纖維微菌β-1,3-葡聚糖酶的克隆表達及對靈芝細胞壁的水解作用

楊夢蓮，單逸藍，沈微*，朱新文，楊海泉，陳獻忠，陳磊，夏媛媛

1(江南大學 生物工程學院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(山東省東阿縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 聊城，252200)

硒是人體必須的微量元素之一，是人體多種含硒蛋白的組成成分[1]。硒元素也被證實具有抗氧化、提高機體免疫力、養(yǎng)肝護肝、預(yù)防心腦血管疾病等生理功能[2-3]。硒元素在地球上分布不均勻。我國地域遼闊，環(huán)境多樣，富硒和缺硒地區(qū)并存，但全國范圍來講，我國是缺硒范圍廣、程度嚴重的國家之一[4]。無機硒元素被生物體吸收后形成有機硒，有機硒更容易被人體吸收，具有更高的安全性[3,5]。

靈芝是我國醫(yī)藥和食療寶庫中的珍品，以靈芝為富硒載體，將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，獲得的富硒靈芝有可能實現(xiàn)硒和靈芝固有生理作用的結(jié)合[6]。國內(nèi)外科研工作者對靈芝富硒進行了大量的研究[7-9]。富硒靈芝不單是硒元素的補充劑，部分含硒生物分子還具有特殊的生理功能[9]。一些靈芝硒多糖具有明顯的抗腫瘤或誘導(dǎo)癌細胞凋亡的作用[10-12]，而一些含硒多肽則具有較強的抗氧化功能[1,13]。

富硒靈芝中的有機硒以蛋白硒、多糖硒、核酸硒等多種形式存在，其中蛋白硒是有機硒分子的主要存在形式[14]。蛋白質(zhì)和核酸大多存在于靈芝的細胞內(nèi)，也有一部分多糖存在于細胞內(nèi)[14-15]。因此為獲取目標產(chǎn)物需對靈芝細胞壁進行破碎。超聲波破碎法原則上適用于各種生物細胞的破碎，但用超聲波方法破碎大型真菌的菌絲體細胞一般需要相當長的時間而且蛋白得率較低，在工業(yè)化生產(chǎn)時有很大的困難。在各種細胞破壁方法中，酶解法具有條件溫和、操作方便、提取效率高等優(yōu)點[16]。

到目前為止，有關(guān)靈芝菌絲體細胞壁酶解的研究報道較少。用于靈芝菌絲體破壁的酶有酵母溶壁酶、蝸牛酶等，這些酶處理靈芝菌絲體可以獲得一定量的原生質(zhì)體，但這些酶目前僅作為科研試劑使用，價格昂貴，不具備工業(yè)化應(yīng)用的條件。本文作者在前期工作中對實驗室保藏的微生物進行篩選，發(fā)現(xiàn)1株纖維微菌(Cellulosimicrobiumsp.)的發(fā)酵液與少量靈芝菌絲體混合后可以獲得原生質(zhì)體。進一步發(fā)現(xiàn)，這株菌的β-1,3-葡聚糖酶基因的表達產(chǎn)物與市售果膠酶聯(lián)合處理靈芝菌絲體可以獲得原生質(zhì)體，進一步輔以短時超聲波處理可以有效實現(xiàn)靈芝菌絲體細胞的破碎。本文報道該基因的克隆表達及其與果膠酶聯(lián)合使用提取靈芝胞內(nèi)蛋白的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

表達宿主菌大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)、表達載體pET-28a(+)為本課題組保藏；纖維微菌(Cellulosimicrobiumsp.)CICIM B6906，中國高校工業(yè)微生物資源平臺，簡稱纖維微菌6906；靈芝(Ganodermalucidum)ML2613已分別保藏在中國高校工業(yè)微生物資源平臺(CICIM F7083)和中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC No:M 20211217)。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、連接酶，賽默飛世爾科技公司；質(zhì)粒提取和DNA片段回收試劑盒，蘇州康寧生物科技有限公司；DL10000 DNA Marker，寶生物(大連)生物工程公司；蛋白標準分子量，翌圣生物科技有限公司；茯苓多糖、酵母葡聚糖、大麥葡聚糖、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose, CMC)熱凝膠，MegaZyme公司；熱凝膠、昆布多糖、微晶纖維素等，上海源葉生物技術(shù)公司；果膠酶等酶制劑，南寧龐博生物工程有限公司；His-Trap HP 1 mL親和層析柱，美國GE公司；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基的配制

LB和TB培養(yǎng)基配方按文獻[17]的方法配制。

重組大腸桿菌分批補料發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉30，蛋白胨15，甘油10 mL/L，KH2PO42.31，K2HPO4·H2O 16.43，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，硫胺素0.02。121 ℃，實罐滅菌15 min。滅菌后1 L培養(yǎng)基中加入微量元素溶液0.05 mL。

微量元素溶液(g/L)：FeSO4·7H2O 2，ZnSO4·7H2O 0.4，CuSO4·5H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.1，Na2B4O7·10H2O 0.04，(NH4)6Mo7O240.02。溶解后用無菌過濾器過濾除菌。

補料培養(yǎng)基(g/L)：甘油500 mL/L，MgSO4·7H2O 0.3，酵母粉50，蛋白胨50。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L)：乳糖200。

靈芝種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，麥芽汁粉20。

靈芝搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，KH2PO40.2，尿素0.1，麥芽汁粉20，酵母粉5。發(fā)酵至24 h后加入Na2SeO3·5H2O至180 mg/L。

靈芝發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40，KH2PO40.2，(NH4)2SO42，CaCl20.1，MgCl20.05，麥芽汁粉10，酵母粉5。115 ℃，滅菌15 min。發(fā)酵24 h后加入Na2SeO3·5H2O至180 mg/L。發(fā)酵過程用100 g/L NaOH溶液控制pH 4.5～5.0。

1.1.4 引物

根據(jù)菌種鑒定結(jié)果，纖維微菌6906的16S rDNA基因序列與NCBI公布的纖維微菌JZ28的最為接近，而JZ28的基因組序列(NCBI登錄號：CP017660.1)中有一段與β-1,3-葡聚糖酶有較高相似性的序列(上述基因組序列中231 041～232 687堿基之間的片段)，根據(jù)該序列設(shè)計引物如下：

Pgl101：5′-aatcggatcctaaatacttaaggaggattcttatgcctcacgacagg-3′

Pgl102：5′-aatcaagcttgagcgtccagcgct-3′

Pgl101帶單下劃線部分為翻譯終止密碼子，用于終止載體pET-28a(+)多克隆位點上游開始的包含His-tag在內(nèi)的短肽的翻譯。雙下劃線部分為SD序列和翻譯起始密碼子，從atg往后14個堿基與所預(yù)測的葡聚糖酶基因序列一致，以上結(jié)構(gòu)控制以載體T7啟動子起始轉(zhuǎn)錄的mRNA從葡聚糖酶基因的ATG開始獨立翻譯。引物Pgl102與所預(yù)測葡聚糖酶基因的3′端互補，但刪去了翻譯終止密碼子tag，由此控制所插入葡聚糖酶基因的翻譯能延續(xù)到載體多克隆位點下游的His-tag標簽的編碼區(qū)，便于表達產(chǎn)物的純化。2條引物分別帶有內(nèi)切酶BamH I、Hind III識別位點。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-1,3-葡聚糖酶重組表達載體的構(gòu)建

提取纖維微菌6906基因組DNA，以基因組DNA為模板，以Pgl101、Pgl102為引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用BamH I和Hind III酶切，純化后與經(jīng)同樣酶切的載體pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂布含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，任取幾個轉(zhuǎn)化子進行液體培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進行酶切驗證和測序。驗證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化表達宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)。

1.2.2 重組β-1,3-葡聚糖酶的表達及產(chǎn)物的分析

將重組菌株在卡那霉素50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上劃線，挑取單菌落接種至含卡那霉素50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后，按1%(體積分數(shù))接種量接入到50 μg/mL卡那霉素的TB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌體密度OD600達到0.6左右，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于30 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液7 000 r/min離心10 min。其中上清液作為胞外粗酶液直接檢測酶活力。沉淀部分加入與發(fā)酵液等體積的磷酸緩沖液懸浮菌體后超聲波破碎檢測酶活力，方法同文獻[17]。胞外粗酶液蛋白電泳前先用離心式超濾濃縮管(30KD/UFC900396，Millipore)按產(chǎn)品說明書進行濃縮，一般是濃縮至1/10體積。

1.2.3 重組β-1,3-葡聚糖酶的純化及酶活力測定

重組酶的C-端帶有His-tag標簽，所以采用鎳柱進行親和層析純化，具體純化方法如下：取胞外粗酶液5 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，用含有0.5 mol/L NaCl和0.02 mol/L咪唑的Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.4)作為上樣緩沖液，用含0.5 mol/L咪唑和0.5 mol/L NaCl的Na2HPO4- NaH2PO4緩沖液作為洗脫液，梯度洗脫，流速為1 mL/min。SDS-PAGE分析純化結(jié)果，用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，計算比酶活力，方法同文獻[17]。

采用DNS法測定β-1,3-葡聚糖酶的活力。取50 μL適當稀釋的酶液，加入100 μL 15 g/L的茯苓多糖(由0.1 mol/L檸檬酸與0.2 mol/L Na2HPO4構(gòu)成的緩沖液配制，pH 5.5)，用緩沖液將其定容到500 μL，50 ℃下反應(yīng)15 min，加入750 μL DNS試劑，沸水浴煮10 min，在540 nm下測定吸光度。根據(jù)葡萄糖標準曲線計算還原糖生成量。酶活力定義：將每分鐘水解茯苓多糖產(chǎn)生的還原糖，其還原力相當于1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為β-1,3-葡聚糖酶的1個酶活力單位(U)。

1.2.4 重組β-1,3-葡聚糖酶酶學性質(zhì)的測定

重組酶最適溫度的測定：分別在30～65 ℃內(nèi)間隔5 ℃測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

重組酶最適pH的測定：在pH為3.5～8.5的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，測定酶活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

重組酶熱穩(wěn)定性的測定：將酶液置于40、45、50、55 ℃金屬浴中保溫3 h，分別測定保溫0.5、1、1.5、2、2.5、3 h后的酶活力，以未處理的酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.2.5 重組酶對不同底物特異性研究

分別以15 g/L的大麥葡聚糖、茯苓多糖、熱凝膠、酵母葡聚糖、昆布多糖、地衣多糖和微晶纖維素等為底物，在最適條件下測定重組酶的活力，分析重組酶對不同底物的水解能力。

1.2.6 重組β-1,3-葡聚糖酶的發(fā)酵

取重組菌單菌落接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接于新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600≈1，用作種子培養(yǎng)液。15 L發(fā)酵罐中預(yù)先加入10 L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，并實罐滅菌。滅菌后降溫至37 ℃，控制通氣量12 L/min，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速控制在250 r/min，校正溶氧量為100%，適當補充體積分數(shù)25%氨水控制發(fā)酵pH在6.5～7.0。以2%(體積分數(shù))的接種量接入種子培養(yǎng)液，同時加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素，發(fā)酵過程偶聯(lián)轉(zhuǎn)速使溶氧維持在20%～30%。培養(yǎng)至發(fā)酵罐中的溶氧濃度持續(xù)上升時(即甘油耗盡時)，開始以25 mL/h的速度流加補料培養(yǎng)基，并繼續(xù)偶聯(lián)轉(zhuǎn)速使溶氧維持在20%～30%，始終以25%氨水控制發(fā)酵pH在6.5～7.0。發(fā)酵至32 h，發(fā)酵液OD600約為100時加入乳糖至終質(zhì)量濃度為5 g/L進行誘導(dǎo)表達。當發(fā)酵液中的胞外酶活力不再明顯增加時，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液離心后取上清液進行超濾濃縮。使用UF101小型超濾機，超濾膜為PES30-1512，截留分子質(zhì)量30 kDa(上海福立特實業(yè)有限公司產(chǎn)品)，超濾壓力控制在(0.1±0.01) MPa。

1.2.7 靈芝菌絲體發(fā)酵與菌體的裂解

將靈芝ML2613的菌絲體斜面培養(yǎng)物接種于靈芝種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)3 d，按10%(體積分數(shù))接種于5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為3 L，發(fā)酵24 h后加入180 mg/L的Na2SeO3·5H2O，培養(yǎng)5 d，過程中用50 g/L的NaOH調(diào)節(jié)pH在4.5～5.0。將培養(yǎng)后的菌絲體進行過濾，用于菌體破碎實驗。

靈芝菌絲體的酶解方法如下：取適量靈芝菌絲體，用緩沖液懸浮后加入酶液至適當濃度，在40 ℃反應(yīng)。對照實驗中，首先將所使用的酶液在90 ℃保溫20 min，將酶滅活，再按上述方法同樣進行菌絲體酶解。取等量的用酶處理過的靈芝菌絲體和按對照方法處理的靈芝菌絲體分別進行超聲波破碎，超聲波功率為300 W。超聲波破碎后采用堿提法提取裂解液蛋白質(zhì)。用1.0 mol/L NaOH溶液將料液pH調(diào)至10.0，浸提1 h，以促進蛋白質(zhì)在堿性條件下充分溶解，最后將料液7 000 r/min離心10 min，上清液為靈芝提取液。采用考馬斯亮藍法測定提取液中蛋白質(zhì)含量[17]。蛋白提取率的計算如公式(1)所示：

(1)

未經(jīng)處理的靈芝菌絲體按GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮法測定靈芝菌絲體總蛋白。

搖瓶實驗時以新華濾紙為介質(zhì)采用抽濾方法過濾收集菌體。發(fā)酵罐實驗時采用150型小型板框壓濾機(嘉興優(yōu)創(chuàng)機械設(shè)備有限公司)過濾收集菌體，濾布為510型(孔徑5～10 mm)丙綸濾布。

1.2.8 靈芝蛋白含硒量檢測

上述得到的提取液用HCl溶液調(diào)節(jié)至等電點使其沉淀，后續(xù)采用(NH4)2SO4鹽析沉淀進一步純化得到靈芝蛋白粉，方法同文獻[18]。蛋白粉按GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)測定富硒靈芝粗蛋白中的硒含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建

以纖維微菌6906的染色體DNA為模板，以Pgl101、Pgl102為引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物為1.7 kb左右，與推測的纖維微菌β-1,3-葡聚糖酶基因大小一致，該基因片段命名為bgl6906。以核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind III酶切上述目的片段，與經(jīng)同樣酶切的表達載體pET-28a(+)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，酶切驗證。結(jié)果表明，正確轉(zhuǎn)化子所含質(zhì)粒酶切后獲得5.2和1.7 kb的2個片段，與pET-28a(+)空質(zhì)粒和擴增片段bgl6906一致，圖1是正確轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒酶切電泳圖，該重組質(zhì)粒命名為pET28a-bgl6906。

M:DL10000 DNA marker;1:pET28a-bgl6906圖1 重組質(zhì)粒pET28a-bgl6906酶切圖譜Fig.1 Restriction analysis of the recombinant plasmid pET28a-bgl6906

重組質(zhì)粒測序并將序列NCBI進行序列搜索比對，結(jié)果顯示該序列的編碼區(qū)與NCBI核苷酸序列庫中收錄的纖維微菌Cellulosimicrobiumsp.JZ28基因組序列中的一段尚未標注的序列最為接近，兩者翻譯成氨基酸序列后同源性為98%。基因bgl6906編碼區(qū)全長1 644 bp，編碼1條含有548個氨基酸殘基，理論分子質(zhì)量為58 kDa的多肽鏈。用在線分析軟件SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/)分析顯示，上述多肽鏈N端有1段36個氨基酸殘基組成的信號肽，剩余的512氨基酸殘基的成熟肽分子質(zhì)量為54.4 kDa(不含6×His部分)。對Blast比對結(jié)果進行分析顯示，bgl6906基因編碼的蛋白序列與藤黃節(jié)桿菌(又名纖維素纖維微菌)的β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列[19]同源性為96%。上述藤黃節(jié)桿菌也是比對結(jié)果中，有表達產(chǎn)物酶學性質(zhì)報道的序列中與本文所克隆bgl6906最接近的基因。

2.2 重組β-1,3-葡聚糖酶的分泌表達及純化

將重組質(zhì)粒pET28a-bgl6906轉(zhuǎn)化表達宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，轉(zhuǎn)化子命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-bgl6906，簡寫為BL21/6906。將重組菌BL21/6906以及對照菌即pET-28a(+)空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子分別按1.2.2的方法表達制備粗酶液并檢測酶活力。結(jié)果顯示，對照菌細胞內(nèi)外均沒有酶活力。BL21/6906的細胞內(nèi)外均有明顯酶活力，其中發(fā)酵液上清液部分的酶活力大約為11 U/mL，而細胞破碎液酶活力大約為3 U/mL。從實驗結(jié)果看，bgl6906基因所編碼信號肽在大腸桿菌中也同樣具有引導(dǎo)重組蛋白向細胞外分泌的功能。由于bgl6906基因所編碼蛋白與藤黃節(jié)桿菌來源的β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列有明顯的差異，兩者的酶學性質(zhì)不一定完全相同，因此我們將上述轉(zhuǎn)化子的表達產(chǎn)物純化并對酶學性質(zhì)進行了分析。

蛋白純化結(jié)果如圖2所示。對比1、2泳道可見，與對照菌相比，BL21/6906在分子質(zhì)量55 kDa附近有一微弱的差異表達條帶，利用His標簽純化后在泳道3獲得純酶的單一條帶，泳道3純酶的條帶位置與上述1、2泳道的差異表達條帶分子質(zhì)量一致。測定純酶酶液的酶活力及蛋白濃度，經(jīng)過計算以茯苓多糖為底物時該重組蛋白的比酶活力為567.8 U/mg。為便于敘述，重組菌BL21/6906表達的重組酶命名為BGL6906。

M-蛋白標準分子量;1-BL21(DE3)/pET28a(+)胞外組分10倍濃縮液;2-BL21/6906胞外組分10倍濃縮液;3-BGL6906純酶圖2 重組菌株胞外蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of extracellular protein of the recombinants

2.3 重組酶BGL6906的酶學性質(zhì)

2.3.1 重組酶BGL6906的最適溫度和最適pH

在pH 5.5的緩沖液中，30～75 ℃測定BGL6906的相對酶活力，結(jié)果如圖3所示。BGL6906在35～50 ℃之間隨著溫度的提高，酶活力逐步提高，50 ℃為最適溫度，在45～55 ℃內(nèi)BGL6906的酶活力均在最高酶活力的80%以上。溫度超過60 ℃時酶活力迅速下降。

圖3 溫度對BGL6906酶活力的影響Fig.3 Effects of temperature on the activity of BGL6906

在50 ℃下，測定不同pH值的酶活力，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對重組酶BGL6906酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on the activity of the recombinant BGL6906

在pH 5.0～6.0內(nèi)，BGL6906酶活力均在最高酶活力的80%以上，5.5為最適pH值。pH低于5.0和超過7.0時，酶活力明顯下降。

2.3.2 重組酶BGL6906的熱穩(wěn)定性

將酶液置于45、50、55、60 ℃金屬浴中處理3 h，間隔0.5 h測定相對殘余酶活力，結(jié)果如圖5所示，45 ℃保溫處理3 h，殘余酶活力在70%以上；50 ℃保溫處理3 h，殘余酶活力在55%以上。溫度超過50 ℃，酶活力下降迅速，55 ℃保溫處理3 h，相對酶活力僅為11%。在60 ℃條件下，BGL6906在30 min后只剩下大約40%的酶活力，1.5 h后完全失活。

圖5 重組BGL6906的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermo-stability of the recombinant BGL6906

2.3.3 重組BGL6906的底物特異性

將重組酶分別與15 g/L的不同底物反應(yīng)，研究其對于不同底物的水解能力。結(jié)果如表1所示，BGL6906水解茯苓多糖的活力最高，比酶活力達到567.8 U/mg。BGL6906水解酵母葡聚糖、熱凝膠和昆布多糖的比活力約為86.2、23.04和16.1 U/mg。大麥葡聚糖、地衣多糖、CMC-熱凝膠為底物時，BGL6906均未表現(xiàn)出明顯的酶活力。BGL6906的底物特異性與纖維微菌屬來源的其他β-1,3-葡聚糖酶表現(xiàn)出相似的底物特異性[20]，即只對以β-1,3-糖苷鍵為主的葡聚糖表現(xiàn)出明顯的水解活性。

表1 重組酶BGL6906的底物特異性Table 1 Substrate specificity of recombinant BGL6906

2.4 重組菌BL21/6906發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果

按照1.2.6的補料發(fā)酵工藝進行15 L發(fā)酵罐發(fā)酵，結(jié)果如圖6所示。在發(fā)酵至32 h前，發(fā)酵液幾乎沒有酶活力，32 h時由于添加了誘導(dǎo)劑乳糖酶活力開始快速增長，但同時菌體增長速度快速下降。從蛋白電泳的情況看，胞外重組酶只占胞外蛋白的極少部分，因此基因表達對細胞營養(yǎng)物質(zhì)的消耗并不大，菌體生長快速下降的原因可能是重組酶對重組菌具有一些尚不明確的不利影響。在補料分批發(fā)酵條件下，重組菌最終胞外酶活力為67 U/mL左右，體積大約為11.5 L。為便于后續(xù)細胞裂解實驗，將發(fā)酵液離心去除細胞后用超濾機對酶液進行濃縮，單罐發(fā)酵液平均可獲得濃縮酶液2.0～2.2 L，酶活力約為320 U/mL。

圖6 分批補料發(fā)酵條件下的菌體生長與胞外酶活力增長曲線Fig.6 Cells growth and production of extracellular enzymatic activity

2.5 重組β-1,3-葡聚糖酶對靈芝細胞壁的裂解

將2.4中獲得的BGL6906酶液與靈芝菌絲體細胞混合觀察靈芝細胞的變化，發(fā)現(xiàn)即使使用高濃度的酶與少量靈芝細胞混合反應(yīng)也無法觀察到原生質(zhì)體的形成。在前期工作中，Cellulosimicrobiumsp.6906發(fā)酵液10倍濃縮液與靈芝細胞混合反應(yīng)30 min即可觀察到明顯的原生質(zhì)體，而當時所使用的Cellulosimicrobiumsp.6906發(fā)酵液濃縮液的β-1,3葡聚糖酶酶活力只有4 U/mL。由此推測BGL6906可能需要和其他酶共同作用才能有效水解靈芝細胞壁。由于Cellulosimicrobiumsp.6906發(fā)酵過程需要使用寡聚茯苓多糖進行誘導(dǎo)，因此目前尚不具備工業(yè)化應(yīng)用的可能性。為了尋找一種適合于工業(yè)應(yīng)用的方法，將BGL6906酶液與市場上可以獲得的各種工業(yè)酶制劑配合使用觀察靈芝細胞壁裂解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BGL6906與市售果膠酶或木瓜蛋白酶配合水解靈芝菌絲體細胞后可以觀察到少量原生質(zhì)體。結(jié)果如表2所示。

表2 BGL6906與其他酶制劑配合水解靈芝菌絲體的效果Table 2 Effects of cooperative hydrolysis of Ganoderma mycelium with BGL6906 and other enzyme products

由表2可見，BGL6906以及果膠酶和木瓜蛋白酶單獨作用于靈芝菌絲體均不能有效水解細胞壁。BGL6906先水解再加果膠酶或木瓜蛋白酶可以水解靈芝細胞壁獲得少量原生質(zhì)體；但2種酶同時加入，或者是果膠酶或木瓜蛋白酶加入后再加BGL6906，均無法得到原生質(zhì)體，出現(xiàn)這種現(xiàn)象最可能的原因是BGL6906被降解。木瓜蛋白酶本身就能夠水解蛋白質(zhì)，降解BGL6906導(dǎo)致其失去活性很容易理解。果膠酶則可能是生產(chǎn)過程中混入了蛋白酶。目前市售果膠酶一般采用黑曲霉發(fā)酵獲得，黑曲霉也是酸性蛋白酶的生產(chǎn)菌，因此果膠酶發(fā)酵過程很可能伴隨蛋白酶的生成，并最終進入果膠酶成品中。

為驗證這一猜想，將BGL6906與果膠酶混合，大約5 min后混合液中β-1,3-葡聚糖酶的活性幾乎檢測不到，但果膠酶活性則基本不變，可見2種酶共同作用時BGL6906被降解的可能性很大。據(jù)此，將靈芝菌絲體用果膠酶水解后離心，去除上清液后再用BGL6906水解，可以獲得少量的原生質(zhì)體。在此結(jié)果的啟發(fā)下，進一步采用以下方法水解靈芝細胞：用BGL6906水解靈芝細胞5 min后加入果膠酶水解30 min，離心去除上清液后懸浮細胞再次加入BGL6906水解30 min，處理后的靈芝原生質(zhì)體形成率明顯上升，結(jié)果如圖7所示。經(jīng)過BGL6906+果膠酶+BG6906處理的靈芝菌絲體雖然大部分沒有變成原生質(zhì)體，但菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，主要特點是菌絲變短、菌體膨大，這很可能是細胞壁強度弱化的結(jié)果。

a-靈芝菌絲體;b-酶解后靈芝菌絲體圖7 BGL6906和果膠酶處理前后細胞形態(tài)的差異Fig.7 Cell morphology before and after treatment with BGL6906 and pectinase

2.6 靈芝細胞裂解工藝的建立

從2.5的實驗結(jié)果看，以BGL6906裂解靈芝細胞的關(guān)鍵是其與果膠酶交替作用。由于靈芝菌絲體粗壯，在實際生產(chǎn)中，一般采用板框過濾的方法進行細胞的收集。據(jù)此建立如下工藝：靈芝發(fā)酵到達終點時，用板框過濾收集菌絲體，收集完成后取出濾餅，用磷酸緩沖液重新懸浮菌體至與發(fā)酵液等體積，并加入BGL6906至終濃度為10 U/mL，反應(yīng)5 min后加入果膠酶至終濃度為20 U/mL，反應(yīng)10 min后再次壓入板框過濾機過濾。為了盡量減少濾餅中果膠酶的殘留，當菌液全部加入板框后，再向板框中壓入相當于5倍發(fā)酵液體積的自來水對濾餅進行沖洗。濾餅取出后再次用磷酸緩沖液懸浮菌體，加入BGL6906至終濃度為20 U/mL，反應(yīng)30 min后再加入果膠酶至終濃度為100 U/mL，反應(yīng)30 min。通過上述工藝靈芝菌絲體經(jīng)過2次BGL6909+果膠酶處理即經(jīng)雙酶2次處理。

經(jīng)過上述處理的菌液鏡檢可以觀察到少量原生質(zhì)體形成。上述酶解的靈芝進一步用超聲波進行細胞破碎，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同處理條件對超聲波破碎效果的影響Fig.8 Effects of different treatment conditions on ultrasonic disruption注：未經(jīng)酶水解實驗中均使用滅活的酶；果膠酶水解實驗中2次均使用滅活的BGL6906和有活性的果膠酶；單次雙酶水解實驗中，第一次雙酶水解時使用滅活的酶，第二次雙酶水解時均使用有活性的酶；兩次雙酶水解實驗均采用有活性的酶。以上4組實 驗均采用2次板框過濾和2次雙酶水解

經(jīng)過雙酶2次處理的靈芝菌絲體經(jīng)過5 min超聲波處理后經(jīng)過堿提法的蛋白提取率為76%，而對照組，即采用滅活的酶處理的細胞則經(jīng)過30 min超聲波處理后也只能得到約40%的蛋白。可見BGL6906和果膠酶交替處理可以極大的弱化細胞壁，提高超聲波處理的效率。

上述工藝需要2次BGL6909-果膠酶處理菌絲體細胞，其中第一次處理時酶的用量和處理時間必須嚴格控制，否則在隨后的板框過濾時菌液會堵塞濾布的濾孔而無法收集細胞。板框過濾的關(guān)鍵是濾液中的固形物互相堆積形成有孔隙的濾餅，靈芝菌絲體粗壯并有一定的剛性，這是其容易通過板框過濾進行細胞收集的關(guān)鍵原因。酶的過度處理可能導(dǎo)致一部分細胞的細胞壁弱化，從而致菌絲變得柔軟而無法形成濾餅，同時堵塞濾餅和濾布的孔隙，因此第一次酶處理時酶解程度需要嚴格控制。

將經(jīng)過堿提法得到的蛋白溶液進一步進行蛋白提取和初步純化，獲得富硒蛋白粉。檢測結(jié)果顯示，未經(jīng)酶水解得到的蛋白中硒含量約為584.6 mg/kg，經(jīng)2次雙酶水解得到的蛋白中硒含量約為537.2 mg/kg。兩者非常接近，可見2次雙酶提取的方法對蛋白中硒的穩(wěn)定性并沒有明顯的影響。本文采用的蛋白提取方法參考了鄧乾坤等[18]建立的富硒酵母蛋白提取方法，并與該文獻中得到的蛋白中硒含量(358.9 mg/kg)接近。

3 討論

本研究對一種來源于纖維微菌的β-1,3-葡聚糖酶基因bgl6906進行了異源表達，獲得的重組酶BGL6906與文獻報道的纖維微菌屬來源的β-1,3-葡聚糖酶基本一致[19-21]。BGL6906在性質(zhì)上與已報道的上述β-1,3-葡聚糖酶的最大的差異是其只對茯苓多糖表現(xiàn)出高活性。以茯苓多糖為底物時，BGL6906的比酶活達到567.8 U/mg，以酵母聚糖、熱凝膠和昆布多糖為底物時，比酶活力大約只有水解茯苓多糖的酶活力的1/7、1/24和1/35。纖維素纖維微菌和Cellulosimicrobiumfunkei來源的β-1,3-葡聚糖酶是目前有文獻報道的與BGL6906氨基酸序列最接近的葡聚糖酶，三者的氨基酸同源性均在90%以上。纖維素纖維微菌和C.funkei來源的β-1,3-葡聚糖酶的最適底物分別是熱凝膠和昆布多糖[20-21]，可見纖維微菌屬來源的β-1,3-葡聚糖酶即使氨基酸序列非常接近其最適底物也可能不完全相同。

β-1,3-葡聚糖酶主要在酵母細胞壁水解、生物防治以及寡聚葡聚糖制備等方面有一定的應(yīng)用和研究。葡聚糖是靈芝細胞壁的主體成分之一，顏夢秋等[22]研究靈芝屬真菌紫芝的細胞壁葡聚糖結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，其葡聚糖主要由β-1,3-糖苷鍵連接而成。β-1,3-葡聚糖酶的重組酶在靈芝等大型子實體真菌的菌絲體裂解方面的應(yīng)用研究未見報道。從本文研究結(jié)果看，BGL6906單獨并不能有效水解靈芝細胞壁，這可能是限制這一類酶應(yīng)用的原因。在對大型真菌的酶法破壁的研究中，黃敏等[23]發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等處理金針菇菌絲體細胞后有利于進一步的細胞破碎。本研究發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶和果膠酶與BGL6906有協(xié)同作用的效果。纖維素酶是有較多文獻報道的能促進大型真菌菌絲體細胞壁降解的酶。本研究也發(fā)現(xiàn)，木霉來源的中性纖維素酶單獨作用于靈芝菌絲體細胞時可以明顯提高后續(xù)超聲波破碎的效率，但與BGL6906聯(lián)合作用時不管是共同使用還是交替使用均未見降解效果增強的現(xiàn)象。這可能是因為纖維素酶和BGL6906均作用于葡聚糖，功能上有相似性，因此不能產(chǎn)生協(xié)同作用。

4 結(jié)論

本文從1株纖維微菌屬細菌中克隆了1條β-1,3-葡聚糖酶基因，表達產(chǎn)物重組酶BGL6906可以分泌到細胞外。重組酶BGL6906與果膠酶聯(lián)合作用可以大幅度提高靈芝菌絲體的破壁效率。這一方法目前最大的缺陷是2種酶無法在同一體系中使用，原因可能是果膠酶中的蛋白酶降解BGL6906。今后工作中，采用同一個表達體系異源表達BGL6906和果膠酶可能有助于解決這一問題。