肝細(xì)胞肝癌中CyclinA1的表達(dá)及意義

馬晏然,楊茜,李宏,宋京芝,周璇,項(xiàng)鋒鋼,

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系； 2 附屬醫(yī)院病理科)

肝細(xì)胞肝癌(HCC)是發(fā)展中國(guó)家最常見的原發(fā)性肝癌類型，主要由病毒感染引起[1]。在我國(guó)，其病死率僅次于胃癌[2]。根治性切除術(shù)是HCC的主要治療方式，但HCC病人術(shù)后有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，預(yù)后不理想[3-4]。表觀遺傳修飾的調(diào)節(jié)及不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交叉作用導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制極其復(fù)雜[5-7]。因此，探討HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找影響其發(fā)生、發(fā)展及判斷其預(yù)后的分子標(biāo)志物將具有重要意義。細(xì)胞周期蛋白A1(CyclinA1)參與細(xì)胞周期循環(huán)的調(diào)控，在維持細(xì)胞有序的增殖和分裂活動(dòng)中起作用[8]。研究表明，CyclinA1在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并提示預(yù)后不良[9-10]。但是CyclinA1影響HCC發(fā)生發(fā)展的研究相對(duì)較少。有研究顯示，CyclinA1在HCC組織中異常表達(dá)，通過抑制細(xì)胞凋亡，有利于腫瘤形成[11]。本研究通過檢測(cè)CyclinA1在HCC中的表達(dá)，探討CyclinA1與HCC病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為HCC的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1標(biāo)本收集 收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院2014—2016年手術(shù)切除的HCC石蠟包埋標(biāo)本284對(duì)，包括HCC及其相應(yīng)癌旁非瘤組織(距腫瘤邊緣>5 cm)，病人男244例，女40例；年齡32～83歲，平均(57.4±9.7)歲；病人臨床病理資料均完整，術(shù)前均未接受放、化療。HCC病人通過電話與住院復(fù)查結(jié)合的方式隨訪，隨訪截止日期為2021年7月31日，共有251例隨訪滿5年且資料完整，分析其術(shù)后生存時(shí)間。選取2020年12月—2021年1月手術(shù)切除、立即凍存于液氮中的9對(duì)新鮮HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑 CyclinA1鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)安迪科技公司，免疫組織化學(xué)工作濃度1∶100，Western blot工作濃度1∶1 000；Trizol裂解液、RIPA裂解液、PV6000免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒、ECL發(fā)光液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；SYBR PremixEx TaqTMⅡ熒光定量試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)CyclinA1 mRNA的表達(dá) 應(yīng)用TRizol裂解液提取新鮮組織標(biāo)本總RNA，應(yīng)用PrimeScriptTM試劑盒反轉(zhuǎn)錄，按試劑盒說明書操作。qRT-PCR反應(yīng)條件[12]：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織中CyclinA1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算使用2- △△Ct方法[12]。以GAPDHmRNA表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參。PCR引物及其序列見表1。

表1 PCR引物及其序列

1.2.2Western blot方法檢測(cè)CyclinA1蛋白的表達(dá) 應(yīng)用RIPA裂解液提取新鮮HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織總蛋白。按BCA檢測(cè)試劑盒說明書操作，檢測(cè)蛋白濃度。配制體積分?jǐn)?shù)為0.10的PAGE凝膠，每孔加入30 μg蛋白；80 V電泳，300 mA電轉(zhuǎn)，各持續(xù)1.5 h，快速封閉液封閉10 min，TBST洗膜3次；室溫孵育目標(biāo)一抗2 h，TBST洗膜3次; 室溫孵育二抗1.5 h；TBST洗膜3次后，使用ECL發(fā)光液在暗室中顯影。條帶灰度值經(jīng)Image J軟件分析后，計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.2.3組織芯片的制作 石蠟包埋組織切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，標(biāo)記腫瘤及癌旁非瘤組織的典型區(qū)域。應(yīng)用全自動(dòng)組織芯片點(diǎn)樣儀MiniCore3制作孔徑1.5 mm的組織芯片，4 μm切片后復(fù)檢，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)CyclinA1的表達(dá) 采用PV 6000法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，浸泡于體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2滅活內(nèi)源性酶；水洗后，微波加熱修復(fù)(EDTA，pH值8)，自然冷卻，PBS沖洗3次，滴加一抗，37 ℃孵育2 h；PBS沖洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察[12]。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性表達(dá)CyclinA1的結(jié)腸癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定[13-14]：以細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕褐色計(jì)為CyclinA1陽(yáng)性表達(dá)。首先對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無著色(-)；1分，棕黃色(+)； 2分，棕褐色()。再對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：< 10%為0分，10%～50%為1分，≥50%為2分。兩者得分相加，≤ 2分為低表達(dá)，> 2分為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HCC及其癌旁非瘤組織中CyclinA1 mRNA和蛋白表達(dá)比較

本研究9對(duì)新鮮HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織中CyclinA1 mRNA的表達(dá)水平分別為-4.782±1.505和-6.714±1.502，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.739，P<0.01)；CyclinA1蛋白表達(dá)水平分別為2.756±0.134和0.904±0.057，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.690，P<0.01)。見圖1。

T:HCC組織；N：相應(yīng)癌旁非瘤組織。圖1 HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織中CyclinA1表達(dá)的Western blot檢測(cè)

2.2 HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織中CyclinA1表達(dá)比較

IHC染色顯示，CyclinA1主要在細(xì)胞核中陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。HCC組織中CyclinA1高表達(dá)146例(51.41%)，而相應(yīng)癌旁非瘤組織中無高表達(dá)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-16.019，P<0.01)。

A:CyclinA1在HCC組織中呈高表達(dá)；B：CyclinA1在癌旁非瘤石蠟包埋組織中呈低表達(dá)；C：CyclinA1在癌旁非瘤石蠟包埋組織中呈陰性表達(dá)。IHC染色，400倍。圖2 CyclinA1在組織芯片中的表達(dá)

2.3 CyclinA1表達(dá)與HCC病人臨床病理特征的關(guān)系

CyclinA1的表達(dá)與HCC病人腫瘤的分化程度、TNM分期、腫瘤是否多發(fā)、脈管侵犯、被膜侵犯和腫瘤大小均有關(guān)(χ2=4.559～15.551，P<0.05)，而與病人性別、年齡、合并肝硬化、攜帶乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白無關(guān)(χ2=0.008～2.255，P>0.05)。見表2。

表2 CyclinA1表達(dá)與HCC病人臨床病理特征的關(guān)系(例(χ/%))

2.4 CyclinA1表達(dá)與HCC病人術(shù)后生存期關(guān)系

Kaplan-Meier分析表明，CyclinA1低表達(dá)病人的平均總生存時(shí)間(OS)和無病生存時(shí)間(DFS)分別為53.7個(gè)月和51.7個(gè)月，而高表達(dá)病人分別為45.9個(gè)月和43.2個(gè)月，差異有顯著性(χ2=15.060、12.930，P<0.05)。CyclinA1陽(yáng)性表達(dá)的HCC病人中，CyclinA1低表達(dá)者的平均OS和DFS分別為59.4個(gè)月和59.2個(gè)月，而高表達(dá)者分別為45.7個(gè)月和42.3個(gè)月，差異有顯著性(χ2=23.150、20.610，P<0.001)。分化程度差的病人中，CyclinA1低表達(dá)病人的平均OS和DFS分別為50.1個(gè)月和46.8個(gè)月，而高表達(dá)病人分別為38.4個(gè)月和35.3個(gè)月，差異有顯著性(χ2=6.921、5.116，P<0.05)。腫瘤多發(fā)的HCC病人中，CyclinA1低表達(dá)者的平均OS和DFS分別為46.1個(gè)月和41.9個(gè)月，而高表達(dá)者分別為27.8個(gè)月和22.6個(gè)月，差異有顯著性(χ2=7.875、6.876，P<0.01)。脈管侵犯的HCC病人中，CyclinA1低表達(dá)者的平均OS和DFS分為51.1個(gè)月和48.2個(gè)月，而高表達(dá)者分別為38.4個(gè)月和35.4個(gè)月，差異有顯著性(χ2=10.970、8.904，P<0.01)。被膜侵犯的HCC病人中，CyclinA1低表達(dá)病人的平均OS和DFS分別為52.7個(gè)月和49.6個(gè)月，而高表達(dá)的病人分別為41.3個(gè)月和38.0個(gè)月，差異有顯著性(χ2=11.420、8.233，P<0.01)。腫瘤直徑≥5 cm的HCC病人中，CyclinA1低表達(dá)者的平均OS和DFS分別為50.1個(gè)月和47.6個(gè)月，而高表達(dá)的病人分別為39.5個(gè)月和35.3個(gè)月，差異有顯著性(χ2=4.991、4.203，P<0.05)。見圖3、4。

A、B：CyclinA1表達(dá)與HCC病人OS及DFS的關(guān)系；C、D：CyclinA1陽(yáng)性表達(dá)HCC病人表達(dá)水平與OS及DFS的關(guān)系；E、F：分化程度差的HCC病人CyclinA1的表達(dá)與OS及DFS的關(guān)系；G、H：腫瘤多發(fā)的HCC病人CyclinA1表達(dá)與OS及DFS的關(guān)系；I、J：有脈管侵犯的HCC病人CyclinA1表達(dá)與OS及DFS的關(guān)系；K、L：有被膜侵犯的HCC病人CyclinA1表達(dá)與OS及DFS的關(guān)系。圖3 CyclinA1表達(dá)與HCC病人術(shù)后生存期的Kaplan-Meier分析

圖4 腫瘤≥5 cm的HCC病人CyclinA1表達(dá)與OS及DFS的關(guān)系

2.5 Cox回歸模型分析影響HCC病人的術(shù)后生存時(shí)間的因素

單因素分析顯示，CyclinA1的表達(dá)水平(β=1.062，HR(95%CI)=2.892(1.569～5.339)，P<0.001)以及分化程度、TNM分期、腫瘤是否多發(fā)、脈管侵犯、腫瘤大小、甲胎蛋白均是影響病人術(shù)后OS的因素(β=-1.132～-0.511，HR(95%CI)=0.322(0.194～0.536)～0.600(0.352～1.022)，P<0.05)；CyclinA1的表達(dá)水平(β=0.986，HR(95%CI)=2.682(1.455～4.944)，P<0.001)及分化程度、TNM分期、腫瘤是否多發(fā)、脈管侵犯、被膜侵犯、腫瘤大小、甲胎蛋白(β=-1.144～-0.563，HR(95%CI)=0.318(0.191～0.530)～0.569(0.334～0.970)，P<0.05)是術(shù)后DFS的影響因素。將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床病理參數(shù)進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，CyclinA1表達(dá)、分化程度、腫瘤是否多發(fā)、腫瘤大小既是影響術(shù)后OS的獨(dú)立預(yù)后因素(β=-1.227～1.397，HR(95%CI)=0.293(0.171～0.503)～3.706(2.045～6.717)，P<0.05)，也是影響術(shù)后DFS的獨(dú)立預(yù)后因素(β=-1.379～1.453，HR(95%CI)=0.252(0.145～0.436)～4.274(2.188～8.350)，P<0.05)。見表3～4。

表3 影響HCC病人OS的單因素及多因素Cox回歸模型分析

表4 影響HCC病人DFS的單因素及多因素Cox回歸模型分析

3 討 論

CyclinA1的編碼基因位于染色體13q12.3-13上,蛋白質(zhì)主要定位在細(xì)胞核內(nèi)[15]。在細(xì)胞周期循環(huán)中,CyclinA1蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2(CDK2)形成復(fù)合物，促進(jìn)G1/S轉(zhuǎn)換、啟動(dòng)DNA合成[16-17]。此外，CyclinA1可以與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)和p21蛋白結(jié)合形成活性復(fù)合物，調(diào)節(jié)多種促生長(zhǎng)基因的表達(dá)[8,15,18]。

研究表明，在多種惡性腫瘤包括前列腺癌、食管癌、精原細(xì)胞癌、乳癌等組織中，CyclinA1的表達(dá)升高[9-10,19-24]。然而，CyclinA1在HCC中表達(dá)研究少見報(bào)道，CHEN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中的CyclinA1表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁非瘤組織。本文檢測(cè)HCC石蠟配對(duì)組織和新鮮HCC組織CyclinA1 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示腫瘤組織中CyclinA1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，表明CyclinA1可能參與HCC的發(fā)生過程。

近年來的研究表明，CyclinA1的表達(dá)與腫瘤大小相關(guān)，且腫瘤高Ki-67指數(shù)組中CyclinA1的表達(dá)水平高于低Ki67指數(shù)組[25]。YANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在人肺成纖維細(xì)胞中，突變型P53蛋白通過下調(diào)CyclinA1抑制因子p21表達(dá)，導(dǎo)致CyclinA1的表達(dá)升高，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。提示CyclinA1可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖活性。有研究認(rèn)為，CyclinA1在惡性腫瘤增殖中發(fā)揮了重要作用[21]。本文研究結(jié)果顯示，除腫瘤大小外，與HCC組織中CyclinA1表達(dá)有關(guān)的還有腫瘤分化程度、TNM分期、脈管侵犯、被膜侵犯和腫瘤是否多發(fā)，腫瘤分化程度差、TNM分期晚、有脈管侵犯、被膜侵犯及增殖能力強(qiáng)的病人CyclinA1的表達(dá)水平更高，說明CyclinA1高表達(dá)可增強(qiáng)HCC的增殖活性，且更利于HCC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,CyclinA1可能與HCC的發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，在pRb的參與下，CyclinA1通過直接綁定基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的啟動(dòng)子區(qū)域，增加MMP2蛋白的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)VEGF分泌，使癌細(xì)胞更易發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[20]。這可能是CyclinA1促進(jìn)HCC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的原因之一。然而，目前關(guān)于CyclinA1影響HCC侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制仍不明確，有待今后的研究進(jìn)一步探討。

此外，CyclinA1的表達(dá)與多種腫瘤病人的預(yù)后關(guān)系密切，CyclinA1高表達(dá)腫瘤病人的術(shù)后OS及DFS較低表達(dá)者更短，CyclinA1的表達(dá)水平是影響腫瘤病人術(shù)后OS及DFS的獨(dú)立預(yù)后因素[24]。本研究結(jié)果表明，高表達(dá)CyclinA1的HCC病人術(shù)后OS及DFS較低表達(dá)者更短；在CyclinA1陽(yáng)性表達(dá)、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)、分化程度差和腫瘤直徑≥5 cm的HCC病人中，CyclinA1高表達(dá)組的術(shù)后OS及DFS均較低表達(dá)組更短。有研究顯示，CyclinA1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞化療藥物耐藥性呈正相關(guān)，CyclinA1過表達(dá)顯著降低化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。這或許是導(dǎo)致HCC病人術(shù)后預(yù)后較差的諸多原因之一。本文Cox回歸模型分析顯示，CyclinA1表達(dá)及腫瘤多發(fā)性、分化程度、腫瘤大小是影響HCC病人術(shù)后OS及DFS的獨(dú)立預(yù)后因素；CyclinA1高表達(dá)與病人預(yù)后不良有關(guān)，提示CyclinA1可能作為一種常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)用于評(píng)估HCC病人術(shù)后生存期。

本研究存在一定的局限性：284例HCC病人術(shù)后生存時(shí)間滿5年251例，應(yīng)完善隨訪資料并分析，以進(jìn)一步證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果；未使用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及裸鼠實(shí)驗(yàn)等探究CyclinA1在HCC發(fā)生發(fā)展中確切分子機(jī)制；此外，雖有研究證明CyclinA1影響HCC細(xì)胞凋亡，但相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制仍不明確，這都是值得未來深入探討及研究的方向。

綜上所述，CyclinA1可能參與了HCC發(fā)生發(fā)展的過程，CyclinA1高表達(dá)的病人術(shù)后預(yù)后不良，CyclinA1表達(dá)對(duì)HCC病人預(yù)后的判斷具有較大指導(dǎo)意義。今后的研究中，可采用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入探討CyclinA1影響HCC發(fā)生發(fā)展的確切分子作用機(jī)制，以指導(dǎo)臨床藥物分子靶向治療、病人預(yù)后的判斷。