狼瘡性腎炎潛在蛋白質(zhì)生物標志物的生物信息學分析

劉南池,王雁飛,周燕,魏玉嬌,秦雙,馬瑞霞

(青島大學附屬醫(yī)院腎病科,山東 青島 266000)

狼瘡性腎炎(LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人常見且嚴重的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致腎衰竭和病人死亡的重要原因[1]。LN的發(fā)病除了與免疫混合物的形成、細胞因子異常有關(guān)以外，還具有明顯的遺傳相關(guān)性。然而，迄今確定的眾多與LN相關(guān)基因只解釋了20%的疾病遺傳性[2]。缺失的遺傳性可能來自基因和環(huán)境(病毒感染、藥物作用等)之間復(fù)雜的相互作用，以及基因表達的調(diào)控被破壞等[3]。因此，探究LN相關(guān)的遺傳標志物對疾病的早期診斷和預(yù)后評估有重要意義。隨著生物信息學分析和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，整個轉(zhuǎn)錄組的基因表達譜分析越來越多地被用于探索致病相關(guān)基因、對不同類型的疾病進行分類和預(yù)測臨床轉(zhuǎn)歸[4]。然而，目前對SLE和LN的生物信息學分析研究還很少。本研究選取GSE32591的數(shù)據(jù)集，確定LN病人中差異表達基因(DEGs)，并對DEGs進行基因本體(GO)分析和KEGG分析，使用Cytoscape軟件構(gòu)建DEGs的蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測其中的核心基因及發(fā)揮調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，為探討LN的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

以“Lupus Nephritis”為關(guān)鍵詞，在基因表達綜合(GEO)數(shù)據(jù)庫[5](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索數(shù)據(jù)集，篩選標準：①芯片研究類型為表達譜芯片；②無其他干預(yù)措施；③樣本分組為正常組和疾病組；④提供基因符號(Gene symbol)的注釋信息。最終選取了編號為GSE32591的項目，其數(shù)據(jù)為通過微陣列分析的微分解的腎臟活檢組織(來源于美國密西根大學)的轉(zhuǎn)錄組，共包括93例樣本。其中取自腎小管間質(zhì)組織的LN病人樣本32例，正常對照組樣本15例；取自腎小球組織的LN病人樣本32例，正常對照組樣本14例。該數(shù)據(jù)集微陣列分析是基于GPL14663 Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133A Custom CDF平臺進行的。

1.2 DEGs確定

通過GEO2R程序[6]分別確定LN樣本與正常樣本腎小管間質(zhì)和腎小球組織中的DEGs。篩選標準設(shè)定為矯正后P值<0.05，|logFold Change|≥1。然后應(yīng)用Venn圖將腎小球DEGs和腎小管間質(zhì)DEGs取交集。

1.3 功能和通路富集分析

使用DAVID[7](http://david.ncifcrf.gov/)對腎小球組織DEGs和腎小管間質(zhì)DEGs交集部分的DEGs進行GO分析和KEGG分析，明確基因富集的通路和功能，設(shè)置閾值為P<0.05，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05。GO[8]分析按照生物途徑、分子功能和細胞定位對基因進行注釋分類，KEGG[9]分析旨在通過代謝通路的分析詮釋基因功能。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用互作基因數(shù)據(jù)庫的檢索工具STRING[10](https://string-db.org/cgi/)構(gòu)建相互作用基因的網(wǎng)絡(luò)，輸入多個基因、蛋白質(zhì)名稱，得到總結(jié)了特定蛋白質(zhì)組預(yù)測關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)視圖。通過Cytoscape軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，隱藏無相關(guān)聯(lián)系基因，得到合理的布局。

1.5 網(wǎng)絡(luò)分析

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，使用Cytoscape的cytohubba插件預(yù)測核心基因[11]，結(jié)合12種算法的結(jié)果合并分析，選出其中出現(xiàn)頻數(shù)最高的基因確定為核心基因。使用Cytoscape軟件的MCODE[12]插件在龐大的蛋白網(wǎng)絡(luò)中進行基因功能模塊聚類構(gòu)建，確定高度連接的基因集。這些高度互連的區(qū)域被稱為子網(wǎng)絡(luò)。本研究設(shè)定影響子網(wǎng)絡(luò)大小的節(jié)點評分截斷值(NSC)=0.2，K-Core=2[13]。使用Cytoscape軟件的iRegulon插件預(yù)測子網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄因子[14]，所選的轉(zhuǎn)錄因子信息來自SwissRegon、Jaspar、Encode、Transfac和Hmer數(shù)據(jù)庫[15]。在分析結(jié)果中選取歸一化富集分數(shù)(NES)>10的轉(zhuǎn)錄因子，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心基因差異表達分析

在Nephroseq[16](http://www.nephroseq.org)中依次檢索確定的核心基因，設(shè)定LN為篩選條件，選擇相關(guān)研究，進行Meta分析綜合比較。

2 結(jié) 果

2.1 LN相關(guān)DEGs

在GSE32591的數(shù)據(jù)中，通過GEO2R確定了LN病人和正常對照組之間的DEGs，在腎小管間質(zhì)樣本中共確定了130個DEGs，其中有25個下調(diào)基因，105個上調(diào)基因；在腎小球樣本中共確定了352個DEGs，其中102個下調(diào)基因，250個上調(diào)基因。將腎小球和腎小管間質(zhì)的DEGs進行比較，使用Venn圖取交集，確定了66個共有的DEGs(圖1)，其中11個下調(diào)基因，55個上調(diào)基因。

G：腎小球樣本的DEGs；T：腎小管間質(zhì)樣本的DEGs。圖1 DEGs的Venn圖

2.2 功能和通路富集分析

GO分析顯示，在生物學過程層面，基因顯著富集于防御病毒、對病毒的反應(yīng)、Ⅰ型干擾素(IFN)信號通路、先天免疫反應(yīng)、病毒基因組復(fù)制的負調(diào)控、干擾素-γ介導(dǎo)的信號通路、對干擾素-β的反應(yīng)、對干擾素-α的反應(yīng)8個方面，而在細胞組分、分子功能層面未發(fā)現(xiàn)顯著富集。KEGG分析顯示，有9個基因參與甲型流感，8個基因參與單純皰疹病毒感染。見表1。

表1 GO和KEGG分析結(jié)果

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

使用STRING構(gòu)建PPI并通過Cytoscape軟件可視化，在網(wǎng)絡(luò)中，循環(huán)節(jié)點代表基因，兩個節(jié)點之間的連線代表基因之間的相互作用(圖2)。此網(wǎng)絡(luò)包括60個基因點和432條相互作用線，其中52個上調(diào)基因，8個下調(diào)基因?？梢姡诖_定的66個DEGs中有6個基因未參與構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)；并且在LN病人DEGs中，以上調(diào)表達的基因為主。

紅色為上調(diào)基因，共52個；藍色為下調(diào)基因，共8個。圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 網(wǎng)絡(luò)分析

2.4.1核心基因 應(yīng)用cytohubba的12種算法最終預(yù)測2’-5’-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、IFIT3、三聯(lián)基序22(TRIM22)、IFIT1(頻數(shù)分別為8、7、7、6)為核心基因。見表2。在MCODE插件的分析結(jié)果中，選定了評分最高的一組基因群集(MCODE評分為24.72)作為本次的研究對象，共包括26個基因、309條相互作用關(guān)系連線。在此功能模塊中，26個基因全部為表達上調(diào)的基因，且高度相互連接，在網(wǎng)絡(luò)中起到了重要作用(圖3)。其中，作用最強的基因為TRIM22、磷脂加擾酶1(PLSCR1)。

表2 cytohubba的12種算法及結(jié)果

圓形：基因，面積大小代表作用程度強弱；藍色：作用較強的基因；橙色：作用較弱的基因。圖3 核心基因子網(wǎng)絡(luò)

2.4.2轉(zhuǎn)錄因子 用Cytoscape 的iRegulon插件對子網(wǎng)絡(luò)中26個關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄因子進行分析，結(jié)果顯示，NES>10的因子分別為信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子2(STAT2)(NES=17.482，靶向=25)和STAT1(NES=16.109，靶向=23)。二者對子網(wǎng)絡(luò)中的大部分基因起直接調(diào)控作用(圖4)。

紫色表示基因，綠色表示轉(zhuǎn)錄因子。圖4 轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 核心基因的差異表達分析

用Nephroseq進一步驗證4個核心基因的表達，證實IFIT1、IFIT3、TRIM22和OAS1在LN樣本和正常樣本中的表達存在顯著差異，并且皆表現(xiàn)為過表達。表明IFIT1、IFIT3、TRIM22以及OAS1是LN中重要的上調(diào)基因。

3 討 論

本研究對DEGs的GO分析顯示，LN病程與病毒入侵有關(guān)，提示病毒免疫與自身免疫具有相關(guān)性。在慢性病毒感染期間，CD8+T細胞在抗原暴露和CD4+T細胞缺乏的共刺激下耗盡衰竭，不但使得病毒清除過程受阻礙，同時也影響了自身免疫性疾病的進展[17]。因此，在LN中病毒免疫與自身免疫密不可分。GO分析還顯示，IFN參與疾病進程，IFN是細胞對各種不同的刺激(包括接觸病毒)的反應(yīng)所產(chǎn)生的一些特殊的蛋白質(zhì)或糖蛋白，除了誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒蛋白外，還可調(diào)節(jié)許多細胞功能[18]。在SLE病人中，免疫復(fù)合物誘導(dǎo)漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)產(chǎn)生IFN，刺激B細胞分化為漿細胞，并隨著中性粒細胞和髓系細胞的激活而發(fā)展為特異性組織(如腎臟)和全身炎癥[19]。本研究發(fā)現(xiàn)的核心基因IFIT1、IFIT3、TRIM22、OAS1皆為IFN誘導(dǎo)基因，提示它們可能通過影響IFN參與LN發(fā)病。

核心基因IFIT1與IFIT3皆為含有四肽重復(fù)序列的干擾素誘導(dǎo)蛋白家族成員，屬于IFN系統(tǒng)。IFIT所編碼的蛋白受IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且主要由IFN-α/β誘導(dǎo)。IFIT家族成員通過多種機制調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，限制病毒感染，包括限制病毒RNA翻譯[20]。有研究顯示，當IFIT1與IFIT3相互作用時，可以增強其抗病毒的活性[21]。研究表明，LN中IFIT1表達與足細胞損傷有關(guān)，盡管二者之間的機制尚不清楚，但IFIT1的表達與足細胞結(jié)構(gòu)蛋白(包括F-肌動蛋白、腎素、podocin)之間的反向關(guān)聯(lián)已被證明，提示IFIT1可能參與了LN的發(fā)病[22]。OAS1是由干擾素誘導(dǎo)并編碼合成2’-5’-寡腺苷酸的核心基因，可激活潛在的核糖核酸酶L，從而導(dǎo)致病毒RNA降解并抑制病毒復(fù)制。除抗病毒外，已證明OAS1與SLE密切相關(guān)[23]，并在一定程度上影響疾病活動度。本文結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，進一步證明了這些基因在LN中具有重要作用。

位于MCODE子網(wǎng)絡(luò)中核心的PLSCR1和核心基因TRIM22皆為干擾素誘導(dǎo)基因，可能介導(dǎo)干擾素的抗病毒作用，并與免疫應(yīng)答密切相關(guān)。目前，尚無充足證據(jù)證明TRIM22在LN病程中具有直接作用，而PLSCR1是細胞激活過程中參與磷脂酰絲氨酸外化調(diào)控的關(guān)鍵分子，被證明是SLE血栓前傾向的重要因素之一[24]。本研究提示二者在LN中起正向調(diào)控作用，可能成為新的生物學靶點。

轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)節(jié)基因表達的一組蛋白。本文研究結(jié)果顯示，STAT1和STAT2是STAT家族的成員。該蛋白可以被各種配體激活，包括干擾素-α、干擾素-γ、表皮生長因子、血小板源生長因子和白細胞介素6。研究表明，STAT-Janus激酶信號通路對SLE至關(guān)重要，該通路激活導(dǎo)致STAT1的磷酸化和核移位，從而誘導(dǎo)細胞因子信號抑制物1和3的表達[25]，導(dǎo)致細胞因子失調(diào)，這也是LN的重要標志。目前正在研究的小分子JAK抑制劑用于SLE治療機制可能是由于它們抑制STAT蛋白磷酸化。本研究結(jié)果顯示，STAT1和STAT2對LN致病基因具有調(diào)節(jié)作用，提示抑制由STAT介導(dǎo)的下游信號傳導(dǎo)是LN有價值的治療選擇。

本文選擇數(shù)據(jù)集為GSE32591，由于樣本含量少，故在DEGs的富集分析中，未得到GO分析在細胞組分、分子功能層面上顯著的功能富集， LN的發(fā)生發(fā)展在基因?qū)用娴臋C制需擴大樣本量進一步研究。另一方面，該數(shù)據(jù)集的實驗樣本來源于美國人，與中國病人的基因表達有一定的差異，LN在不同人種間有不同的發(fā)病模式，因此，選擇中國LN病人的數(shù)據(jù)進行基因?qū)用娴奶剿骱苡斜匾?/p>

綜上所述，LN在腎小球和腎小管間質(zhì)中共有的DEGs有66個。GO分析和KEGG分析表明，DEGs在防御病毒、甲型流感中顯著富集。在構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測得到4個核心基因和2個轉(zhuǎn)錄因子。本文結(jié)果為確定LN診斷和治療的生物標記物提供了依據(jù)。