牙鲆芳香化酶Cyp19a多克隆抗體制備及其應用

舒 暢, 王麗娟, 鄒聰聰, 鄒玉霞, 王國玉, 吳志昊, 李 澤, 尤 鋒

牙鲆芳香化酶Cyp19a多克隆抗體制備及其應用

舒 暢1, 2, 3, 王麗娟1, 2, 鄒聰聰1, 2, 3, 鄒玉霞1, 2, 王國玉1, 2, 吳志昊1, 2, 李 澤1, 2, 3, 尤 鋒1, 2

(1. 中國科學院 海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室 海洋大科學中心 山東省實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生物學與生物技術(shù)功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

芳香化酶Cyp19a在魚類性別決定和性別分化中起關(guān)鍵作用, 通過調(diào)控體內(nèi)雌、雄激素的轉(zhuǎn)化來影響魚類性別表型形成。為深入研究Cyp19a在牙鲆()性腺分化和發(fā)育過程中的表達規(guī)律及作用機制, 本文從牙鲆cDNA中克隆獲得1 557 bp的基因編碼序列, 并成功構(gòu)建了原核重組表達質(zhì)粒。經(jīng)體外重組與純化獲得較高純度的重組Cyp19a蛋白; 以此作為抗原免疫兔子, 制備多克隆抗體。用間接酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)技術(shù)檢測抗血清效價, 評估其免疫原性。結(jié)果表明免疫結(jié)束后得到的抗體血清效價超過了1∶50 000, 且純化后抗體具有較好活性。Western Blot (WB)檢測結(jié)果表明Cyp19a兔多抗可以特異性識別牙鲆重組Cyp19a蛋白和內(nèi)源性Cyp19a蛋白。蛋白水平的雌雄性腺差異表達分析顯示, 牙鲆Cyp19a蛋白在卵巢中高表達, 在精巢中微量表達。利用Foxl2和Dmrt1重組蛋白處理牙鲆性腺分化期幼魚可分別顯著上調(diào)和下調(diào)Cyp19a的表達(<0.05)。綜上所述, 本研究成功制備了牙鲆Cyp19a多克隆抗體并進行了應用, 為深入研究牙鲆等魚類性別分化機制提供有力工具。

牙鲆(); Cyp19a; 重組蛋白; 多克隆抗體; 蛋白表達

芳香化酶是細胞色素P450(cytochrome P450)家族的成員之一, 是參與性激素轉(zhuǎn)換的重要酶類, 由編碼, 可以催化睪酮(T)生成雌二醇(E2), 也可以催化雄烯二酮(A)生成雌酮(E1)[1]。雌激素在魚類卵巢分化和發(fā)育中起重要作用, 而轉(zhuǎn)錄水平和芳香化酶的活性將直接影響到內(nèi)源雌激素的水平[2]。斑馬魚()中, 敲除基因會導致幼魚體內(nèi)雌激素水平降低, 卵巢消失[3]; 而外源雌激素處理會使的表達量增加, 出現(xiàn)雌性偏倚[4]。在多數(shù)魚類中, 如虹鱒()、歐鱸()和尼羅羅非魚()等,在性腺分化早期體細胞的前體細胞中開始表達, 在卵巢形成后的顆粒細胞中高表達, 暗示其通過調(diào)控雌激素的合成, 進而維持卵巢體細胞分化和卵母細胞發(fā)育[5-6]。研究表明, 魚類的表達受到Foxl2、Dmrt1等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[7], Foxl2可激活的轉(zhuǎn)錄活性, 在卵巢分化與發(fā)育過程中發(fā)揮作用, 而Dmrt1可拮抗Foxl2, 抑制的表達, 參與魚類雄性性別決定和分化[8-9]。

的功能作用形式是酶, 蛋白水平的研究能夠更精確地解釋其生物學功能, 對于探索其在魚類雌性或雄性表型形成中的直接作用至關(guān)重要。利用商業(yè)化抗體對斑馬魚和銀鯽()等魚類中Cyp19a蛋白表達定位進行分析顯示, 其存在性別二態(tài)性表達, 卵巢中表達量高于精巢; 在卵巢分化早期和發(fā)育期也主要表達在體細胞中, 后者主要表達在卵母細胞周圍的顆粒細胞中[10-11], 說明Cyp19a在早期雌性性別分化中有著重要作用。尼羅羅非魚中, 利用重組蛋白制備了Cyp19a特異性抗體, 通過Western Blot(WB)分析了高溫誘導性腺分化過程中Cyp19a表達的變化[12]。但魚類抗體相對開發(fā)較少, 其特異性也存在物種差異, 所以, 魚種特異的抗體仍舊很缺乏, 這也在很大程度上限制了魚類蛋白水平研究的開展。Cyp19a也是如此, 目前魚類Cyp19a相關(guān)研究主要集中在生理生化性質(zhì)預測, 以及利用商用或自行制備抗體進行的少數(shù)物種成體表達模式分析等, 功能研究幾乎還未涉及。多克隆抗體可應用于免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)、酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫組化(immuno-cyto-che-mistry, IHC)、WB等實驗, 以及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)、蛋白表達圖譜、蛋白定性與定量等功能研究[13], 已成為蛋白研究的重要工具。因此, 為了明確Cyp19a蛋白水平的作用方式, 亟待進行其重組及特異性抗體的制備。

牙鲆()隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、牙鲆科(Paralichthyidae)、牙鲆屬(), 是中國及日韓重要的海水養(yǎng)殖魚類[14]。其生長存在明顯的性別二態(tài)性, 雌性生長顯著快于雄性, 研究其性別調(diào)控機制不僅具有理論價值也有實踐意義。牙鲆在雌雄性腺中存在差異表達, 卵巢中表達較高[15]。然而, 牙鲆相關(guān)研究也主要集中在mRNA水平, 例如基因表達、DNA甲基化關(guān)聯(lián)分析以及轉(zhuǎn)錄因子對其調(diào)控作用等[16-17], 蛋白水平的研究幾乎未見報道。本研究構(gòu)建了牙鲆Cyp19a原核表達質(zhì)粒, 經(jīng)表達和純化獲得了重組蛋白, 以此為抗原制備了Cyp19a兔多克隆抗體, 并分析了Foxl2和Dmrt1重組蛋白對Cyp19a表達的影響, 以期為精確研究Cyp19a在牙鲆等魚類性別決定與分化中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

成體雌雄牙鲆(358.5～562.5 g)購買于青島南山市場, 在中國科學院海洋研究所水族樓魚類培育室暫養(yǎng)7 d。期間每天投喂適口餌料2次, 換水2次。暫養(yǎng)結(jié)束后, 隨機選取3尾雌魚和3尾雄魚, 用100 pmol/L間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate, MS-222, Sigma, 美國)麻醉, 采集卵巢和精巢組織。樣品液氮速凍后, 置于–80 ℃超低溫冰箱冷凍保存, 用于后續(xù)RNA和蛋白提取。

從日照凌躍水產(chǎn)養(yǎng)殖基地購買80尾雌性牙鲆幼魚(32.0～43.5 g)暫養(yǎng)7 d后用于腹腔注射。魚苗腹腔注射所用人工雌核發(fā)育牙鲆在威海圣航水產(chǎn)科技有限公司進行誘導, 誘導方法及參數(shù)參照本實驗室已有報道[18], 受精卵孵化后培育至全長(total length, TL)1.2～1.5 cm 時, 將其運至海洋研究所魚類培育室暫養(yǎng)7 d。期間供應充氣海水, 每天定期換水2～3次, 培育水溫19～20 ℃, DO≥6 mg/L, 投喂商用餌料5～6次。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol (Toroivd, 英國)法提取樣品總RNA, 通過NanoDrop 2000分光光度計和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)(Yeasen, 中國)合成第一鏈cDNA, 操作步驟按照說明書進行。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白重組

基于轉(zhuǎn)錄組[15]和基因組數(shù)據(jù)(GeneBank accession no. XM_020079905.1), 獲得牙鲆編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)。利用SnapGene 6 (https://www. snapgene.com/)和Primer 3 (https://www.yeastgenome. org/primer3)設(shè)計的含同源臂的特異性引物Cyp19a-F: 5′-ATGGATCGGATCCCTGCCTG-3′, Cyp19a-R: 5′-GAGT GTTTGCCAGCTTCCTC-3′, PCR擴增牙鲆基因的編碼區(qū)。PCR反應體系為25 μL, 按照2×Pfu Master Mix(康為世紀, 中國)的說明書配制。其反應程序為: 94 ℃預變性2 min; 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 共35個循環(huán); 72 ℃終延伸5 min。反應結(jié)束后, 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 目的片段經(jīng)膠回收試劑盒Gel Extraction Kit D2500 (Omega, 美國)回收后, 交由睿博興科生物技術(shù)(北京)有限公司進行雙向測序。

利用限制性內(nèi)切酶R-V(TaKaRa, 日本)按照說明書對表達載體pET-30a (+)(Solarbio, 中國)進行酶切。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 用前述膠回收試劑盒進行膠回收。按照同源重組試劑盒Sea-mless Assembly Cloning Kit (Clone Smarter, 美國)說明書, 將純化后的PCR產(chǎn)物與pET-30a線性化載體進行同源重組, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α (TransGen, 中國)感受態(tài)細胞, 過夜培養(yǎng)后, 挑取10個單克隆菌落進行菌液PCR檢測。PCR反應體系為25 μL, 按照2×Es Taq Master Mix(康為世紀, 中國)的說明書配制。其反應程序為: 94 ℃預變性2 min; 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min 30 s, 共35個循環(huán); 72 ℃終延伸2 min。反應結(jié)束后, 送至睿博興科生物技術(shù)(北京)有限公司進行測序鑒定, 測序正確的重組質(zhì)粒交由武漢金開瑞生物工程有限公司進行體外重組與純化。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達感受態(tài)細胞, 宿主菌經(jīng)IPTG (1 mmol/L)誘導后, 獲得重組目的蛋白。菌體超聲破碎后, 利用His-Tag鎳柱親和層析法對重組蛋白進行純化, 10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)檢測表達和純化質(zhì)量。

1.4 Cyp19a多克隆抗體制備

將純化后的重組蛋白與弗氏完全佐劑(Sigma, 美國)等體積混合, 徹底乳化。選擇2只健康兔子作為免疫動物, 免疫前采血作為陰性對照。采用皮下注射接種, 第1天免疫劑量為0.5 mg, 第14、28和42天加強免疫, 劑量減至0.3 mg。在第35、49和56天時采血, 離心分離血漿。采用間接ELISA法測定抗血清效價, 抗原以2 μg/mL的濃度進行包被, 免疫前血清按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000倍比稀釋后作為陰性對照, 待檢樣品按1∶2 000、1∶4 000作梯度稀釋至1∶65 536 000, 稀釋液作為一抗用于效價測定。利用 Protein G親和層析柱(匯研生物, 中國)從最后1次采集的血清中純化兔多抗。

1.5 抗體特異性檢測

利用放射免疫沉淀測定(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解緩沖液(Solarbio, 中國)提取牙鲆性腺總蛋白。用制備的anti-Cyp19a (1∶2 000)作為一抗和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記羊抗兔IgG抗體(1∶6 000, BBI, 中國)作為二抗進行WB檢測所獲得抗體的特異性。β-tubulin (1∶2 000, ZEN-BIO, 中國)用作內(nèi)參。將Cyp19a重組蛋白和牙鲆性腺組織蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE后, 置半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀(Bio-Red, 美國)轉(zhuǎn)印至硝化纖維素(nitrocellulose, NC)膜(Amersham, 英國)上, 用無蛋白快速封閉液(Epizyme, 中國)室溫封閉15～20 min, 一抗和二抗分別在4 ℃孵育過夜和室溫孵育2 h。采用化學發(fā)光試劑(electrochemiluminescence, ECL, Solarbio, 中國)檢測并拍照。

1.6 Foxl2和Dmrt1重組蛋白的腹腔注射

利用本實驗室先前已體外重組、純化并驗證活性的Foxl2、Dmrt1和EGFP蛋白[19], 以腹腔注射方式處理雌性牙鲆幼魚及性腺分化期魚苗。將80尾暫養(yǎng)雌性牙鲆幼魚隨機分為4組: Foxl2、Dmrt1和EGFP重組蛋白處理組及未處理對照組, 每組20尾。在第0、2和4天用-jetPEI轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus, 美國)轉(zhuǎn)染重組蛋白, 注射濃度均為100 μg/g體質(zhì)量, 第5天收集樣品。50 pmol/L MS-222麻醉后, 取其性腺, 置于液氮中速凍, 然后保存在–80 ℃冰箱中, 用于蛋白表達分析。

將性腺分化期魚苗隨機分為4組, Foxl2、Dmrt1和 EGFP重組蛋白處理組及未處理組, 置于90 L培育箱內(nèi), 每箱150尾, 每組2個重復。每7 d分別將重組蛋白Foxl2、Dmrt1和EGFP與轉(zhuǎn)染試劑- jetPEI一起進行腹腔注射。注射時期覆蓋其性腺分化敏感期: 雌性, 1.5～4.5 cm TL; 雄性, 1.5～7.0 cm TL[20]。1.2～1.5 cm TL注射濃度為10 μg/尾, 并在3.0 cm TL后隨魚苗的生長成比例增加, Foxl2組在4.5 cm TL增加至30 μg/尾, Dmrt1組在7.0 cm TL增加至100 μg/尾。EGFP組注射濃度與實驗組保持一致, 一半魚苗在4.5 cm TL時隨Foxl2組停止注射, 而另一半魚苗隨Dmrt1組注射至7.0 cm TL。在魚苗3.0、6.0和10.0 cm TL時采集各組樣品。魚苗用5 pmol/L MS-222麻醉后, 進行樣品采集, 對于3.0 cm TL的個體, 取性腺區(qū)域, 6.0和10.0 cm TL的個體取性腺組織, 液氮速凍后, 在–80 ℃冰箱中保存, 用于蛋白表達分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆cyp19a基因克隆

根據(jù)已有轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù), 獲取并驗證牙鲆序列。以牙鲆性腺cDNA為模版, 進行PCR擴增, 得到目的片段。利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 可見約為1 600 bp(圖1)的條帶。測序后, 得到1 557 bp的牙鲆編碼區(qū)序列, 將其重組至pET-30a表達載體, 并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞, 測序正確的質(zhì)粒進行后續(xù)蛋白體外重組。

圖1 牙鲆cyp19a基因的PCR擴增結(jié)果

2.2 重組Cyp19a蛋白的表達和純化

SDS-PAGE結(jié)果顯示, 與未經(jīng)誘導的對照組相比, 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)誘導后, 在約74 kD的位置出現(xiàn)一條高表達的特異蛋白譜帶(圖2a), 推測為重組目的蛋白。Cyp19a重組蛋白大部分表達于沉淀中, 主要以不溶性包涵體形式存在。經(jīng)His-tag鎳柱親和層析法分離純化的重組蛋白, SDS-PAGE電泳檢測顯示在74 kD位置有一條清晰的條帶, 且重組蛋白具有較高純度(圖2b)。

圖2 牙鲆Cyp19a蛋白的原核表達與純化

注: a. 蛋白表達的SDS-PAGE檢測結(jié)果; b. 蛋白純化的SDS- PAGE檢測結(jié)果; M. marker; PNI. 未經(jīng)誘導的沉淀; P. 沉淀; S. 上清; 1-3. 洗脫蛋白

a. SDS-PAGE analysis of protein expression; b. SDS-PAGE analysis of protein purification; M. marker; PNI. Non-induced recipitation; P. induced precipitation; S. induced supernatant; 1-3 eluted target proteins

2.3 Cyp19a多克隆抗體制備及其特異性檢測

2.3.1 抗血清效價檢測

經(jīng)2只健康兔子免疫后, 收集血清利用ELISA檢測效價。如圖3所示, 陰性對照值均在0.1以下, 2只兔子的抗血清稀釋度分別為128 000和256 000時, OD450值仍在0.5以上或接近0.5, 此時待測抗體值與陰性對照值之比大于2.1, 抗血清的效價均超過了1∶50 000, 說明體外重組純化的Cyp19a重組蛋白可誘導兔子產(chǎn)生較好的免疫效果。

圖3 ELISA檢測牙鲆Cyp19a兔多抗血清效價

注: Line 1和Line 2. 第1只兔子血清; Line 3和Line 4. 第2只兔子血清; 第1列. 空白對照; 第2-3列. 陰性對照; 第4-12列. 待測樣品; 表中為相應的稀釋倍數(shù)下測定的抗血清效價

Line 1 and Line 2. 1st rabbit serum; Lines 3 and 4. 2nd rabbit serum; Column 1. blank control; Columns 2-3. negative control; Columns 4-12. positive sample; The following table shows the antiserum titers determined at the corresponding dilutions

2.3.2 抗體純化及效價測定

利用SDS-PAGE電泳檢測抗體純化效果, 結(jié)果顯示, 多克隆抗體在約55 kDa和25 kDa的位置出現(xiàn)了重鏈和輕鏈, 雜蛋白較少(圖4), 說明Cyp19a抗體能夠較好地從血清中分離出來, 且具有較高純度。

利用ELISA對純化后的抗體進行效價測定。純化后抗血清稀釋度為256 000時, OD450值仍可以維持在0.5以上, 此時待測抗體值與陰性對照值之比大于2.1(圖5)。純化后抗血清的效價超過1∶50 000, 說明純化后的抗體具有較好活性, 可用于后續(xù)相關(guān)實驗。

圖4 Cyp19a純化抗體的SDS-PAGE檢測

M. marker; R1-R2. 純化抗體

R1-R2. purified antibodies

圖5 ELISA 檢測純化抗體效價

2.3.3 Cyp19a抗體特異性檢測

利用WB鑒定純化抗體對重組蛋白的特異性。以免疫前血清作為陰性對照, 結(jié)果顯示, 抗體能與重組蛋白特異性識別, 且條帶單一, 與預期大小相符(圖6a)。進一步利用牙鲆卵巢和精巢的總蛋白進行內(nèi)源性檢測, 也為單一條帶, 表明制備的牙鲆Cyp19a抗體具有特異性。結(jié)果還顯示Cyp19a蛋白主要在卵巢表達, 精巢中表達量較低(圖6b)。

圖6 Cyp19a的抗體特異性及雌雄性腺二態(tài)性表達

注: a. 重組蛋白; b. 牙鲆性腺; β-tubulin. 內(nèi)參蛋白

a. recombinant protein; b. gonads of the flounder; β-tubulin. reference protein

2.4 Foxl2和Dmrt1重組蛋白對Cyp19a表達的影響

雌性牙鲆幼魚腹腔注射重組Foxl2和Dmrt1蛋白后, 第5天性腺樣品的WB檢測結(jié)果顯示, 未處理組和EGFP重組蛋白處理組間Cyp19a蛋白的表達無顯著差異。與EGFP組相比, 重組Foxl2蛋白略微上調(diào)Cyp19a的表達, 而Dmrt1蛋白略微下調(diào)Cyp19a的表達, 但均不具有顯著性差異(圖7)。

對分化期魚苗各處理組和未處理組的Cyp19a蛋白表達水平進行分析。結(jié)果如圖8所示, EGFP組的Cyp19a表達水平與未處理組相比沒有顯著差異, 而用Foxl2重組蛋白處理, 會使Cyp19a的表達維持在一個較高水平, 且在6.0 cm TL時存在顯著差異(<0.05); 而Dmrt1處理組中, Cyp19a表達水平在3.0 (0.05)、6.0(0.01)和10.0 cm TL(0.001)均顯著降低。

圖7 重組Foxl2和Dmrt1蛋白注射雌性牙鲆幼魚后Cyp19a蛋白水平變化(n =3)

圖8 重組Foxl2和Dmrt1蛋白注射牙鲆分化期魚苗后Cyp19a蛋白水平變化(n =3)

注: a. 3.0 cm TL; b. 6.0 cm TL; c. 10.0 cm TL; β-tubulin. 內(nèi)參蛋白; 星號代表組間的顯著差異, *.<0.05; **.<0.01; ***.<0.001

β-tubulin. Reference protein; The star represents significant difference between groups

3 討論

本研究通過體外重組與純化獲得牙鲆Cyp19a重組蛋白, 并利用其制備了多克隆抗體。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有高效、方便且成本低的優(yōu)勢, 常用于體外重組蛋白[21]。本研究中, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達感受態(tài)細胞后, 經(jīng)IPTG誘導能夠獲得重組目的蛋白。外源蛋白在原核細胞的表達形式分為可溶性表達和包涵體表達, 其中, 包涵體蛋白雖然是非折疊狀態(tài)的聚集體, 不具有生物學活性, 但具有純度較高、表達量大等優(yōu)勢, 在純化過程中加入尿素促進其溶解后, 便能獲得較好的純化效果[22], 可用于抗體制備和后續(xù)研究。本研究獲得的重組Cyp19a蛋白主要以不溶性包涵體形式存在, 且具有較高濃度和純度。金屬螯合層析技術(shù)是利用蛋白質(zhì)中部分氨基酸在中性水溶液中與特殊金屬離子發(fā)生親和吸附作用, 從而形成穩(wěn)定的絡(luò)合物進行分離的方法[23]。其中, 在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 6～8), 鎳離子能與組氨酸的咪唑基團通過靜電引力形成螯合物[24]。在本研究中, 重組Cyp19a蛋白中添加了His標簽作為純化標記物, 經(jīng)鎳柱親和層析法純化后的重組蛋白在SDS-PAGE電泳中雜蛋白較少。實驗結(jié)果也說明該體外重組和純化策略簡單有效。

多克隆抗體是由多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的, 受到多種抗原決定簇刺激并可與多種抗原表位結(jié)合的抗體, 存在于免疫動物的血清中, 能夠通過直接分離血清獲得[25]。其制備過程相對較為簡單, 免疫動物鼠、兔等經(jīng)2～4次免疫, 收集抗血清, ELISA檢測抗血清效價后, 經(jīng)純化即可獲得多克隆抗體。制備方法高效、特異性良好、成本低且穩(wěn)定性好, 已在多個科研和生產(chǎn)領(lǐng)域得到應用[26]。如利用該方法獲得了尼羅羅非魚特異性鼠源Cyp19a抗體, 并用于分析該蛋白在雌雄性腺中的表達規(guī)律, 以及高溫誘導性腺分化對表達量的影響, 結(jié)果顯示Cyp19a主要在卵巢中表達, 且高溫能夠抑制體內(nèi)Cyp19a的表達[12]。斜帶石斑魚()的兔源Amh抗體, 不僅用于免疫組化研究其在石斑魚卵巢與精巢中的差異表達, 還用于其及受體AmhrII在性腺中的功能驗證[27]。本研究中, 對2只兔子進行4次免疫后, 抗血清的效價均超過了1∶50 000, 顯示牙鲆Cyp19a重組蛋白可誘導兔子產(chǎn)生較好的免疫效果。經(jīng)Protein G親和層析柱純化后的抗體, 具有較少雜蛋白, 純度較高, 且效價與抗血清一致, 表明獲得了具有較高活性的兔源牙鲆Cyp19a多克隆抗體。抗體特異性檢測結(jié)果顯示, Cyp19a多克隆抗體能特異性地識別牙鲆Cyp19a重組蛋白, 說明該抗體具有良好的免疫學活性; 進一步的內(nèi)源性驗證結(jié)果顯示, 制備的Cyp19a兔多抗在牙鲆性腺中為單一條帶, 說明制備獲得的Cyp19a抗體可為深入研究牙鲆Cyp19a蛋白的生物學特性和功能提供分子工具。但是, 該抗體是否適用于其他鲆鰈魚類等魚種, 還需要后續(xù)實驗進行測試。理論上, 與牙鲆Cyp19a氨基酸序列相似度高的物種有可能使用該抗體, 比如鲆鰈魚類中的漠斑牙鲆(, 97.94%)、庸鰈(, 95.30%)和大菱鲆(, 88.38%)(GenBank accession nos. AAX55671.1、XP_034428940.1和XP_035483362.2)等。然而, 魚類基因組復制等復雜性, 在一種魚類中適用的Cyp19a抗體并不一定適用于另一些魚類。因此, 魚類中開展Cyp19a蛋白水平的研究多使用自行制備的特異性抗體, 如尼羅羅非魚[28]、大西洋鮭()[29]和革胡子鯰()[30]等。

在魚類中, 芳香化酶Cyp19a作為關(guān)鍵的雌激素生成酶, 已被證實在卵巢分化和維持中發(fā)揮主導作用[31-32]。在牙鲆等魚類的研究發(fā)現(xiàn),主要在卵巢中表達, 在精巢中微量表達[16], 對魚類性別形成具有一定作用, 抑制基因的表達可能會導致魚類性別失衡。本研究在內(nèi)源性驗證時也發(fā)現(xiàn), Cyp19a蛋白的表達與mRNA水平一致, 主要在卵巢中表達, 精巢中低表達。轉(zhuǎn)錄因子Foxl2在魚類卵巢分化敏感階段能夠上調(diào)的表達, 同時抑制雄性通路關(guān)鍵基因表達, 使雌激素水平升高, 促進顆粒細胞分化和卵泡生成[33]。mRNA水平研究顯示,和的基因表達時序具有一定的相似性,對具有正調(diào)控作用, 其在性腺分化前便能激活的轉(zhuǎn)錄, 并在卵巢分化過程中參與轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)和維持[17, 34]。而轉(zhuǎn)錄因子Dmrt1在魚類中則通過抑制和的表達, 進而降低雌激素水平, 拮抗雌性分化, 促進精巢分化和發(fā)育, 如半滑舌鰨()的ZZ個體敲除會導致出現(xiàn)類卵巢樣的精巢[35-36]。牙鲆體外研究顯示, Foxl2與Dmrt1可以分別轉(zhuǎn)錄激活和抑制的表達[17]。本研究也發(fā)現(xiàn), 雌性牙鲆幼魚注射重組Foxl2和Dmrt1蛋白后, Cyp19a蛋白的表達分別出現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)趨勢, 但沒有顯示出顯著性, 這也許是注射劑量、注射間隔時間或檢測時間尚待優(yōu)化。根據(jù)本實驗室前期報道, 牙鲆1.5 cm TL時, 性腺尚未開始分化, 卵巢分化開始于約3.8 cm TL, 精巢分化開始于約6.3 cm TL[20], 因此, 選擇從原始性腺期開始重組Foxl2和Dmrt1蛋白的腹腔注射, 覆蓋了牙鲆卵巢和精巢分化的敏感階段, 可以對其性腺分化起到作用。組織切片觀察結(jié)果也發(fā)現(xiàn), 注射重組Foxl2和Dmrt1蛋白后, 其雌性率分別為100%和18%, 而兩個對照組(未處理組和EGFP組)的雌性率均為100%[19]。蛋白表達分析結(jié)果顯示, 在卵巢分化啟動期(3.0 cm TL), 重組Foxl2蛋白開始上調(diào)Cyp19a蛋白的表達, 在隨后的卵巢分化階段(6.0 cm TL) Cyp19a的表達保持顯著上調(diào), 并在分化后(10.0 cm TL)維持較高水平。前期mRNA研究也有類似報道, 牙鲆mRNA水平在卵巢分化啟動期3.0 cm TL時開始上調(diào)表達, 至分化后期表達仍然顯著上調(diào), 相應的雌二醇水平也明顯升高, 從而促使了卵巢腔的形成和卵巢的分化[16, 19, 37]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果, 在卵巢分化啟動期(3.0 cm TL), 重組Foxl2蛋白顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄水平, 并略微上調(diào)Cyp19a蛋白的表達和體內(nèi)17β-雌二醇水平, 隨后的性腺分化期間也可檢測到較高水平的轉(zhuǎn)錄水平、Cyp19a蛋白表達水平和17β-雌二醇水平, 研究結(jié)果與已有報道的假設(shè)一致[38]。進一步說明了Foxl2蛋白對的上調(diào)不僅是啟動卵巢分化所必需的, 也是維持卵巢分化所必需的。在尼羅羅非魚、斑馬魚等魚類中已證實,在性腺分化早期開始表達, 對基因具有負調(diào)控作用, 使始終維持在較低轉(zhuǎn)錄水平, 可拮抗雌激素的合成, 阻斷雌性化通路[39-40]。本研究中, Dmrt1處理組的Cyp19a蛋白表達在處理期間(即精巢分化的前、中、后期)也始終維持較低水平, 表明Dmrt1的確通過抑制芳香化酶Cyp19a的表達, 參與雄性性別表型的形成。

4 結(jié)論

本研究成功獲得牙鲆Cyp19a重組蛋白, 以此作為抗原, 用弗氏佐劑為免疫增強劑, 經(jīng)4次免疫后獲得可特異性識別牙鲆Cyp19a蛋白的多克隆抗體, 且效價較高。利用該抗體分析Cyp19a蛋白在牙鲆雌雄性腺的表達, 發(fā)現(xiàn)其在卵巢中的表達明顯高于精巢。性腺分化期幼魚腹腔注射結(jié)果表明, 重組Foxl2和Dmrt1蛋白可分別顯著上調(diào)和下調(diào)Cyp19a蛋白的表達。研究結(jié)果將為更深入研究Cyp19a在魚類性腺分化和發(fā)育中的作用提供基礎(chǔ)和有效工具。

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Polyclonal antibody preparation and application of aromatase Cyp19a in olive flounder

SHU Chang1, 2, 3, WANG Li-juan1, 2, ZOU Cong-cong1, 2, 3, ZOU Yu-xia1, 2,WANG Guo-yu1, 2, WU Zhi-hao1, 2, LI Ze1, 2, 3, YOU Feng1, 2

(1. CAS and Shandong Province Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Center for Ocean Mega-Science, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Aromatase Cyp19a plays a key role in fish sex determination and differentiation and could affect fish sex phenotype by regulating the conversion of estrogen and androgen. To further examine the expression and role of Cyp19a in gonadal differentiation and development of olive flounder, the coding sequence of thegene with the full length of 1, 557 bp was obtained from its cDNA, and the plasmid encoding recombinant Cyp19a protein was constructed. Followingrecombination and purification, high-purity recombinant Cyp19a protein was obtained. The protein was used as the antigen to immunize rabbits to prepare polyclonal antibodies. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay was employed to detect the titers of the anti-serum and evaluate their immunogenicity. The titers of the poly-antibodies obtained were above 1: 50, 000, and the purified antibodies had good activity. Western blot detection revealed that the rabbit poly-antibodies of Cyp19a could specifically recognize the recombinant and endogenous Cyp19a proteins in flounders. The differential expression analysis of the female and male gonads at the protein level showed that Cyp19a protein was highly expressed in the ovary and slightly expressed in the testis. The treatment with the recombinant Foxl2 and Dmrt1 proteins could significantly upregulate and downregulate the expression of Cyp19a in undifferentiated gonads (<0.05), respectively. In conclusion, this study successfully prepared and applied rabbit-derived polyclonal antibodies against Cyp19a of flounders, which provides a powerful tool for the in-depth investigation of the sex differentiation mechanism in flounders or other fish.

; Cyp19a; recombinant protein; polyclonal antibody; protein expression

Jun. 15, 2022

S917.4

A

1000-3096(2022)11-0083-11

10.11759/hykx20220615001

2022-06-15;

2022-08-24

國家自然科學基金項目(31872558); 國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0900202); 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學與生物技術(shù)功能實驗室青年科學基金項目(YQ2018NO01); 山東省重點研發(fā)計劃項目(農(nóng)業(yè)良種工程, 2021LZGC029); 山東省自然科學基金項目(ZR2022MC026)

[National Natural Science Foundation of China, No. 31872558; National Key R&D Program of China, No. 2018YFD0900202; Youth Research Fund of Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), No. YQ2018NO01; The Key Research and Development Program of Shandong Province, No. 2021LZGC029; Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2022MC026]

舒暢(1997—), 女, 山東濱州人, 碩士研究生, 主要從事海水魚類發(fā)育生物學研究, E-mail: shuchang@qdio.ac.cn; 王麗娟(1987—),通信作者, E-mail: wanglijuan@qdio.ac.cn; 尤鋒(1963—), 通信作者, E-mail: youfeng@qdio.ac.cn

(本文編輯: 譚雪靜)