AML病人骨髓miRNA-106b-5p和Rab10表達(dá)及意義

徐凌悅,謝文杰,王智超,管洪在

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)系,山東 青島 266071)

急性髓細(xì)胞白血病(AML)是一種嚴(yán)重的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，常見于成年人，在兒童血液病中排名第二，其特征是未成熟髓系細(xì)胞異常增殖和分化障礙，幼稚細(xì)胞在骨髓和外周血中大量累積[1-5]。microRNA(miRNA)是大約22個核苷酸的小RNA分子，可與目標(biāo)mRNA的3′-UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平負(fù)調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)[6-9]。miRNA參與關(guān)鍵的生物過程，包括細(xì)胞的發(fā)育、分化、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡和增殖等，特定的miRNA表達(dá)模式與造血和腫瘤相關(guān)[10-12]。miRNA-106b-5p屬于miRNA家族，研究表明在多發(fā)性骨髓瘤病人中其表達(dá)水平升高[13]。Rab10蛋白是Ras超家族中具有鳥苷三磷酸酶功能的成員之一，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。近幾年的研究顯示，Rab10蛋白在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面至關(guān)重要[15]。但是miRNA-106b-5p與Rab10蛋白的關(guān)系目前尚不清楚。因此，本研究通過檢測miRNA-106b-5p和Rab10在AML病人骨髓中的表達(dá)情況，并分析二者的相關(guān)性，探討二者表達(dá)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

AML病人73例，為2020年10月—2021年8月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院血液科就診病人，診斷均符合第4版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[16]。73例病人，男34例，女39例，年齡15～85歲，平均(46±17)歲；初診病人(初診組)31例(包括M1亞型2例，M2亞型8例，M3亞型11例，M4亞型4例，M5亞型6例)，完全緩解病人42例(緩解組)。以同期在青島大學(xué)附屬醫(yī)院血液科進(jìn)行骨髓移植的健康供者15例作為對照組，其中男4例，女11例，年齡15～69歲，平均(35±19)歲。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；紫外線分光光度計(美國ABI公司)；7500型Real Time PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)；Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液、PBS緩沖液(北京索萊寶科技公司)；TRIzol(美國Invitrogen公司)；miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit(by steam-loop)、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miRNA-106b-5p和Rab10表達(dá)

使用肝素抗凝管采集AML病人及健康對照者新鮮骨髓樣本2 mL，用Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液分離出樣本中單個核細(xì)胞，用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA。使用分光光度計檢測RNA的濃度后，應(yīng)用miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit(by steam-loop)或者HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒進(jìn)行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA(莖環(huán)法，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作)。采用SYBR Green熒光染料法，以cDNA為模板，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒于Real Time PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。引物均由華大基因公司合成，序列見表1。采用2-△△CT方法計算目的基因相對表達(dá)水平。

表1 RCR所用引物及其序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組骨髓中miRNA-106b-5p和Rab10表達(dá)的比較

對照組、初診組、緩解組間miRNA-106b-5p和Rab10相對表達(dá)量比較差異有顯著性(F=16.956、6.094，P<0.05)；初診組二者表達(dá)較對照組顯著增高，緩解組較初診組顯著下降(t=2.122～6.608，P<0.05)。見表2。初診組各亞型之間miRNA-106b-5p和Rab10的表達(dá)差異無顯著性(P>0.05)。見表3。動態(tài)觀察3例病人治療前后miRNA-106b-5p和Rab10表達(dá)的變化，經(jīng)治療完全緩解后病人骨髓中二者的表達(dá)水平較初診時均顯著降低(t=3.533、5.014，P<0.05)。見表4。

表2 各組骨髓中miRNA-106b-5p和Rab10相對表達(dá)量的比較

表3 初診組各亞型miRNA-106b-5p和Rab10相對表達(dá)量比較(中位數(shù)(四分位數(shù)))

表4 3例病人治療前后miRNA-106b-5p和Rab10相對表達(dá)量的比較

2.2 miRNA-106b-5p與Rab10表達(dá)的相關(guān)性

本研究先使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRcode(http://mircode.org/index.php)和miRDB(http://www.mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)等miRNA靶基因預(yù)測工具對miRNA-106b-5p的靶向mRNA進(jìn)行預(yù)測，取交集后得到了與miRNA-106b-5p相關(guān)性最強(qiáng)的靶基因Rab10。Spearman秩相關(guān)分析顯示，初診AML病人miRNA-106b-5p表達(dá)與Rab10表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.919，P<0.05)。

2.3 miRNA-106b-5p和Rab10表達(dá)與初診AML病人臨床指標(biāo)的相關(guān)性

初診AML病人31例，骨髓原始細(xì)胞比例≤50%和>50%者分別為11例和20例，血紅蛋白含量為91(75～107)g/L，血小板數(shù)為64(24～133)×109/L，白細(xì)胞數(shù)為7.5(2.2～24.3)×109/L。初診AML病人miRNA-106b-5p、Rab10的表達(dá)水平與骨髓原始細(xì)胞比例、白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)及血紅蛋白含量均無相關(guān)性(r=-1.253～0.522，P>0.05)。

2.4 miRNA-106b-5p和Rab10表達(dá)與初診AML病人染色體核型的關(guān)系

本文31例初診AML病人中有15例進(jìn)行了染色體核型分析，其中6例病人染色體核型異常(49,XX,+8,+13,+21[6]/46,XX[4]；47,XY,+1,der(1,16)[10]；46,XY,t(8;21)(q22;q22)[10]；46,XX,t(15;17)(q22;q21)[10]；47,XX,+8[2]/46,XX[18]；47,XY,+10[7]/46,XY[3])。根據(jù)初診組中miRNA-106b-5p表達(dá)水平的中位數(shù)(1.384)將進(jìn)行染色體核型分析的15例病人分為miRNA-106b-5p高表達(dá)組(7例)和低表達(dá)組(8例)；根據(jù)初診組中Rab10表達(dá)水平的中位數(shù)(1.058)將上述15例病人分為Rab10高表達(dá)組(7例)和低表達(dá)組(8例)。Fisher確切概率法分析顯示，染色體核型異常病人(6例)miRNA-106b-5p、Rab10的表達(dá)水平與核型正常病人(9例)相比較差異均無顯著性(P=0.608、0.315)。見表5。

表5 miRNA-106b-5p和Rab10表達(dá)與初診AML病人染色體核型的關(guān)系(例(χ/%))

3 討 論

AML是成人最常見的急性白血病，是一種高度異質(zhì)性的疾病，以未成熟骨髓細(xì)胞的異常增殖和分化為主要特征。它是兒童和成人常見的血液疾病類型，每年都會影響近300萬人[17-19]。目前AML的常規(guī)治療方法有化療和骨髓移植(或造血干細(xì)胞移植)，然而從AML的診斷時間與發(fā)病率和死亡率來看，有待探索新的診斷及治療手段[20]。隨著下一代測序和基因突變分析技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了幾種新的治療策略以盡量減少常規(guī)療法的缺陷[21-22]，其中之一即為靶向藥物治療，因此，為AML的診斷及治療尋找新的靶點至關(guān)重要[23-25]。miRNA是短的非編碼RNA，它通過直接調(diào)控靶mRNA影響細(xì)胞分化、增殖等過程。在包括AML在內(nèi)的許多癌癥中，已鑒定出相關(guān)的miRNA表達(dá)；此外，miRNA還有作為生物標(biāo)志物的潛能[26]。本研究主要檢測AML病人骨髓中miRNA-106b-5p和Rab10的表達(dá)并探討其臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，在疾病的不同階段miRNA-106b-5p及Rab10的表達(dá)差異有顯著意義，與健康對照組相比，初診AML病人骨髓樣本中miRNA-106b-5p及Rab10的表達(dá)水平明顯增高，完全緩解后二者表達(dá)水平顯著降低，表明miRNA-106b-5p及Rab10的異常表達(dá)與AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過檢測二者表達(dá)水平可以監(jiān)測AML病人的病情。在其他惡性疾病中，miRNA-106b-5p的異常表達(dá)也影響疾病的發(fā)生發(fā)展。例如，miRNA-106b-5p通過調(diào)節(jié)組織蛋白酶A(CTSA)的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[27]；miRNA-106b-5p在腎細(xì)胞癌病人中表達(dá)升高，并通過激活β-catenin信號傳導(dǎo)增強(qiáng)腎細(xì)胞癌的侵襲性[28]；miRNA-106b-5p高表達(dá)與腎細(xì)胞癌病人預(yù)后不良相關(guān)[29]。為明確miRNA-106b-5p在AML中是否是通過miRNA-mRNA通路來影響疾病的發(fā)生發(fā)展，我們使用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNA-106b-5p的下游靶基因Rab10受其調(diào)控。本文秩相關(guān)分析結(jié)果也初步證明兩者之間存在相關(guān)性。Rab10發(fā)揮著重要的細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)功能[30]。LI等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在AML骨髓細(xì)胞中?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)通過調(diào)節(jié)miRNA-193a-5p/Rab10軸調(diào)控AML細(xì)胞的生存和凋亡。FAN等[32]的研究表明，Rab10通過miRNA203-Rab10在AML細(xì)胞的增殖和凋亡中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。Rab10與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化與轉(zhuǎn)移，可能成為腫瘤治療的潛在靶點[33]。以上研究結(jié)果表明，miRNA-106b-5p及Rab10可以作為AML診斷和預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

本文研究結(jié)果顯示，染色體核型異常的初診AML病人骨髓中miRNA-106b-5p及Rab10的表達(dá)水平與核型正常者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明miRNA-106b-5p及Rab10的表達(dá)與初診AML病人染色體異常無關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，miRNA-106b-5p及Rab10的表達(dá)水平與初診AML病人骨髓原始細(xì)胞比例、血紅蛋白含量、白細(xì)胞數(shù)以及血小板數(shù)等臨床指標(biāo)無關(guān)，這與YANG等[34]的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，miRNA-106b-5p和Rab10在AML病人骨髓中的表達(dá)水平明顯增高，完全緩解后又顯著降低，因此二者可用于監(jiān)測AML的病情，也為AML的疾病診斷及病情判斷提供了新的生物學(xué)標(biāo)志物。miRNA-106b-5p和Rab10的表達(dá)與AML亞型無顯著相關(guān)性，可能與本研究各亞型病人的樣本量小有關(guān)。生物信息學(xué)預(yù)測和相關(guān)性分析結(jié)果表明，miRNA-106b-5p可能通過調(diào)節(jié)Rab10的表達(dá)在AML中發(fā)揮作用，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。在今后的研究中我們將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行一系列細(xì)胞功能實驗來進(jìn)行驗證。