度；采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中纈氨酸含量：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm，5-Micron)，樣品利用2,4-二硝基氟苯衍生，以體積分數(shù)50%的乙腈溶液和50 mmol/L的乙酸鈉水溶液進行梯度洗脫[18]，流速1 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫33 ℃；采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中有機酸含量：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)，檢測器為RID-20A示差檢測器，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫37 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

發(fā)酵數(shù)據(jù)代表3組平行發(fā)酵數(shù)據(jù)的平均值和標準差。利用T檢驗雙尾分布對2組發(fā)酵參數(shù)進行單向方差分析。*表示P<0.05，表示差異顯著；**表示P<0.01，表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

工程菌株VHY18是課題組前期構(gòu)建的可以在限氧條件下高產(chǎn)纈氨酸的工程菌株，但該菌株在發(fā)酵過程中會大量積累副產(chǎn)物乙酸(～12 g/L)和琥珀酸(～26 g/L)，并且在限氧發(fā)酵階段生長活力會顯著降低，從而限制了菌株的纈氨酸發(fā)酵性能。為解決該問題，本研究對VHY18進行代謝工程改造并對發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。

2.1 阻斷乙酸和琥珀酸合成途徑

2.1.1ackA和poxB基因敲除對纈氨酸發(fā)酵的影響

大腸桿菌合成乙酸的主要途徑有2條，一條是由丙酮酸氧化酶(poxB基因編碼)催化丙酮酸生成乙酸，另一條途徑是由磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta基因編碼)和乙酸激酶(ackA基因編碼)催化乙酰輔酶A生成乙酸，其中磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta基因編碼)的阻斷會限制乙酰磷酸的生成，對細胞生長有較大的的影響[19-20]。為此本研究對VHY18中的poxB和ackA基因進行了單敲除和組合敲除，分別得到工程菌VHY18-1、VHY18-2和VHY19，并通過發(fā)酵罐發(fā)酵的方式考察了poxB和ackA基因單獨敲除與組合敲除對纈氨酸發(fā)酵的影響。VHY18、VHY18-1、VHY18-2和VHY19在5 L發(fā)酵罐上進行好氧-限氧雙階段發(fā)酵，菌體生長、纈氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累情況見圖1。

a-菌體生長曲線；b-纈氨酸產(chǎn)量曲線；c-副產(chǎn)物濃度圖1 VHY18、VHY18-1、VHY18-2和VHY19在5 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Fermentation results of the strain VHY18, VHY18-1, VHY18-2 and VHY19 in a 5 L bioreactor

發(fā)酵結(jié)果顯示，VHY18-1、VHY18-2和VHY19三株菌的菌體生長(圖1-a)和纈氨酸產(chǎn)量(圖1-b)與對照菌VHY18相比并無顯著差別，最終琥珀酸的積累量也相當(圖1-c)。至發(fā)酵結(jié)束時，VHY18-1、VHY18-2和VHY19發(fā)酵液中乙酸質(zhì)量濃度分別為10.4、9.1和6.7 g/L，較VHY18(11.9 g/L)分別降低了12.6%、23.5%和43.7%(圖1-c)，該結(jié)果顯示poxB和ackA基因的敲除均可降低乙酸濃度，特別是2個基因的組合敲除效果更佳，這與PARIMI等[21]在研究poxB、ackA基因敲除對影響副產(chǎn)物乙酸濃度的結(jié)果一致，說明poxB和ackA基因的敲除有效降低了乙酸的合成通量，從而使乙酸的積累量顯著降低。

2.1.2mdh基因敲除對纈氨酸發(fā)酵的影響

大腸桿菌在限氧過程中由前體物草酰乙酸經(jīng)3步反應(yīng)合成琥珀酸，其中蘋果酸脫氫酶(mdh基因編碼)是第一步關(guān)鍵酶[22-23]。為降低琥珀酸的合成，本研究敲除了VHY19中的mdh基因，得到工程菌VHY20，并通過發(fā)酵罐發(fā)酵的方式考察了mdh基因敲除對纈氨酸發(fā)酵的影響。VHY19和VHY20在5 L發(fā)酵罐上進行好氧-限氧雙階段發(fā)酵，菌體生長、纈氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累情況見圖2。

a-菌體生長曲線；b-纈氨酸產(chǎn)量曲線；c-副產(chǎn)物濃度圖2 VHY20與VHY19在5 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Fermentation results of the strain VHY20 and VHY19 in a 5 L bioreactor

從2株菌的生長曲線對比來看(圖2-a)，VHY20生長速率較VHY19明顯降低，培養(yǎng)至16 h時VHY20的OD600為42.3，較VHY19(72)降低了41.2%，可能是mdh基因的敲除干擾了TCA循環(huán)，造成細胞生長代謝受阻。發(fā)酵結(jié)束時，2株菌發(fā)酵液中乙酸濃度沒有明顯差別，但VHY20的琥珀酸質(zhì)量濃度為12.1 g/L，較VHY19(24.4 g/L)降低了50.8%，該結(jié)果與KIM等[22]在研究不同蘋果酸脫氫酶活性對影響琥珀酸生成的結(jié)果一致，說明mdh基因的敲除有效降低了還原TCA循環(huán)的通量，從而使琥珀酸的積累量顯著降低。另外，由于mdh基因的敲除影響了菌體的生長，VHY20在好氧發(fā)酵階段(0～16 h)纈氨酸的產(chǎn)量(13.2 g/L)較VHY19(25.5 g/L)降低了48.2%(圖2-b)，但是因為競爭途徑減弱，更多的丙酮酸可以流向纈氨酸的合成，因此VHY20在限氧發(fā)酵階段(16～40 h)產(chǎn)酸能力加強，在該階段VHY20纈氨酸總的積累量為68.3 g/L，與對照菌(59.4 g/L)相比提高了14.9%，最終2株菌的纈氨酸產(chǎn)量相當。由于副產(chǎn)物琥珀酸積累量的大幅下降，VHY20的纈氨酸糖酸轉(zhuǎn)化率(0.41 g/g葡萄糖)較VHY19(0.39 g/g葡萄糖)也稍有提升?？傊?，通過敲除mdh基因雖使好氧發(fā)酵階段菌體的生長受阻，但大幅降低了限氧發(fā)酵階段琥珀酸的積累，提高了菌體纈氨酸生產(chǎn)性能。

前述通過3個基因的敲除部分阻斷了乙酸和琥珀酸的合成途徑，有效降低了2種副產(chǎn)物的積累。但發(fā)酵液中仍有較多乙酸和琥珀酸，然而完全阻斷乙酸和琥珀酸合成途徑可能會嚴重阻礙菌體生長[24-25]。有機酸的大量積累是菌體在限氧條件下的應(yīng)激反應(yīng)，許多研究證實改善溶氧條件可以有效降低限氧發(fā)酵過程中有機酸等副產(chǎn)物的積累[15]，并協(xié)調(diào)菌體生長與產(chǎn)物生產(chǎn)之間的代謝平衡[26]，為此，本研究繼續(xù)對VHY20在限氧條件下的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，以進一步降低副產(chǎn)物積累，促進纈氨酸生產(chǎn)。

2.2 發(fā)酵過程工藝的優(yōu)化

溶氧是協(xié)調(diào)限氧條件下菌體生長，產(chǎn)物合成和副產(chǎn)物積累的關(guān)鍵因素。而發(fā)酵液中的溶氧量和供氧條件(攪拌轉(zhuǎn)速、通風量等)、菌體濃度及活力以及底物葡萄糖的供應(yīng)息息相關(guān)。為此，本研究從限氧發(fā)酵過程中的供氧條件，溶氧條件轉(zhuǎn)換時機(決定最終菌體濃度)和葡萄糖流加速率3個方面對VHY20的發(fā)酵工藝進行了系統(tǒng)優(yōu)化。

2.2.1 限氧發(fā)酵階段供氧條件的優(yōu)化

最初的雙階段發(fā)酵工藝在菌體好氧培養(yǎng)到16 h后停止通入無菌空氣，并將轉(zhuǎn)速降至200 r/min，開始進行限氧發(fā)酵，過程中有機酸副產(chǎn)物積累，菌體活力衰退。本研究考慮適當提高第2階段發(fā)酵過程中的供氧量，以降低副產(chǎn)物的積累，并提升菌體生長活力。共設(shè)置了4種供氧條件：A1(轉(zhuǎn)速200 r/min、不通風)、A2(轉(zhuǎn)速400 r/min、通風量1 L/min)、A3(轉(zhuǎn)速400 r/min、通風量2 L/min)和A4(轉(zhuǎn)速500 r/min、通風量2 L/min)，其中條件A1為初始工藝，作為對照。4種控制工藝下，菌體生長、纈氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累情況見圖3。

a-菌體生長曲線；b-纈氨酸產(chǎn)量曲線；c-副產(chǎn)物濃度圖3 四種供氧控制工藝下VHY20在5 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Fermentation results of VHY20 in a 5 L bioreactor under the four processes

從圖3-a可知，初始工藝下，限氧發(fā)酵階段OD600值會持續(xù)下降，而提高該階段的供氧條件后(A2和A3)，后期OD600會逐漸趨于穩(wěn)定，進一步提高供氧條件為A4時，菌體表現(xiàn)出持續(xù)生長的趨勢，最終的OD600值(75.6)較初始工藝(31.5)提高了140%。從圖3-c可知，隨著限氧發(fā)酵階段供氧條件的提升，琥珀酸及乙酸濃度呈逐漸降低的趨勢，供氧條件設(shè)置為A4時，發(fā)酵液中最終的琥珀酸及乙酸質(zhì)量濃度分別為1.8和3.7 g/L，較初始工藝(A1，琥珀酸和乙酸濃度為11.5和7.3 g/L)分別降低了84.3%、49.3%。另外，相比于初始工藝，提高限氧發(fā)酵階段的供氧條件，纈氨酸產(chǎn)量也略有提升(圖3-b)，A2、A3和A4條件下，最終的纈氨酸的產(chǎn)量分別為82.5、85.1和86.3 g/L較初始工藝(A1，81.2 g/L)分別提高了1.6%、4.8%和6.3%。由于條件改變對菌體生長和副產(chǎn)物積累的顯著影響，最終的糖酸轉(zhuǎn)化率也發(fā)生了明顯變化。在A2、A3發(fā)酵條件下，最終的轉(zhuǎn)化率分別為0.44和0.46 g/g葡萄糖，相較初始工藝(A1，0.41 g/g葡萄糖)分別提高了7.3%和12.2%，但是在A4條件下，由于菌體會持續(xù)生長，消耗了更多的碳源，最終的轉(zhuǎn)化率只有0.39 g/g葡萄糖，相較于初始工藝降低了4.8%。總體來說，限氧發(fā)酵階段較佳的供氧條件為A3，該條件下琥珀酸及乙酸的濃度顯著降低，同時對菌株活力、纈氨酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率均有較大的促進作用，更有利于纈氨酸的高效生產(chǎn)。

2.2.2 供氧條件轉(zhuǎn)變時機的選擇

在相同的供氧條件下，菌體量的不同會造成發(fā)酵液中的溶氧環(huán)境的差異，進而影響菌體代謝。從前述研究結(jié)果可以看出，供氧條件轉(zhuǎn)換是影響最終菌體量的關(guān)鍵因素。因此本研究接著探究了雙階段發(fā)酵過程中，不同供氧條件轉(zhuǎn)換時機對VHY20發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸的影響。在好氧發(fā)酵分別進行至12 h(B1)、14 h(B2)、16 h(B3，初始工藝)和18 h(B4)時轉(zhuǎn)變?yōu)橄扪醢l(fā)酵，供氧條件設(shè)置為A3(轉(zhuǎn)速400 r/min，通風量2 L/min)，至發(fā)酵結(jié)束。在B1～B4四種控制工藝下，菌體生長、纈氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累情況見圖4。

a-菌體生長曲線；b-纈氨酸產(chǎn)量曲線；c-副產(chǎn)物濃度圖4 四種供氧控制工藝下VHY20在5 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Fermentation results of VHY20 in a 5 L bioreactor under the four processes

從圖4-a可知，在好氧發(fā)酵轉(zhuǎn)為限氧發(fā)酵后，菌體生長即趨于穩(wěn)定，并且隨著供氧條件轉(zhuǎn)換時間的后延，最終的菌體量也逐漸提升。提前進行條件轉(zhuǎn)換，會降低副產(chǎn)物，如在B1工藝下，最終乙酸和琥珀酸的質(zhì)量濃度分別降低至1.1和2.5 g/L(圖4-c)，可能原因在于提前轉(zhuǎn)變供氧條件使得最終菌體量大幅降低，限氧發(fā)酵階段的相對溶氧提高。在B2、B3和B4工藝控制下，纈氨酸的最終產(chǎn)量分別為86.1、86.5和87.7 g/L，相差不大，但在B1工藝由于菌體量的大幅降低，纈氨酸的生產(chǎn)效率也顯著下降，最終的纈氨酸產(chǎn)量只有73.3 g/L(圖4-b)。由于最終菌體量差異明顯，不同工藝的葡萄糖消耗量變化較大，最終導致糖酸轉(zhuǎn)化率的不同。B1～B4四種工藝最終的糖酸轉(zhuǎn)化率為0.50、0.48、0.46和0.42 g/g葡萄糖。綜合看來，在B2工藝下可取得最佳纈氨酸發(fā)酵指標，該工藝下纈氨酸的產(chǎn)量為86.5 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.48 g/g葡萄糖，琥珀酸和乙酸的積累量分別為1.5和3.1 g/L。

2.2.3 補糖速率的優(yōu)化

常規(guī)的大腸桿菌發(fā)酵過程通常會通過葡萄糖流加速率的控制使發(fā)酵液處于“零殘?zhí)恰睜顟B(tài)，葡萄糖的供給量會直接影響菌體的代謝通量分布[27]。為了確定合適的葡萄糖供給量，本研究探究了限氧發(fā)酵階段中葡萄糖流加速率對纈氨酸發(fā)酵的影響。在前面優(yōu)化的發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，將限氧發(fā)酵階段的葡萄糖流加速率分別控制在20、25和30 g/h(對應(yīng)工藝分別記為C1、C2和C3)，3種控制工藝下，菌體生長、纈氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累情況見圖5。

a-菌體生長曲線；b-纈氨酸產(chǎn)量曲線；c-副產(chǎn)物濃度圖5 三種葡萄糖流加控制工藝下VHY20在5 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Fermentation results of VHY20 in a 5 L bioreactor under the three processes

從圖5-a可知，在實驗范圍內(nèi)，盡管補糖速率差異較大，但是對菌體的生長基本無影響。然而不同的補糖速率對纈氨酸的產(chǎn)量產(chǎn)生了顯著影響(圖5-b)，C1、C2和C3工藝下，最終纈氨酸的產(chǎn)量分別為75.1、90.4和94.5 g/L，說明隨著補糖量的提高，纈氨酸的產(chǎn)量也逐漸提升。副產(chǎn)物乙酸和琥珀酸質(zhì)量濃度也會隨著補糖量的增加而增加(圖5-c)，這是因為較高的葡萄糖供應(yīng)加強了糖酵解途徑，并且較高的葡萄糖供應(yīng)導致相對溶氧的降低，進而造成代謝溢流從而促進了副產(chǎn)物的合成。另外，由于纈氨酸產(chǎn)量、副產(chǎn)物濃度的顯著變化，導致3種工藝的糖酸轉(zhuǎn)化率的差異，C1、C2和C3三種工藝最終的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為0.54、0.53和0.48 g/g葡萄糖。綜合指標來看，較佳的補糖速率應(yīng)控制在25 g/h，纈氨酸的產(chǎn)量為90.4 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.53 g/g葡萄糖，副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸的積累量分別為1.2和2.7 g/L。

3 結(jié)論

為了解決工程菌株VHY18在限氧發(fā)酵過程中大量積累乙酸和琥珀酸以及菌株生長活力明顯衰退等問題，本研究對VHY18菌株進行了代謝工程改造并對配套的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。為了降低乙酸的合成，敲除了乙酸合成關(guān)鍵酶丙酮酸氧化酶和乙酸激酶的編碼基因poxB和ackA；為了降低琥珀酸的合成，敲除了蘋果酸脫氫酶的編碼基因mdh。最終獲得VHY20菌株，乙酸和琥珀酸的積累量分別降低了43.7%和50.8%。為進一步降低副產(chǎn)物積累、提高纈氨酸發(fā)酵水平，本研究從限氧發(fā)酵階段的供氧條件、雙階段發(fā)酵的轉(zhuǎn)變時機以及葡萄糖流加速率3個方面對發(fā)酵工藝進行了系統(tǒng)的優(yōu)化。最終，確立的工藝為：發(fā)酵開始時先進行好氧發(fā)酵，14 h后將好氧發(fā)酵轉(zhuǎn)換至限氧發(fā)酵，并將供氧條件設(shè)置為攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min、風量2 L/min，補糖速率控制在25 g/h。工程菌VHY20在該發(fā)酵工藝下發(fā)酵48 h，可生產(chǎn)90.5 g/L纈氨酸，轉(zhuǎn)化率為0.53 g/g葡萄糖，副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸分別為1.2 和2.7 g/L。與原有菌株及發(fā)酵工藝相比，工程菌VHY19產(chǎn)酸提高了7.8%，轉(zhuǎn)化率提高了30.5%，副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸分別降低了95.4%、76.9%，效果顯著。本研究提供的限氧發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸工藝具有較好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。純厭氧發(fā)酵生產(chǎn)纈氨酸目前已經(jīng)引起了研究者的濃厚興趣，下一步研究可通過適應(yīng)性實驗室進化的方法提高菌株對厭氧環(huán)境的適應(yīng)性，以進一步提高菌株纈氨酸的生產(chǎn)性能，并實現(xiàn)純厭氧發(fā)酵高效生產(chǎn)纈氨酸，從而降低生產(chǎn)成本，推動纈氨酸的高效綠色生產(chǎn)進程。