基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討宣肺化濁湯防治新冠肺炎德爾塔變異病毒的作用機制*

郭凱麗 袁盼盼 薛妙 王艷霞 劉繼平 王斌 王川 張鑫磊 朱星枚**

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046；3.陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點研究室，陜西 咸陽 712046；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室，陜西 西安 710032

德爾塔病毒(delta virus)是新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019，COVID-19)的變異毒株，具有傳播力強、潛伏期短、病毒載量高等特點[1-3]，是陜西此次本土疫情的根源。與武漢新型冠狀病毒肺炎相比，德爾塔病毒對康復(fù)個體血清中抗體的敏感性降低了6倍，且抗德爾塔病毒疫苗有效性降低[4]。研究表明，德爾塔病毒變異株抗原位點發(fā)生了突變[5]，此突變可增強病毒感染性和融合性，同時促進病毒復(fù)制[6-7]。目前針對新冠肺炎德爾塔病毒感染患者的密接、次密接人員尚無特效藥物，中醫(yī)藥是治療新冠肺炎德爾塔病毒輕癥患者的有效手段[8]。

宣肺化濁湯出自于《甘肅省中醫(yī)藥預(yù)防新冠肺炎方(2021版)》，由蜜麻黃、連翹、前胡、法半夏、麩炒蒼術(shù)、廣藿香、羌活、酒大黃、陳皮、黃芩10味中藥組成。此方宣肺透邪、清熱化濁，可用于新冠病毒密切接觸人員的預(yù)防，也可用于新冠肺炎德爾塔病毒輕癥患者的治療。目前宣肺化濁湯防治德爾塔病毒的作用機制尚不清楚，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)既能分析中藥作用，還能說明微觀分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)間的互作關(guān)系[9]。因此本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討宣肺化濁湯各味中藥活性成分、靶點以及作用機制，為新冠肺炎輕癥患者應(yīng)用宣肺化濁湯防治德爾塔病毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1本研究所用軟件及數(shù)據(jù)庫 見表1。

表1 本研究所用軟件及數(shù)據(jù)庫

1.2各藥物活性成分的獲取與篩選 設(shè)置口服利用度(OB30%)、類藥性(DL0.18)，在線查詢TCMSP，獲取蜜麻黃、連翹、前胡、法半夏、麩炒蒼術(shù)、廣藿香、羌活、酒大黃、陳皮、黃芩的活性成分。

1.3活性成分作用靶點的獲取 通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲得1.2中各成分的Canonical SMILES，導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)項獲得活性成分的作用靶點。

1.4德爾塔病毒作用靶點的獲取 以“delta virus”為關(guān)鍵詞，在線搜索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)項獲得德爾塔病毒靶點。

1.5藥物成分靶點與疾病靶點交集的獲取 將1.3與1.4中的靶點導(dǎo)入Venny平臺，獲得藥物成分靶點與疾病靶點交集。

1.6GO及KEGG富集分析 將1.5中交集靶點的official gene symbol輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，Select Identifier選擇“official gene symbol”，物種選擇“homo sapiens”，對作用靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，在微生信平臺繪制排名靠前的GO過程和KEGG通路氣泡圖。

1.7蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為深入研究宣肺化濁湯對新冠肺炎德爾塔變異病毒的潛在作用靶點，將1.5中所得靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo Sapiens”，獲取蛋白相互作用關(guān)系。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，根據(jù)Degree值篩選靶點、通路，利用“Network Analyzer”進行可視化處理，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.8靶點、通路相互作用的構(gòu)建與分析 將1.7中篩選獲得靶點導(dǎo)入Metascape中導(dǎo)出Excel，獲得靶點、通路作用關(guān)系表。

1.9分子對接驗證 選擇宣肺化濁湯核心成分和核心靶點進行分子對接驗證。利用RCSB PDB網(wǎng)站輸出靶點mol2結(jié)構(gòu)，PubChem網(wǎng)站輸出活性成分的SDF文件，通過 Autodocktool1.5.6 軟件進行處理并轉(zhuǎn)變?yōu)镽CSB PDBQT 格式。借助 Autodocking vina v1.2.0分子對接。選取結(jié)合自由能最小的構(gòu)象，用Pymol、Discovery studio Client 進行可視化及結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1宣肺化濁湯的主要活性成分信息 見表2。

表2 主要活性成分信息表

2.2宣肺化濁湯防治新冠肺炎德爾塔變異病毒的潛在靶點 將GeneCards等數(shù)據(jù)庫獲得的靶點刪除重復(fù)項后得到宣肺化濁湯646個靶點、德爾塔變異病毒5583個靶點。兩者求交集共得到526個宣肺化濁湯對德爾塔變異病毒潛在作用的靶點(圖1)。

圖1 宣肺化濁湯活性成分及德爾塔變

2.3蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖 將2.2中所得526個靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)Degree值獲得53個宣肺化濁湯對德爾塔變異病毒作用的靶點(表3)，并獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2)。

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建核心靶點

圖2 宣肺化濁湯對新冠肺炎德爾塔變異病毒靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4GO分析與KEGG富集分析 GO分析確定2255個條目(圖3)。

圖3 宣肺化濁湯靶點的GO富集分析

主要涉及2097條生物過程(Biological process,BP)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞老化以及對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等；52條細(xì)胞組分(Cellular component,CC)，包括膜筏、質(zhì)膜筏、粘著斑等；106條分子功能(Molecular function,MF)，包括細(xì)胞-基質(zhì)粘附連接、磷酸酶結(jié)合、激素受體結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性 DNA 結(jié)合等。KEGG富集分析確定156個條目，主要包括癌癥中的蛋白聚糖通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、內(nèi)分泌抵抗通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路等(圖4)。

圖4 宣肺化濁湯靶點的KEGG富集分析

2.5“藥物-活性成分-作用靶點-蛋白通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物-活性成分-交集靶點-蛋白通路關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.8.2中，構(gòu)建“宣肺化濁湯-德爾塔變異病毒”的網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。其中紅色代表宣肺化濁湯、橙色代表組方中各藥物、黃色代表活性成分、綠色代表作用靶點、藍(lán)色代表通路。該網(wǎng)絡(luò)圖中黃芩、連翹、前胡、羌活、陳皮為宣肺化濁湯的關(guān)鍵作用藥物；naringenin、Onjixanthone I、bicuculline、acacetin、baicalein、pachypodol為主要活性成分。

圖5 “宣肺化濁湯-新冠肺炎德爾塔變異病毒”的“藥物-活性成分-作用靶點-蛋白通路”網(wǎng)絡(luò)

2.6分子對接結(jié)果 將篩選后的主要活性成分與新冠肺炎德爾塔變異病毒主要靶點進行分子對接。宣肺化濁湯中主要活性成分與主要靶點結(jié)合能均<-5.0 kJ·mol-1(表4)，其中GSK3B與TYRA：108、THRA：113、GLYA：84等氨基酸殘基之間存在范德華力；與PHEA：122、LEUA：80氨基酸殘基之間存在pi-烷基鍵；與VALA：40氨基酸殘基存在pi-σ鍵。PIK3R1與TYRA：106等氨基酸殘基存在范德華力；與VALA：108等氨基酸殘基存在pi-σ鍵。KIT與 PHEA：70等氨基酸殘基存在范德華力；與META：94等氨基酸殘基存在pi-s鍵；與LEUA：99等氨基酸殘基存在pi-烷基鍵。KDR與GLAY：41等氨基酸殘基存在范德華力；與PROB:165氨基酸殘基存在pi-陰離子鍵。MMP-9與META：247等氨基酸殘基存在范德華力；與GLUA：227等氨基酸殘基存在pi-陽離子鍵；與METB：247等氨基酸殘基存在pi-烷基鍵等(圖 6)。

表4 結(jié)合能結(jié)果

3 討論

德爾塔變異株最早于2020年10月發(fā)現(xiàn)于印度，2021年5月被世界衛(wèi)生組織列為“受關(guān)注的對象”，其因強傳染性威脅全球健康。宣肺化濁湯是由甘肅省新冠肺炎疫情中醫(yī)藥救治專家組會同國家醫(yī)療救治指導(dǎo)組中醫(yī)藥專家針對德爾塔變異病毒感染患者的密接、次密接人員共同研究制定。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出39個宣肺化濁湯的主要活性成分，通過作用526個潛在靶點防治德爾塔病毒，說明宣肺化濁湯治療新冠肺炎德爾塔病毒具有多成分、多靶點的特點。其中黃芩、連翹、前胡、羌活、陳皮5味中藥中的6種成分：naringenin、Onjixanthone I、bicuculline、acacetin、baicalein、pachypodol可能是治療新冠肺炎德爾塔病毒的主要活性成分。研究表明，naringenin可促進活化的肝星狀細(xì)胞凋亡，同時抑制肝細(xì)胞的凋亡，且naringenin可能通過下調(diào)MMP-9的表達(dá)改善缺血后BBB的功能，從而保護腦組織[10-13]。Onjixanthone I屬于蒽醌類化合物[14]，其通過抑制氧化損傷和逆轉(zhuǎn)AChE活性，減少學(xué)習(xí)缺陷和記憶喪失，緩解了對鉛誘導(dǎo)的乙酰膽堿酯酶功能障礙和認(rèn)知障礙的神經(jīng)保護作用[15-17]。bicuculline可下調(diào)MMP-9基因表達(dá)且抑制JAK2的活化從而抑制人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[18]。Acacetin 是一種存在于各種植物中的黃酮，可抑制 STAT3 激活的 DU145 前列腺癌細(xì)胞中的組成型和誘導(dǎo)型 STAT3 活化,以時間依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19-21]。baicalein可抑制肝癌細(xì)胞的增殖，降低肝癌細(xì)胞的能量代謝水平[22]。pachypodol具有抗氧化和細(xì)胞保護作用[23-24]。對宣肺化濁湯治療新冠肺炎德爾塔病毒的潛在作用靶點分析發(fā)現(xiàn)CDK2、 mTOR、ABL1、MAPK、EGFR、MAPK、Mcl-1、IL-2可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、凋亡、自噬等。GSK3B在非胰島素依賴型糖尿病中，其活性會異常升高。MMP-2、mTOR可在腫瘤相關(guān)組織中發(fā)揮作用。PTGS2是非甾體類藥物的作用靶點之一，與炎癥反應(yīng)相關(guān)。APP是一種跨膜糖蛋白，過度的APP干擾神經(jīng)元轉(zhuǎn)運，對單純性皰疹病毒導(dǎo)致的APP表達(dá)上調(diào)有很大意義[25]。

綜上所述，宣肺化濁湯中活性成分具有抗病毒、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等作用，且其通過核心靶點調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡、自噬，對新冠肺炎德爾塔病毒發(fā)揮潛在治療作用，本研究為后續(xù)防治新冠肺炎德爾塔病毒提供更多理論支持。