地塞米松在體外通過自噬減少亨廷頓蛋白積聚

程 丹，譚其蓮，陳利海，蔣婷婷，朱駿生，尹海玲，王曉亮

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院） 麻醉科，江蘇 南京 210001）

亨廷頓舞蹈（Huntington′s disease， HD）是一種常染色體顯性的神經(jīng)退行性遺傳病，由it-15基因外顯子1發(fā)生CAG三核苷酸重復(fù)突變，引發(fā)其編碼的亨廷頓蛋白多聚谷氨酰胺序列延長(zhǎng)所致［1］。目前突變亨廷頓蛋白導(dǎo)致大腦特定區(qū)域產(chǎn)生神經(jīng)退行性病變的機(jī)制尚不明確，在神經(jīng)元中正常的亨廷頓蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而突變亨廷頓蛋白可以加工成有毒的化合物從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，突變亨廷頓蛋白錯(cuò)誤的折疊以及異常聚集是引起HD的重要機(jī)制［2-3］。

真核細(xì)胞內(nèi)有兩種降解途徑，一種是泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome，UPS），一種是自噬溶酶體通路（autophagy-lysosome pathway system，ALP）［4-5］。積聚的突變亨廷頓蛋白主要通過自噬途徑降解［3］。自噬是溶酶體依賴的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程，待降解物質(zhì)首先被自噬體吞噬，然后呈遞給溶酶體降解［6］。一些自噬激活劑可以上調(diào)自噬，從而對(duì)HD起治療作用［7］。地塞米松是臨床上最常使用的一種合成糖皮質(zhì)激素，研究表明地塞米松可以引發(fā)自噬［8］。關(guān)于地塞米松是否影響突變亨廷頓蛋白的積聚尚不清楚，以及與自噬的關(guān)聯(lián)尚未闡明。因此，本研究探討細(xì)胞水平上地塞米松是否影響突變亨廷頓蛋白的積聚，以及自噬在其中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

PC12、GFP-Htt（Q74）-PC12細(xì)胞獲贈(zèng)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)溫龍平教授。主要試劑及來(lái)源：胎牛血清（FBS）購(gòu)于杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibico公司；兔抗LC-3（1∶200稀釋，NB100-2220）單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Novus Biologicals公司；小鼠抗β-actin抗體（1∶1 000稀釋，60008-1-Ig）和小鼠抗GFP抗體（1∶1 000稀釋，66002-1-Ig）購(gòu)于武漢Proteintech公司；羊抗小鼠IgG抗體（1∶10 000稀釋，ab6808）購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，羊抗兔FITC抗體（1∶100稀釋，SC2-12）；Lipofectamine 2000 （11668-019）購(gòu)于加拿大Invitrogen公司；3-甲基腺嘌呤（3-MA）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司；地塞米松購(gòu)于上海阿拉丁公司。主要儀器：Olympus BX53熒光顯微鏡，奧林巴斯公司；Amersham Imager 600凝膠成像儀，美國(guó)通用公司；Allegra64R離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特公司；YCP-100細(xì)胞培養(yǎng)箱，長(zhǎng)沙華曦科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的獲得 將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM（含10%FBS，青霉素G100 μg/mL，鏈霉素100 μg/mL）培養(yǎng)基中，并置于37 ℃含 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)密度為2×104～4×104個(gè)/cm2，每3～4 d更換培養(yǎng)基一次。通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，使PC12細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）融合的突變亨廷頓蛋白（Q74），轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用0.6 mg/mL的G418培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每3天更換培養(yǎng)基一次，經(jīng)3～4個(gè)月的傳代選擇和亞克隆后獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP-Q74的細(xì)胞株，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光的即代表突變亨廷頓蛋白。

1.2.2 藥物處理 PC12細(xì)胞分為對(duì)照組（加入溶劑25 mg/mL DMSO）、地塞米松組（加入地塞米松60 nmol/L）、3-MA組（加入3-MA，2.5 mmol/L）和3-MA+地塞米松組（同時(shí)加入地塞米松和3-MA），藥物處理36 h后觀察突變亨廷頓蛋白以及自噬水平的變化。

1.2.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變亨廷頓蛋白的表達(dá) 將收集的細(xì)胞加入裂解液中裂解，然后加入樣品緩沖液并煮沸10 min，通過BCA法測(cè)定樣品濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠100 V恒壓電泳分離樣品蛋白，電泳持續(xù)1.5 h，然后將電泳后的凝膠與硝酸纖維素膜疊在一起，在350 mA、1.5 h條件下轉(zhuǎn)移至膜上，將膜置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，之后分別加入相應(yīng)的一抗β-actin抗體（1∶1 000）和GFP抗體（1∶1 000）4 ℃過夜，次日在搖床上用TBST洗膜3次，之后加入二抗羊抗小鼠IgG抗體（1∶10 000）37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次后，將ECL顯色液加入膜上顯影，由Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)采集并記錄，Image J圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值反映蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè)觀察突變亨廷頓蛋白積聚 收集細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，再用0.1%TritonX-100透膜10 min，TBST洗3次后，用1%FBS封閉1 h，加入一抗兔抗LC-3（1∶200）4 ℃條件下孵育過夜，次日TBST洗3次，后加入二抗羊抗兔FITC 抗體（1∶100），在37℃孵育1 h，TBST洗三次后使用80%甘油封片，之后通過熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析和Bonferroni法，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 免疫熒光檢測(cè)顯示地塞米松減少突變亨廷頓蛋白聚集

穩(wěn)定表達(dá)GFP-Htt（Q74）的PC12細(xì)胞中，聚集的突變亨廷頓蛋白在熒光顯微鏡下觀測(cè)，表現(xiàn)為綠色熒光聚集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，地塞米松處理后，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光聚集顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖1所示。

2.2 地塞米松引發(fā)自噬

微管相關(guān)蛋白3（LC3）是自噬體的標(biāo)志物，從熒光顯微鏡下觀察，對(duì)照組中LC3均勻分布，而地塞米松組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顯著的LC3點(diǎn)狀聚集，提示地塞米松引發(fā)了細(xì)胞自噬，如圖2所示。

2.3 免疫熒光檢測(cè)顯示抑制自噬阻斷地塞米松對(duì)突變亨廷頓蛋白積聚的影響

熒光顯微鏡下觀察表明：相比對(duì)照組，自噬抑制劑3-MA處理后，細(xì)胞內(nèi)綠色的GFP-Htt（Q74）顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相比地塞米松組，3-MA+地塞米松組細(xì)胞內(nèi)積聚的GFP-Htt（Q74）顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而相比3-MA組，3-MA+地塞米松組細(xì)胞內(nèi)及積聚的GFP-Htt（Q74）沒有顯著變化，說明地塞米松作用被阻斷，如圖3所示。

2.4 蛋白印跡檢測(cè)表明地塞米松減少突變亨廷頓蛋白的表達(dá)

穩(wěn)定表達(dá)GFP-Htt（Q74）的PC12細(xì)胞中，經(jīng)地塞米松處理36 h，通過蛋白印跡檢測(cè)GFP-Htt（Q74）含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，地塞米松組GFP-Htt（Q74）含量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），如圖4所示。

圖1 熒光顯微鏡觀察經(jīng)地塞米松處理的PC12細(xì)胞中GFP標(biāo)記的突變亨廷頓蛋白積聚的變化Fig.1 Fluorescence microscopy observation of changes in the accumulation of GFP-tagged mutant Huntingtin in PC12 cells treated with dexamethasone

圖2 熒光顯微鏡觀察地塞米松處理36 h的PC12細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3分布、形態(tài)變化Fig.2 Fluorescence microscope observation of the distribution and morphological changes of the autophagy marker LC3 in PC12 cells treated with dexamethasone for 36 h

2.5 蛋白印跡檢測(cè)表明抑制自噬阻斷地塞米松對(duì)突變亨廷頓蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡檢測(cè)Htt（Q74）含量，相比對(duì)照組，3-MA組細(xì)胞內(nèi)Htt（Q74）顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相比地塞米松組，3-MA+地塞米松組細(xì)胞內(nèi)Htt（Q74）顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而相比3-MA組，3-MA+地塞米松組細(xì)胞內(nèi)Htt（Q74）量沒有顯著變化，如圖5所示。

3 討論

HD基因編碼的亨廷頓蛋白在細(xì)胞和組織中都有廣泛表達(dá)［9］。正常的亨廷頓蛋白主要存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)［9］，但突變亨廷頓蛋白常形成聚集物，包括核內(nèi)聚集物和神經(jīng)氈胞質(zhì)聚集物，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)突變亨廷頓蛋白聚集物都有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡［10］。本研究表明地塞米松可以顯著減少細(xì)胞質(zhì)中突變亨廷頓蛋白的積聚程度并減少GFP-Q74代表的突變亨廷頓蛋白的含量，這說明地塞米松可能延緩或治療亨廷頓舞蹈病。

糖皮質(zhì)激素是機(jī)體內(nèi)極為重要的一類調(diào)節(jié)分子，它對(duì)機(jī)體的發(fā)育、生長(zhǎng)、代謝以及免疫功能等起著重要調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)最重要的調(diào)節(jié)激素，地塞米松是臨床上常用的合成糖皮質(zhì)激素，容易透過血腦屏障進(jìn)入腦組織中，研究表明地塞米松可以增加熱休克因子1（HSF1），增強(qiáng)熱休克反應(yīng)，減緩亨廷頓疾病的進(jìn)展［11］。此外糖皮質(zhì)激素可以選擇性對(duì)抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，使糖皮質(zhì)激素在亨廷頓舞蹈病的果蠅模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［12］。而本研究的結(jié)果從細(xì)胞水平上證明了地塞米松可以減少積聚的突變亨廷頓蛋白，更進(jìn)一步的闡明了先前的研究，以及地塞米松對(duì)亨廷頓病的治療機(jī)制。

圖3 熒光顯微鏡觀察加入自噬抑制劑3-MA對(duì)地塞米松處理的細(xì)胞中突變亨廷頓蛋白積聚改變Fig.3 Fluorescence microscopy observation of changes in the accumulation of mutant Huntingtin in dexamethasone-treated cells with the addition of autophagy inhibitor 3-MA

圖4 蛋白印跡檢測(cè)經(jīng)地塞米松處理的PC12細(xì)胞中GFP標(biāo)記的突變亨廷頓蛋白表達(dá)的變化Fig.4 Changes in the expression of GFP-tagged mutant Huntingtin in dexamethasone-treated PC12 cells detected by western blotting

HD患者中自噬功能是受到破壞的，突變亨廷頓蛋白可以損傷自噬，最新的研究還表明正常的亨廷頓蛋白也可以調(diào)節(jié)自噬，并對(duì)維持自噬功能起到重要作用［13］。抑制正常亨廷頓蛋白和亨廷頓相關(guān)蛋白1（HAP1）都可以阻斷自噬體的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，而突變亨廷頓蛋白可以干擾自噬體的囊泡運(yùn)輸，阻斷自噬體和溶酶體融合，從而破壞自噬功能［14］；突變亨廷頓蛋白還可以抑制T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子核轉(zhuǎn)位損害自噬降解功能［15］。微管相關(guān)蛋白3（LC3）是自噬體的標(biāo)志物，在自噬過程中，當(dāng)自噬過程被激活，LC3Ⅰ被剪切形成分子量較小的LC3Ⅱ，并且聚集到自噬體膜表面，進(jìn)而包裹待降解物形成完整的自噬體，最后結(jié)合溶酶體形成自噬溶酶體，使待降解物被降解，從而達(dá)到物質(zhì)的循環(huán)再利用［5-6］。本研究證明地塞米松可以引發(fā)自噬，減少積聚突變亨廷頓蛋白含量，自噬抑制劑3-MA可以進(jìn)一步增加異聚突變亨廷頓蛋白含量，并可以阻斷地塞米松作用，說明地塞米松可能是通過自噬途徑增加突變亨廷頓蛋白降解，從而減少異聚突變亨廷頓蛋白含量。

綜上所述，地塞米松減少異聚的突變亨廷頓蛋白，從而可能緩解和治療HD，地塞米松同時(shí)引發(fā)自噬，抑制自噬阻斷地塞米松的作用，說明自噬可能是地塞米松減少積聚突變亨廷頓蛋白的分子機(jī)制。

圖5 蛋白印跡檢測(cè)加入自噬抑制劑3-MA對(duì)地塞米松處理的細(xì)胞中突變亨廷頓蛋白表達(dá)的變化Fig.5 Changes of mutant Huntingtin protein expression in dexamethasone-treated cells detected by adding autophagy inhibitor 3-MA by western blot