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    2018~2021年傳染性喉氣管炎在山東商品肉雞中的發(fā)生和防控*

    2023-01-30 00:56:38秦卓明馬秀麗亓麗紅黃兵高月花劉麗萍黃迪海秦春芝徐懷英
    家禽科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:魯南病料雞場(chǎng)

    秦卓明,馬秀麗,亓麗紅,黃兵,高月花,劉麗萍,黃迪海,秦春芝,徐懷英**

    (1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,山東 濟(jì)南 250100;2.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司,山東 濟(jì)南 250100)

    傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病,主要侵害雞上呼吸道,同時(shí)對(duì)眼睛、鼻竇、氣囊和肺等組織產(chǎn)生影響。典型癥狀為呼吸困難、氣喘,咳出帶血分泌物、眼結(jié)膜炎和眼簾腫脹等。剖檢可見喉部和氣管黏膜腫脹、出血等,嚴(yán)重的病例則具有較高的致死性,死亡率可高達(dá)40%以上。除了ILT的典型癥狀外,ILT還可以表現(xiàn)為溫和型,表現(xiàn)為黏液性氣管炎、鼻炎、眼結(jié)膜炎、眼流淚等輕微癥狀[1]。傳統(tǒng)認(rèn)為,該病大多數(shù)發(fā)生在成年雞和產(chǎn)蛋雞,雛雞感染率較低。但是,近年來,1月齡內(nèi)商品肉雞發(fā)生ILT的病例不斷攀升,呈現(xiàn)出新的發(fā)病和流行趨勢(shì)[2-3]。

    ILT是世界上第一個(gè)利用疫苗成功控制的家禽疫病,變異頻率相對(duì)較低。盡管如此,ILTV屬于DNA病毒,對(duì)外界抵抗力較強(qiáng),蛋、種雞等廣泛的疫苗接種,使得ILTV野毒株普遍存在,通常每隔3~5年就流行一次[4-5]。

    中國(guó)ILT最早發(fā)生在貴陽(1959)。自20世紀(jì)80年代以來,該病伴隨著我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的蓬勃發(fā)展,已逐漸成為我國(guó)重要的地方流行性疫病。過去ILT的發(fā)病主要是以已開產(chǎn)的蛋雞和種雞為主,雛雞和育成雞較少發(fā)生。但自2018年以來,該病在我國(guó)江蘇、山東等地的商品肉雞流行普遍[6],造成了極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

    1 材料和方法

    1.1 發(fā)病背景

    2018~2021年,山東臨沂、濰坊、棗莊等地以及江蘇連云港、徐州等地的規(guī)?;唐冯u場(chǎng)、蛋雞場(chǎng)等陸續(xù)發(fā)生了一種以嚴(yán)重呼吸困難、咳血、氣管黏膜出血和充血的雞病。主要危害20~50日齡的白羽商品肉雞和地方品種雞,以30~35日齡居多。白羽肉雞的發(fā)病較多,且多數(shù)未經(jīng)免疫。雞群一旦感染,則傳播速度較快,感染率在80%以上,死亡率在5%~30%,嚴(yán)重的死亡率可高達(dá)45%,幾乎無藥可治,嚴(yán)重影響雞群的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益。

    1.2 病料處理

    剖檢具有典型癥狀的發(fā)病雞或死亡雞,取其氣管黏膜或刮取黏膜黏液作為病料。病料剪碎后按1:3的比例加入滅菌的PBS溶液,反復(fù)凍融3次后,離心取上清,然后加入青、鏈霉素(2 000 U/mL) 置4 ℃冰箱過夜處理, -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 主要試劑、材料和儀器

    Simply P病毒DNA/RNA共提取試劑盒,購自杭州博日科技有限公司;DNA膠回收試劑盒,購自天根生物科技有限公司;2×Premix Taq、DL2000bp DNA Marker,購自寶生物(北京)有限公司;PCR儀,購自Thermo Fisher公司;9~10日齡SPF雞胚由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供。

    1.4 SPF雞胚接種

    將無菌檢驗(yàn)合格的病料經(jīng)絨毛尿囊膜(CAM)途徑接種10日齡SPF雞胚,每日照蛋,舍棄48 h內(nèi)非特異性死亡雞胚,觀察至120 h,死亡胚和120 h活胚及時(shí)放置4 ℃冰箱并保存過夜。在生物安全柜內(nèi),觀察CAM和雞胚病變。同時(shí)將CAM剪碎研磨,加入PBS稀釋,反復(fù)凍融3次,離心取上清,置-20 ℃保存?zhèn)溆?。取少量樣品提取核酸,進(jìn)行ILTV鑒定。

    1.5 病原核酸鑒定

    以ILTV 的ICP4基因?yàn)槟0?,設(shè)計(jì)ILTV的鑒定用引物,建立相應(yīng)的反應(yīng)條件[7]。

    1.6 gB基因序列測(cè)定

    參考GenBank中ILTV經(jīng)典株的結(jié)構(gòu)蛋白gB基因序列,利用Prime preimer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,F(xiàn):5’-TTCGTCTTCGCTTTCTTCTGCC-3’,R:5’-CGCGGTCCTGTATGCAATCC-3’,引物由華大基因合成。

    按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書,提取樣品的DNA,-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為:2×Premix Taq 25 μL,待檢DNA模板2 μL,上下游引物(10 mmol/L)各2 μL,最后用RNA-free H2O補(bǔ)足反應(yīng)體系至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性4 min;進(jìn)入94 ℃變性35 s, 58 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 180 s,共進(jìn)行33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃結(jié)束反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,選取2 660 bp目的條帶回收后,連接pMD18-T 載體,轉(zhuǎn)化DH5α,接種LB 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h,挑取菌落進(jìn)行PCR 鑒定。將陽性菌落接種LB 液體培養(yǎng)基增菌,送華大基因進(jìn)行測(cè)序。

    1.7 同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析

    從GenBank中選擇國(guó)內(nèi)外的ILTV代表毒株gB核苷酸序列,利用Lasergen 7.1和MEGA5.1軟件,比較其核苷酸同源性,并采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建支原體的系統(tǒng)發(fā)育樹,探討不同ILTV分離株及其與疫苗株間的遺傳距離和系統(tǒng)演化關(guān)系。

    2 結(jié)果

    2.1 臨床概況

    2.1.1 流行病學(xué) 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所禽病診斷中心的檢測(cè)數(shù)據(jù)表明,雞ILT在2018年以后呈現(xiàn)逐年增加趨勢(shì)。2018年送檢病例24例,2021年增加到103例。在送檢的疑似ILT的278份病例中,ILT的PCR陽性檢出率高達(dá)40%,如圖1。

    圖1 ILT疑似送檢樣品數(shù)、陽性數(shù)以及PCR陽性檢出率

    2.1.2 典型案例 自2018年10月以來,臨床報(bào)導(dǎo)ILT的病例逐漸增多,先是地方品種雞發(fā)病。隨后,在2020年5月~2021年4月,商品肉雞發(fā)生ILT達(dá)到高峰。表1顯示的是2018~2021年間幾次典型的ILT疫情發(fā)生概況。調(diào)查顯示,首先發(fā)生ILT疫情的商品肉雞主要集中在魯南和江蘇連云港等地,該地區(qū)蛋雞和麻雞飼養(yǎng)密度大,且大都曾經(jīng)免疫過ILTV活疫苗。相反,同地域的大部分商品肉雞當(dāng)時(shí)免疫率較低。其中,2019年,魯南地區(qū)喉痘疫苗(基因工程疫苗)的免疫率僅為30%;2020年免疫率為50%;2021年,免疫接種率攀升至90%。2021年7月后,該地區(qū)商品肉雞的ILT發(fā)病率陸續(xù)降至冰點(diǎn)。2022年1~9月份,未見ILT發(fā)病病例。由此可見,疫苗免疫在ILT疫情的防控方面發(fā)揮了決定性作用。

    表1 典型的發(fā)病案例及其發(fā)病概況

    2.2 病原分離

    篩選25份不同地域、不同日齡的PCR檢測(cè)ILTV陽性雞群病料,按常規(guī)通過絨毛尿囊膜(CAM)途徑接種SPF雞胚。剖檢雞胚發(fā)現(xiàn):有23份病料接種的SPF胚,其絨毛尿囊膜明顯增厚,接種部位出現(xiàn)典型的痘斑;且接種雞胚與SPF雞胚對(duì)照組相比,雞胚明顯發(fā)育較小,部分雞胚胚體出血,呈現(xiàn)出典型的ILT雞胚病變。

    2.3 PCR核酸鑒定

    取發(fā)生病變的CAM進(jìn)行處理,利用ILTV鑒定用引物PCR擴(kuò)增其ICP4基因,結(jié)果有23份有病變的雞胚分離物,其ILTV核酸PCR擴(kuò)增呈陽性。相反,沒有觀察到病變的2份樣品,其ILTV核酸檢測(cè)為陰性

    選取10份ILTV核酸檢測(cè)為陽性的樣品進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖2。PCR產(chǎn)物片段大小約為570 bp,結(jié)果符合預(yù)期。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定,SD.JQ2020等分離株ICP4基因與美國(guó)ILTV經(jīng)典雞胚疫苗株(CEO)、中國(guó)ILTV經(jīng)典強(qiáng)毒王崗株(WG)和澳大利亞CL9毒株的同源性均為100%,證實(shí)SD.JQ2020等分離株為ILTV。

    圖2 ILTV ICP4基因PCR擴(kuò)增特異性鑒定結(jié)果

    2.4 序列同源性分析

    對(duì)ILTV 的結(jié)構(gòu)蛋白gB基因的測(cè)序測(cè)定表明,其片段長(zhǎng)度為2 652 bp。核苷酸同源性比較顯示,SD.JQ2020等分離株之間gB基因同源性為99.7%~100%;與我國(guó)廣泛使用的疫苗株K317株同源性為99.6%~100%,呈現(xiàn)出較高的同源性;與美國(guó)ILTV經(jīng)典疫苗株CEO和TCO等同源性為99.6%~100%,也具有較高的同源性;與意大利、韓國(guó)等ILTV分離株同源性為99.6%~100%;與我國(guó)ILTV經(jīng)典強(qiáng)毒王崗株(WG)及澳大利亞A20和VI-99等同源性為99.5%~99.8%;但與α皰疹病毒亞科馬立克病毒屬M(fèi)DV(JF742597)的同源性僅為33.9%。

    2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹

    系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)表明,SD.JQ2020等分離毒株與ILTV CEO疫苗株、我國(guó)活疫苗K317株等處于同一分支,顯示出較近的親緣關(guān)系;而與我國(guó)ILTV經(jīng)典強(qiáng)毒王崗株(WG)、4株澳大利亞ILTV分離株遺傳距離較遠(yuǎn),處在兩個(gè)遺傳演化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的分支。這表明,目前商品肉雞ILTV流行株與我國(guó)目前常用的ILTV疫苗株遺傳關(guān)系相對(duì)較近。

    圖3 ILTV毒株gB基因系統(tǒng)發(fā)育樹

    3 討論

    3.1 成功從可疑ILT病料中分離出23株ILTV病毒株,確證了本次發(fā)生在商品肉雞、地方品種雞和蛋雞上的疫情為ILT。對(duì)ILTV 的結(jié)構(gòu)蛋白gB基因的核苷酸同源性比較顯示,SD.JQ2020等分離株與我國(guó)目前在蛋雞、種雞和麻雞等廣泛使用的疫苗株K317株高度同源。這表明,此次疫情與臨床大量使用ILTV疫苗免疫高度相關(guān)[8-9]。無獨(dú)有偶,2008年美國(guó)商品肉雞發(fā)生的ILT,也與CEO疫苗免疫高度相關(guān)[10-11]。

    3.2 針對(duì)魯南地區(qū)的ILT疫情溯源發(fā)現(xiàn),此次ILT疫情的發(fā)生與魯南和蘇北地區(qū)家禽飼養(yǎng)模式密不可分。該地區(qū)蛋雞、麻雞飼養(yǎng)數(shù)量較大,且大都經(jīng)過了ILTV活疫苗免疫。此外,魯南地區(qū)在2018年以后,商品肉雞經(jīng)歷了高速的發(fā)展期,從事養(yǎng)殖的肉雞公司增多,新建立的雞場(chǎng)飼養(yǎng)規(guī)模較大,配套的一條龍企業(yè)如屠宰加工企業(yè)也較多,進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)魯南地域家禽飼養(yǎng)密度較大,蛋雞與肉雞交互飼養(yǎng),再加上蛋雞糞便、垃圾等清理不及時(shí),導(dǎo)致疫苗毒擴(kuò)散。此外,值得反思的還有,非洲豬瘟帶來的意外“肉雞火爆”行情,讓大多數(shù)養(yǎng)殖者被利潤(rùn)沖昏了頭腦,盲目擴(kuò)張,忽視了雞場(chǎng)的生物安全建設(shè)和管理。

    3.3 疫苗是控制ILT發(fā)生最重要的技術(shù)手段。ILTV弱毒活疫苗包括雞胚來源疫苗(CEO)和組織來源疫苗(TCO),均屬于中等毒力,存在一定的安全隱患[12]。在4~12周齡(育成雞)免疫接種效果最佳。但一般不能對(duì)4周齡以下的雛雞接種,以免造成傷害。在實(shí)際生產(chǎn)中,個(gè)別養(yǎng)殖者忽視上述常識(shí),對(duì)18日齡商品肉雞進(jìn)行免疫接種,結(jié)果導(dǎo)致雞群發(fā)病。比較而言,基因工程疫苗似乎更適合于商品肉雞的免疫[13]。

    常用的基因工程疫苗通常包括載體疫苗和重組疫苗。王云峰等(2001)利用雞痘病毒(FPV)為載體,成功表達(dá)ILTV中國(guó)王崗株gB基因,通過動(dòng)物試驗(yàn)表明該載體病毒無論對(duì)商品雞還是SPF雞的免疫保護(hù)均具有較高的保護(hù)性[14]。此外,國(guó)外有兩個(gè)成熟的商業(yè)重組ILTV疫苗,在臨床應(yīng)用較廣[15]:一是由CEVA公司生產(chǎn)(Biomune公司),其以FPV作為載體插入ILTV的gB和UL32基因,特點(diǎn)是見效快,適合于商品肉雞;二是由Intervet公司生產(chǎn),將ILTV的gI和gD基因克隆到火雞皰疹病毒(HVT)基因[16],特點(diǎn)是維持期長(zhǎng),適合于蛋種雞。上述兩種疫苗均適合于胚胎接種或1日齡雛雞接種,安全系數(shù)較高。

    3.4 經(jīng)歷了2020~2021年的ILT疫情后,不同的家禽飼養(yǎng)企業(yè)加大了針對(duì)ILTV疫苗的免疫[17]。以魯南地區(qū)為例,至2021年6月份,90%以上的魯南雞場(chǎng)分別采用CEVA公司生產(chǎn)的喉痘疫苗進(jìn)行了ILTV的疫苗接種。同時(shí),各公司加大了各飼養(yǎng)廠區(qū)的生物安全管理[18]。具體表現(xiàn)在:一是強(qiáng)化疫苗接種;二是將雞舍空舍時(shí)間延長(zhǎng)10 d以上,重視空舍期間的衛(wèi)生消毒;三是合理布局新雞場(chǎng),最大限度地規(guī)避與蛋雞場(chǎng)、麻雞場(chǎng)等不同雞場(chǎng)的生物安全距離;四是加強(qiáng)了對(duì)外來車輛的管理,禁止外來車輛進(jìn)入;五是加強(qiáng)了對(duì)雞場(chǎng)糞便及其污染物的處理。通過以上綜合措施的實(shí)施,2021年7月以后的ILT疫情大幅度減少。持續(xù)的跟蹤檢測(cè)顯示,2021年10月~2022年9月,魯南地區(qū)ILT的發(fā)病幾乎為零,達(dá)到了理想的控制效果。

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