超聲對(duì)α-淀粉酶活性和結(jié)構(gòu)特性的影響

陳妍，陳復(fù)生，張麗芬，2*，張明珠

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省南街村（集團(tuán)）有限公司，河南 漯河 462600）

淀粉酶作為一種基本的工業(yè)用酶，分為α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶[1]。其中α-淀粉酶是一種應(yīng)用較為廣泛的工業(yè)用酶，它可以作用于淀粉和其它多糖的內(nèi)部α-1-4糖苷鍵[2]，從而產(chǎn)生葡萄糖和麥芽糖等多種物質(zhì)，目前工業(yè)上利用其生產(chǎn)了乙醇、高果糖玉米糖漿、食品、紡織物和洗滌劑等[2]。作為重要的大分子生物催化劑，酶分子具有高效性和特異性，是常用的化學(xué)催化劑的良好替代品。此外，酶促反應(yīng)是在較為溫和的條件下進(jìn)行，所產(chǎn)生的副產(chǎn)物和污染少。因此，近年來(lái)，酶分子在制藥、化工、生物、食品等行業(yè)的應(yīng)用明顯增加[3]。然而，酶分子在極端條件下具有相對(duì)較低的穩(wěn)定性，并且在商業(yè)應(yīng)用中成本頗高[4]。為了改善這些局限性，提高酶活力、穩(wěn)定性、再利用能力和酶的效率成為了研究的熱點(diǎn)。其中，研究多采用超聲波處理、微波輻射、高靜水壓、超臨界二氧化碳處理以及蛋白質(zhì)工程修飾酶分子等方法對(duì)酶的特性進(jìn)行改善[5]。例如，通過(guò)對(duì)酶分子表面的多聚賴氨酸修飾可以有效提高肌氨酸氧化酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[6]；還有研究者通過(guò)改善亞臨界和超臨界處理?xiàng)l件進(jìn)而增強(qiáng)了α-淀粉酶的酶活力[7]等。由于生物技術(shù)在不斷發(fā)展和吸引新方法，基于綠色和科學(xué)的原則，超聲波作為綠色、科學(xué)以及高效的物理技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

超聲波是一種音調(diào)高于人類聽(tīng)力范圍的機(jī)械振蕩聲波，頻率范圍在20 kHz～10 MHz，根據(jù)不同的頻率級(jí)別，超聲波可以在不同的領(lǐng)域發(fā)揮重要的用途，例如醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、材料科學(xué)、生物以及化學(xué)等，為新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和可持續(xù)生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。超聲波作為一種非熱物理技術(shù)，還因其具有效率高、儀器要求低、經(jīng)濟(jì)可行性等優(yōu)點(diǎn)，在食品工業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。當(dāng)超聲波通過(guò)液體介質(zhì)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、聲流和聲空化。其中，聲空化效應(yīng)在食品行業(yè)中的應(yīng)用尤為重要?？栈F(xiàn)象的形成是由于液體中空穴的形成、生長(zhǎng)和內(nèi)爆崩塌，在此過(guò)程中會(huì)釋放出大量高度局部化的能量，這就使得暴露在超聲場(chǎng)的物質(zhì)受其影響發(fā)生性質(zhì)上的改變。目前，超聲波在食品工業(yè)中的應(yīng)用可分為低強(qiáng)度和高強(qiáng)度。其中，低強(qiáng)度超聲是使用小振幅的超聲波，這不僅會(huì)引起物質(zhì)性質(zhì)的有利變化，還可以加速某些化學(xué)反應(yīng)和工業(yè)過(guò)程[8-9]。研究表明，在超聲場(chǎng)環(huán)境下，酶的催化活性會(huì)因連續(xù)產(chǎn)生的空化流和氣泡受到影響，超聲波通過(guò)擾動(dòng)酶的環(huán)和結(jié)構(gòu)域來(lái)改變酶的三維結(jié)構(gòu)，從而影響酶活力[10]。較低強(qiáng)度和短時(shí)間的超聲波處理有利于提高酶活力，并且超聲波還能在不改變酶結(jié)構(gòu)完整性的情況下，使分子發(fā)生有利的構(gòu)象變化[11]，例如低強(qiáng)度超聲可以激活β-D-葡萄糖苷酶的活性，使其具有活性位點(diǎn)的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，從而使酶活力增強(qiáng)，反之隨著超聲強(qiáng)度的增加則會(huì)抑制其活性[12]。以上研究表明，超聲技術(shù)可以通過(guò)改變酶的構(gòu)象從而改善其功能并促進(jìn)酶和底物之間的相互作用，這為酶的修飾提供了新的思路與技術(shù)手段。

綜上所述，本研究通過(guò)探討超聲處理對(duì)α-淀粉酶酶活力的影響，并且利用米氏方程、圓二色譜和熒光光譜分析超聲對(duì)α-淀粉酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和分子結(jié)構(gòu)的影響，闡明超聲作用下α-淀粉酶酶活力的變化機(jī)制，表明超聲處理能夠提高反應(yīng)速度和催化效率的潛在優(yōu)勢(shì)，為超聲在酶促反應(yīng)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

可溶性淀粉、無(wú)水葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要設(shè)備

TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、DC-2006型節(jié)能型智能恒溫槽：寧波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海大普儀器有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；MOS 450圓二色譜儀：法國(guó)比奧羅杰公司；MY17040001熒光分光光度計(jì)：安捷倫科技有限公司；GL224-1SCN電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取50 mL、pH6的磷酸鹽緩沖溶液，提前預(yù)熱至45℃，加入α-淀粉酶使其充分溶解后搖勻，作為試驗(yàn)樣品備用。

1.3.2 酶活力測(cè)定

參照Souza等[13]的方法并加以修改，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于測(cè)定α-淀粉酶酶活力。定義酶活力單位（1 U）為在試驗(yàn)條件下每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量（mg）。將可溶性淀粉溶液作為α-淀粉酶的水解底物，酶解反應(yīng)時(shí)間固定為15 min，反應(yīng)結(jié)束后，立即加入1 mol/L HCl進(jìn)行滅酶處理。然后加入3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑，在沸水浴煮沸5 min，取出至冷卻后，加蒸餾水定容至25 mL。立即用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.594 0x-0.018 1（R2=0.997 8），求得酶活力。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

選擇超聲功率密度（1.90、2.85、3.80、4.75、5.70W/cm3）、超聲處理時(shí)間（5、15、25、35、45 min）、超聲溫度（25、35、45、55、65℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。以未超聲處理的α-淀粉酶的酶活試驗(yàn)為對(duì)照，探究各因素對(duì)α-淀粉酶酶活力的影響。

1.3.4 酶促動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

以底物濃度分別為 1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、9.6 mg/mL的可溶性淀粉溶液作為反應(yīng)底物，加入超聲處理與未處理的α-淀粉酶溶液分別進(jìn)行水解反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，立即加入1 mol/L HCl滅酶，然后加入DNS試劑，在沸水浴中加熱5min，取出冷卻后，用蒸餾水定容至25 mL。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定吸光度。采用Lineweaver-Burk方程作雙倒數(shù)曲線來(lái)判定超聲處理對(duì)α-淀粉酶的酶促動(dòng)力學(xué)影響。

Michaelis-Menton方程如下。

Lineweaver-Burk方程如下。

式中：V為初始反應(yīng)速率，mg/（mL·min）；S為底物濃度，mg/mL；Vmax為最大初始反應(yīng)速率，mg/（mL·min）；Km為米氏常數(shù)，mg/mL。

1.3.5 圓二色譜測(cè)定

參照Yu等[14]的方法并加以修改，在室溫（25±1）℃下，利用圓二色譜儀對(duì)α-淀粉酶進(jìn)行光譜掃描。圓二色譜儀以掃描速度為50 nm/min進(jìn)行掃描，記錄α-淀粉酶從190 nm到250 nm的圓二色譜（circular dichroism，CD）變化。CD 數(shù)據(jù)以平均殘基橢圓率[θ]表示，單位為（deg·cm2）/dmol，并利用 CD pro軟件計(jì)算得出 α-淀粉酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲含量。以不含α-淀粉酶的磷酸鹽緩沖溶液作為空白溶液。

1.3.6 熒光光譜測(cè)定

參照Yu等[14]的方法并加以修改，使用熒光分光光度計(jì)在室溫（25±1）℃下，在激發(fā)波長(zhǎng)278 nm（狹縫=5 nm）、發(fā)射波長(zhǎng)300 nm～500 nm（狹縫=5 nm）下測(cè)量樣品的熒光發(fā)射光譜。以不含α-淀粉酶的磷酸鹽緩沖溶液作為空白溶液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 26.0和Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，并采用ANOVA方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲條件對(duì)α-淀粉酶酶活力的影響

超聲對(duì)α-淀粉酶酶活力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲波對(duì)α-淀粉酶的酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrasound on α-amylase activity

由圖1（a）可知，超聲處理后，隨著超聲功率密度的增加，α-淀粉酶酶活力整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在超聲功率密度為2.85 W/cm3時(shí)酶活力達(dá)到最高，與未經(jīng)超聲處理的α-淀粉酶酶活力相比提高了14.30%，但當(dāng)超聲功率密度繼續(xù)增大時(shí)，α-淀粉酶酶活力變化差異不顯著（P＞0.05）。與傳統(tǒng)的熱變性不同，低強(qiáng)度的超聲不會(huì)對(duì)酶的活性位點(diǎn)造成破壞，這與文獻(xiàn)[14]通過(guò)探究超聲波對(duì)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的研究結(jié)果一致。超聲處理可以通過(guò)破壞弱相互作用，如氫鍵或范德華力等，從而引起酶結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，而超聲波作用產(chǎn)生的穩(wěn)定空化氣泡振蕩所產(chǎn)生的力可以直接作用于酶分子使得酶聚合體分散，并且也能夠通過(guò)改變酶分子結(jié)構(gòu)使得酶分子活性位點(diǎn)暴露，從而提高酶活力[14]。因此，選擇2.85 W/cm3為最佳超聲功率密度。

由圖1（b）可知，α-淀粉酶酶活力在超聲5 min時(shí)顯著增加（P＜0.05），之后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。在低頻和中等強(qiáng)度的液體超聲處理時(shí)會(huì)形成穩(wěn)定的空化效應(yīng)，而穩(wěn)定的空化氣泡崩塌產(chǎn)生的剪切力會(huì)改變酶構(gòu)象，從而導(dǎo)致更多的活性位點(diǎn)暴露。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，α-淀粉酶在穩(wěn)定的空化作用下，結(jié)構(gòu)未被破壞，保持了原有的活性[15]。且超聲處理過(guò)程中出現(xiàn)的穩(wěn)定空化現(xiàn)象是α-淀粉酶酶活力增強(qiáng)的原因[16]。因此，選擇5 min為最佳超聲時(shí)間。

由圖1（c）可知，隨著超聲溫度的升高，α-淀粉酶酶活力呈先上升后明顯下降的趨勢(shì)，在溫度為45℃時(shí)活力達(dá)到最高。這表明超聲波處理可以在低溫下刺激α-淀粉酶的活性，低溫環(huán)境下，超聲波所產(chǎn)生的空化效應(yīng)更好，并且高溫會(huì)削弱酶的活性，這與Souza等[13]的結(jié)論一致，Souza等[13]的研究表明，在最佳的超聲溫度下可以更有效地破壞如氫鍵、偶極吸引和范德華力等相互作用，并且空化效應(yīng)會(huì)提高微區(qū)溫度，形成的局部高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生熱失活以及蛋白質(zhì)中的鍵發(fā)生熱裂解，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能造成不利影響[15]，繼而使得酶活力降低甚至失活。因此，選擇45℃為最佳超聲溫度。

2.2 超聲條件對(duì)α-淀粉酶的酶促動(dòng)力學(xué)影響

在超聲功率密度2.85 W/cm3、超聲溫度45℃、超聲時(shí)間5 min的處理?xiàng)l件下，探究超聲對(duì)α-淀粉酶的酶促動(dòng)力學(xué)影響，與未經(jīng)超聲處理的α-淀粉酶進(jìn)行對(duì)照。Lineweaver-Burk圖見(jiàn)圖2，根據(jù)圖2計(jì)算獲得的Vmax和Km值見(jiàn)表1。

圖2 α-淀粉酶的Lineweaver-Burk圖Fig.2 Lineweaver-Burk plot of α-amylase

表1 超聲處理對(duì)α-淀粉酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 1 Effect of ultrasound treatment on kinetic parameters of α-amylase

由圖2和表1可知，與未經(jīng)過(guò)超聲處理的α-淀粉酶相比，超聲處理后的α-淀粉酶的Vmax增加9.56%，Km降低了23.58%。超聲通過(guò)提高反應(yīng)速率、增強(qiáng)酶與底物的結(jié)合來(lái)促進(jìn)反應(yīng)。而超聲使得α-淀粉酶Km減小可能是由于超聲空化產(chǎn)生的壓力、剪切力和溫度，使得α-淀粉酶更多的活性位點(diǎn)暴露，使其易于與底物結(jié)合，表現(xiàn)出較強(qiáng)的酶促反應(yīng)能力[17-18]。試驗(yàn)結(jié)果與研究者利用超聲波技術(shù)改善纖維素酶的酶促反應(yīng)傳質(zhì)速度所得結(jié)論相一致，這種現(xiàn)象是超聲空化引起的機(jī)械效應(yīng)所產(chǎn)生的結(jié)果[10]。

2.3 超聲對(duì)α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的影響

超聲處理后的α-淀粉酶的CD光譜分析結(jié)果見(jiàn)圖3，α-淀粉酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量信息見(jiàn)表2。

圖3 超聲處理對(duì)α-淀粉酶的CD光譜的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment on CD spectra of α-amylase

表2 超聲處理對(duì)α-淀粉酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Table 2 Effect of ultrasound treatment on content of secondary structural elements of α-amylase

根據(jù)圖3可知，CD光譜在190 nm～200 nm呈現(xiàn)正峰譜帶，這是α-螺旋與β-折疊結(jié)構(gòu)所形成的重合峰，222 nm和208 nm左右的波谷也顯示了α-螺旋結(jié)構(gòu)的存在，同時(shí)β-折疊結(jié)構(gòu)在CD光譜中顯示為210 nm～220 nm區(qū)域呈負(fù)峰譜帶，205 nm～225nm的CD圖譜顯示主要為α-螺旋和β-折疊疊加的結(jié)果[19]。經(jīng)過(guò)超聲處理后，α-淀粉酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰的波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生明顯位移，但是對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度發(fā)生了變化。并且結(jié)合表2可知，與未經(jīng)超聲處理樣品相比，α-淀粉酶的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量降低，β-折疊的含量增加。分析β-折疊含量的增加可能是由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化而來(lái)。經(jīng)過(guò)超聲處理后α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)含量變化歸因于超聲壓力變化和湍流等誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[15]，從而可能影響了酶的活性位點(diǎn)。超聲處理使得α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)得更具有規(guī)律性和柔韌性，同時(shí)無(wú)規(guī)則卷曲含量的降低使其結(jié)構(gòu)從無(wú)序變得更加有序，這不僅能夠提高酶的活性，同時(shí)還提高了酶的穩(wěn)定性。

熒光光譜能有效地表征蛋白質(zhì)及其空間構(gòu)象的變化，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的發(fā)色基團(tuán)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以有效地判定發(fā)色基團(tuán)的物理環(huán)境變化以及可能與其發(fā)生共價(jià)結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)，其中以色氨酸的熒光光譜變化為主。超聲處理α-淀粉酶的熒光光譜分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 超聲處理對(duì)α-淀粉酶的熒光光譜的影響Fig.4 Effect of ultrasound treatment on fluorescence spectra of α-amylase

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可以通過(guò)分析蛋白質(zhì)分子表面的色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度以及最大吸收波長(zhǎng)（λmax）來(lái)判定[20-21]。由圖4可知，超聲處理前后的α-淀粉酶的最大吸收波長(zhǎng)未發(fā)生明顯位移，表明溫和的超聲場(chǎng)環(huán)境并不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，且有利于維持α-淀粉酶的活性。而超聲處理后α-淀粉酶熒光強(qiáng)度降低，可能是由于α-淀粉酶表面色氨酸含量的減少。α-淀粉酶經(jīng)過(guò)超聲處理后向外暴露的內(nèi)部區(qū)域數(shù)量的增加，掩埋了原本處于分子表面的色氨酸[22]，因此結(jié)果表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度降低。研究結(jié)果顯示的α-淀粉酶熒光強(qiáng)度降低，與超聲波對(duì)葡聚糖酶的影響結(jié)果一致[23]，說(shuō)明溫和的超聲處理?xiàng)l件不僅不會(huì)破壞酶分子的空間結(jié)構(gòu)，反而使其三級(jí)結(jié)構(gòu)更加整齊有序且提高了酶分子的穩(wěn)定性。低強(qiáng)度的超聲處理能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的疏水相互作用，使得α-淀粉酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)更加整齊有序，并且導(dǎo)致分子內(nèi)更多的基團(tuán)和區(qū)域暴露，因此，低強(qiáng)度超聲能夠提高α-淀粉酶酶活力[14]。

3 結(jié)論

研究超聲條件對(duì)α-淀粉酶的酶活影響的結(jié)果表明，與未處理的α-淀粉酶相比，在超聲功率密度2.85 W/cm3、超聲時(shí)間5 min、超聲溫度45℃條件下，α-淀粉酶的酶活力提高了22.30%。經(jīng)超聲處理后得到的α-淀粉酶的水解反應(yīng)滿足米氏動(dòng)力學(xué)方程，且Km值降低，Vmax值升高。根據(jù)圓二色譜和熒光光譜分析結(jié)果可知，超聲處理使得α-淀粉酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量上升、無(wú)規(guī)則卷曲含量下降，以及表面色氨酸含量降低，超聲處理能夠使得酶分子結(jié)構(gòu)更加整齊和具有規(guī)律性，空間構(gòu)象發(fā)生了有利轉(zhuǎn)變，說(shuō)明超聲對(duì)α-淀粉酶酶促反應(yīng)具有積極的促進(jìn)作用。研究結(jié)果為超聲在酶反應(yīng)中的應(yīng)用提供了參考。