核糖體展示技術(shù)篩選抗呋喃唑酮單鏈抗體

陳蔭楠，羅彩林，鄭晨娜，石賢愛，劉震

1.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，福建 泉州 362000；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108

硝基呋喃類化合物是一類由人工合成的廣譜抗生素，曾被作為治療藥物與飼料添加劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，具有較好的抑菌及殺菌功效［1］。但長期研究發(fā)現(xiàn)，若食用含呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)ZD）殘留的水產(chǎn)品，會對人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用［2］。我國在2002年將FZD列為禁用藥［3］。

目前水產(chǎn)品中FZD 殘留量主要通過儀器或ELISA 試劑盒檢測。儀器法檢測FZD 存在檢測設(shè)備價格昂貴、樣品需進行復(fù)雜的前處理步驟以及對操作人員要求較高等問題，不適合大批量檢測［4］。與儀器法相比，ELISA 試劑盒檢測FZD 具有快速、操作簡便、靈敏度高、成本低等優(yōu)點，更適用于農(nóng)獸藥殘留的快速檢測。傳統(tǒng)ELISA 法需先獲得相應(yīng)的多抗血清或單抗。多抗存在抗體不均一、特異性較差的特點，無法實現(xiàn)穩(wěn)定的大批量生產(chǎn)［5］，單抗的特異性雖然較高，但其制備過程復(fù)雜。隨著基因工程的快速發(fā)展，單鏈抗體由于其相對分子質(zhì)量小、組織穿透力強、免疫性低等特點，已成為研究熱點，但用于水產(chǎn)品中殘留藥物檢測方面的研究較少。

核糖體展示技術(shù)通過重疊延伸（splicing by over?lap extension，SOE）?PCR 技術(shù)構(gòu)建單鏈抗體文庫，直接在體外進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，形成蛋白質(zhì)?核糖體?mRNA復(fù)合物［6］。利用核糖體表面表達(dá)的抗體和包被抗原的特異性可直接在體外進行篩選［7?8］，無需轉(zhuǎn)化即可進行大容量庫的構(gòu)建及篩選，不受宿主細(xì)胞限制，彌補了細(xì)胞內(nèi)展示技術(shù)的不足［9］。因此，本研究通過核糖體展示技術(shù)篩選獲得抗FZD 單鏈抗體株，并對其特異性進行檢測，在大批量生產(chǎn)后進一步應(yīng)用于后續(xù)的ELISA檢測。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株及載體 小鼠雜交瘤細(xì)胞、E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）、E.coli Rosetta（DE3）、pET?28a（+）vector、pET?27b（+）vector、pMD?18T 均由福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器 HRP標(biāo)記的抗His?tag標(biāo)簽抗體購自美國Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（H + L）購自美國Thermo 公司；FZD 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、呋喃妥因、呋喃它酮、FZD 代謝物、呋喃西林及其衍生物5 種結(jié)構(gòu)類似物標(biāo)準(zhǔn)液購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）購自美國 Worthington 公司；TNT T7 Quick for PCR DNA 試劑盒購自美國Promega 公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetrame?thylbenzidine，TMB）購自天根生化科技（北京）有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit 購自美國 Ther?moFisher Scientific 公司；各種DNA 限制性內(nèi)切酶購自日本 TaKaRa 公司；Ni?NTA 親和層析柱購自德國QIAGEN公司。

1.3 人工抗原合成 由福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實驗室前期利用重氮法成功制備FZD 的人工抗原FZD?OVA，具體步驟參考文獻［10］。

1.4 單鏈抗體文庫構(gòu)建 Trizol法提取小鼠雜交瘤細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，以其為模板，設(shè)計重鏈VH和輕鏈VL可變區(qū)簡并引物，擴增抗體的重鏈和輕鏈［11］。引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR擴增引物Tab.1 Primers for PCR amplification

擴增后的VL?linker分別與VH?linker進行 SOE?PCR，組裝成 VH?linker?VL單鏈抗體文庫。第一輪為無引物PCR，反應(yīng)體系為：Taq PCR master mix 20 μL，VH?linker和VL?linker各4 μL，ddH2O 12 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共 15 個循環(huán)。第二輪 PCR 反應(yīng)體系為：Taq PCR master mix 5 μL，VH?linker／back和Ck／for 各2 μL，ddH2O 1 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 30 s，52 ℃退火30 s，最后72 ℃延伸1 min，共25 個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物并純化回收。通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，驗證抗體文庫的多樣性。

1.5 體外轉(zhuǎn)錄及翻譯 用TNT T7 Quick for PCR DNA試劑盒對單鏈抗體文庫進行轉(zhuǎn)錄和翻譯［12］。反應(yīng)體系為：TNT T7 PCR Master Mix 40 μL，1 mmol／L Methi?onine 1 μL，PCR DNA 8 μL，dd H2O 1 μL，共 50 μL，于30 ℃水浴條件下反應(yīng)90 min。

1.6 親和篩選 將檢測抗原FZD?OVA稀釋至40μg／mL，包被酶標(biāo)板，4 ℃包被過夜；棄包被液，緩沖液洗滌3次，加入5%脫脂奶37 ℃封閉3 h；棄封閉液，PBSM緩沖液洗滌2 次，扣干后置冰上預(yù)冷；將翻譯后的混合產(chǎn)物加至150 μL 冰冷脫脂奶中混勻后，加至預(yù)冷孔板中，50 μL／孔，置冰上繼續(xù)反應(yīng)2 h；PBSTM 緩沖液洗滌3 次，每次5 min，PBSM 緩沖液按同樣方法再次洗滌 2 次，加入含 20 mmol／L EDTA 的 1 × PBS緩沖液，冰上放置10 min 進行解離；吸取上清，以其mRNA 為模板，進行 RT?PCR，具體步驟同 1.4 項，重復(fù)下一輪篩選。同時，設(shè)無抗原對照組和無TNT T7 PCR Master Mix的對照組［13?14］。

1.7 單鏈抗體的原核表達(dá) 經(jīng)三輪篩選后，產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和HindⅢ雙酶切，與經(jīng)同樣酶酶切的線性質(zhì)粒pET?28a（+）進行酶連反應(yīng)；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含50 μg／mL卡那霉素的LB平板，篩選轉(zhuǎn)化子。同時，將未篩選的原始抗體基因片段也進行轉(zhuǎn)化篩選。隨機挑取100 個篩選基因表達(dá)的陽性重組子和50個原始基因文庫表達(dá)的陽性重組子接種至含50 μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，A600值達(dá) 0.6 時，加入0.2 mmol／L IPTG，30 ℃誘導(dǎo) 8 h。用 Ni?NTA 親和層析柱進行純化，具體操作參考說明書進行。

1.8 單鏈抗體篩選 采用ELISA法檢測抗體蛋白。設(shè)抗原組、空白對照組和陰性對照組［15］，每組均設(shè)5 個平行試驗。用10 μg／mL FZD?OVA包被酶標(biāo)板，4 ℃反應(yīng)過夜，空白對照組包被PBS 緩沖液，陰性對照組包被OVA溶液；PBST洗滌3次，200 μL／孔，5 min／次，加入5%脫脂奶，200 μL／孔，室溫封閉2 h；加入抗體蛋白（1∶2 000 稀釋），100 μL／孔，37 ℃反應(yīng)2 h；PBST 洗滌 3 次，加入 HRP 標(biāo)記的抗 His?tag 標(biāo)簽抗體（1∶2 000稀釋），100 μL／孔，37 ℃反應(yīng)1 h；PBST洗滌3次，5 min／次，加入底物TMB，100 μL／孔，37 ℃避光反應(yīng)30 min；加入終止液，100 μL／孔，酶標(biāo)儀測定A450值。對獲得的高親和力陽性克隆子進行大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化，并進行5%SDS?PAGE鑒定。

1.9 單鏈抗體親和力分析 以FZD?OVA 作為包被抗原，采用間接競爭 ELISA 法檢測抗體親和力［16?17］。用10 μg／mL FZD?OVA 包被酶標(biāo)板，4 ℃反應(yīng)過夜；加入5%脫脂奶，200 μL／孔，室溫封閉2 h；將FZD標(biāo)準(zhǔn)品溶液從100 ~ 1 ng／mL 進行倍比稀釋［10］，與單鏈抗體（1∶50稀釋）等體積混合，每孔加入100 μL混合液，37 ℃反應(yīng)2 h；棄混合液，洗滌3 次，加入HRP標(biāo)記的抗His?tag 抗體（1∶2 000稀釋），100 μL／孔，37 ℃反應(yīng)1 h；加入底物TMB，100 μL／孔，37 ℃避光反應(yīng)30 min；加入終止液，200 μL／孔，酶標(biāo)儀測定A450值［18?19］。結(jié)果判定：以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，結(jié)合率為縱坐標(biāo)繪制競爭曲線，按下式計算抑制率為50%時混合液中FZD的標(biāo)準(zhǔn)濃度即為競爭抑制率IC50，以此判斷抗體特異性。

結(jié)合率（%）=（A-A空白）／（A0-A空白）×100%；

抑制率（%）=100-結(jié)合率（%）

式中A為不同抗原濃度的吸光值；A0為不加抗原的吸光值；A空白為不加抗原、不加單鏈抗體的吸光值。

1.10 單鏈抗體的交叉反應(yīng)性分析 采用間接競爭ELISA 法測定單鏈抗體與競爭物的交叉反應(yīng)性。分別將呋喃妥因、呋喃它酮、FZD 代謝物、呋喃西林及其衍生物5 種結(jié)構(gòu)類似物標(biāo)準(zhǔn)液從100 ~ 1 ng／mL進行倍比稀釋后作為被檢抗原［20］，繪制各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出IC50值，步驟同1.9 項。5 種結(jié)構(gòu)類似物的IC50與FZD的比值即為交叉反應(yīng)率（%）。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，空白組和實驗組間的親和力比較采用F檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單鏈抗體文庫的鑒定 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約600 bp 的輕鏈可變區(qū)基因片段VL?linker和約400 bp 的重鏈可變區(qū)基因片段VH?linker，見圖1。

圖1 抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)擴增后產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of amplified products of variable regions of VH and VL of antibody

等濃度的VH?linker和VL?linker進行 SOE?PCR 拼接反應(yīng)，擴增完整的單鏈抗體片段，連接后的完整片段大小約1 000 bp，見圖2。

圖2 單鏈抗體基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of PCR amplification products of single chain antibody gene

2.2 測序分析 隨機挑取10 個克隆子，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1 000 bp 處可見單一條帶，大小與目的條帶一致，初步推斷為插入了單鏈抗體DNA的陽性克隆子，見圖3。

圖3 單鏈抗體克隆子的菌落PCR電泳圖Fig.3 Colony PCR electrophoretic map of single chain antibody clones

測序結(jié)果顯示，10 條單鏈抗體序列包含了T7 啟動子、Linker 片段、VH和VL可變區(qū)，且內(nèi)部無終止密碼子，具有較好的完整性。其中，不同單鏈抗體的重鏈互補決定區(qū)（complementarity?determining regions，CDRs）包含的氨基酸數(shù)目和種類差異較大，該區(qū)域決定抗體與抗原的特異性結(jié)合，表明該單鏈抗體文庫有不同的抗體特異性，具備多樣性。

2.3 核糖體展示篩選抗體基因 以FZD?OVA為篩選抗原，每輪回收mRNA 進行下一輪擴增篩選，經(jīng)三輪篩選，約1 000 bp 處目的條帶逐漸變亮，空白對照組和陰性對照組均未擴增出目的條帶，見圖4。表明在逐輪篩選過程中，針對抗原FZD?OVA 的目的基因得到了有效富集。

圖4 每輪核糖體展示篩選后目的基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic map of amplified products of target genes after each round of ribosome display screening

2.4 ELISA 法篩選陽性克隆子 原始文庫中隨機挑取的克隆子A450值較低，表明表達(dá)的蛋白特異性較低，很難獲得高親和力菌株。經(jīng)核糖體展示重復(fù)篩選后，約1／5 的克隆子表達(dá)產(chǎn)物A450值較高，顯示與抗原FZD?OVA 具有較好的特異性，其中3 株抗體FZD?ScFv1、FZD?ScFv2和FZD?ScFv3均具有較高的A450值。見圖5 和圖6?？瞻讓φ战M和陰性對照組A450值均低于0.2，而3 株單鏈抗體的A450均高于空白對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.682，P<0.05），表明3株單鏈抗體對抗原FZD具有一定的親和力。

圖5 ELISA法檢測原始文庫的單鏈抗體活性Fig.5 Detection of single chain antibody activity in original library by ELISA

圖6 ELISA 法檢測核糖體展示篩選基因表達(dá)的單鏈抗體活性Fig.6 Detection of single chain antibody activity of ribo?somal display screening gene by ELISA

2.5 表達(dá)及純化的FZD?ScFv1的鑒定 對特異性最高的單鏈抗體株FZD?ScFv1 進行大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化后，經(jīng)5%SDS?PAGE分析，在相對分子質(zhì)量約35 000處可見單一目的條帶，大小與預(yù)期相符，見圖7。

圖7 單鏈抗體株FZD?ScFv1的SDS?PAGE分析Fig.7 SDS?PAGE analysis of single chain antibody strain FZD?ScFv1

2.6 單鏈抗體FZD?ScFv1 的親和力分析 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=42.24x+2.930 2（R2=0.990 2），當(dāng)抑制率為50%時，IC50值為13.01 ng／mL。

2.7 單鏈抗體FZD?ScFv1 的交叉反應(yīng)性分析 單鏈抗體FZD?ScFv1 與呋喃它酮、呋喃妥因、氨基脲、呋喃西林及其衍生物之間的交叉反應(yīng)率分別為0.03、0.16、0.08、0.1和0.22，均小于1%，表明獲得的單鏈抗體FZD?ScFv1與FZD具有較好的特異性。

3 討論

抗體工程的發(fā)展主要經(jīng)歷了多抗、單抗和基因重組抗體3 個階段。單鏈抗體就是利用基因工程重組技術(shù)通過連接肽將抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)進行拼接的重組蛋白，其具有相對分子質(zhì)量小、穿透力強、可在多種宿主中表達(dá)的特點，可滿足生產(chǎn)成本低的大規(guī)模生產(chǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［21?22］。但其應(yīng)用于動植物病害的診斷、預(yù)防及農(nóng)獸藥殘留檢測方面的報道較少。

本研究利用核糖體展示技術(shù)篩選抗FZD 單鏈抗體基因片段，對其進行誘導(dǎo)表達(dá)，并對表達(dá)產(chǎn)物的有效性進行了探索，結(jié)果顯示，小鼠重鏈可變區(qū)VH大小約 400 bp，輕鏈可變區(qū)VL大小約 600 bp，經(jīng)linker拼接后目的基因約1 000 bp。測序結(jié)果表明，抗體文庫容量大，具備多樣性，可用于進一步的篩選。通過TNT T7 Quick for PCR DNA 無細(xì)胞系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生單鏈抗體?核糖體?mRNA 三元復(fù)合體。以FZD?OVA 為抗原進行親和篩選，回收 mRNA 用于下一輪篩選。經(jīng)三輪篩選后，目的基因片段條帶逐漸變亮，得到了富集。

將原始基因片段與經(jīng)過篩選的基因片段雙酶切后，分別與載體pET?28a（+）連接并轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta（DE3）進行誘導(dǎo)表達(dá)，間接ELISA法測定表達(dá)產(chǎn)物與FZD 的特異性。結(jié)果表明，經(jīng)過篩選后挑取的克隆子，約20%表達(dá)出的目的蛋白與抗原有較好的結(jié)合能力，選擇其中親和力最高的單鏈抗體FZD?ScFv1進行下一步鑒定。

對FZD?ScFv1 菌株的表達(dá)條件進行探索，并進行大量表達(dá)及純化。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS?PAGE 分析，在相對分子質(zhì)量約35 000處可見目的條帶。

間接競爭ELISA法檢測FZD?ScFv1的親和力，得出IC50值為13.01 ng／mL。同樣基于間接ELISA 法測定FZD?ScFv1的特異性，選擇5種硝基呋喃類抗生素作為競爭物，結(jié)果顯示，交叉反應(yīng)率均小于1%。

綜上所述，與之前制備的單克隆抗體（交叉反應(yīng)率均低于0.01%）相比［10］，本研究制備的單鏈抗體的IC50和交叉反應(yīng)率稍低，但足以滿足檢測需求，且利用核糖體展示技術(shù)構(gòu)建及篩選的單鏈抗體均在體外完成，操作簡單，制備所需時間較短。因此，可進一步建立基于抗FZD 單鏈抗體的間接競爭ELISA 法，從穩(wěn)定性、檢測限等方面與基于單克隆抗體的檢測法進行比較，為單鏈重組抗體應(yīng)用于檢測農(nóng)獸藥殘留奠定基礎(chǔ)。