2018—2021 年甘肅省武威市羊布魯氏菌S2 疫苗免疫抗體監(jiān)測(cè)

王建軍，張金學(xué)，方玉鵬，馬金寶，董 偉，李曉燕，魏曉燕

（1.武威市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，甘肅武威 733000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070）

布魯氏菌?。╞rucellosis），簡(jiǎn)稱(chēng)布病，是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的一種嚴(yán)重人獸共患病[1]。我國(guó)人間布病病例自2000 年開(kāi)始呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)[2]，2021 年全國(guó)布病發(fā)病人數(shù)達(dá)到69 767 人。布病給公共衛(wèi)生安全造成了巨大威脅。2016 年，農(nóng)業(yè)部和衛(wèi)生部聯(lián)合下發(fā)了《國(guó)家布魯氏菌病防治計(jì)劃（2016—2020 年）》，為布病的有效控制和凈化提供了政策支撐[3]。甘肅省為布病一類(lèi)地區(qū)，采取以免疫接種為主的防控策略，并日常檢測(cè)免疫抗體。武威市自2016 年起通過(guò)對(duì)全市牛羊（種畜除外）實(shí)行全群強(qiáng)制免疫，在區(qū)域范圍內(nèi)有效控制了布病流行。

目前國(guó)內(nèi)用于布病防疫的疫苗主要有3 種：布魯氏菌活疫苗S2 株、A19 株、M5 株，其中S2株活疫苗（以下簡(jiǎn)稱(chēng)S2 疫苗）使用范圍最廣，并可口服免疫，對(duì)牛、羊、豬、鹿等均能產(chǎn)生良好的免疫力。近年來(lái)，相關(guān)研究人員針對(duì)S2 疫苗的免疫抗體消漲規(guī)律、免疫方式、免疫劑量開(kāi)展了大量研究，但主要為小群范圍的試驗(yàn)研究，缺乏不同規(guī)模、大區(qū)域、多變量、多年度等生產(chǎn)實(shí)際情況下的免疫抗體數(shù)據(jù)。為掌握武威市S2 疫苗的免疫效果，本研究自2018 年起對(duì)武威市羊布魯氏菌S2 疫苗灌服免疫后產(chǎn)生的免疫抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以期為布病防控程序設(shè)計(jì)和防控計(jì)劃完善提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

樣品來(lái)自2018—2021 年武威市部分規(guī)模羊場(chǎng)戶12 月齡以上未孕母羊。以年為試驗(yàn)周期，每個(gè)周期內(nèi)分別選取試驗(yàn)羊場(chǎng)。試驗(yàn)羊場(chǎng)納入時(shí)，綜合考慮羊品種以及羊場(chǎng)戶縣區(qū)分布、存欄規(guī)模等因素，結(jié)合羊場(chǎng)戶對(duì)試驗(yàn)的配合情況，同時(shí)剔除有感染抗體陽(yáng)性的羊場(chǎng)戶，最終確定試驗(yàn)羊場(chǎng)戶數(shù)量。2018—2021 年共從涼州、民勤、古浪、天祝等縣區(qū)調(diào)查不同飼養(yǎng)品種、不同養(yǎng)殖規(guī)模的羊養(yǎng)殖場(chǎng)戶71個(gè)（表1）。

表1 2018—2021 年武威市免疫抗體監(jiān)測(cè)羊場(chǎng)戶數(shù)量分布 單位：個(gè)

1.2 主要試劑與制品

1.2.1 試劑 布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）抗原和試管凝集試驗(yàn)（SAT）抗原，布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性與陰性血清，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。以上試劑均按要求存放，并在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 疫苗 布魯氏菌活疫苗（S2 株），為新疆天康生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備 一次性采血管、1.5 mL 離心管、臺(tái)式低速離心機(jī)、單道移液器等。

1.4 方法

1.4.1 免疫抗體檢測(cè) 參考疫苗說(shuō)明書(shū)，用疫苗稀釋液對(duì)S2 疫苗進(jìn)行稀釋?zhuān)凑? 頭份（1×1010CFU）接種劑量，使用全密封口服接種槍?zhuān)瑢?duì)試驗(yàn)羊場(chǎng)12月齡以上未孕母羊群體進(jìn)行灌服免疫接種，以同場(chǎng)中的6～12 月齡后備母羊?yàn)閷?duì)照組（對(duì)照組接種同等劑量稀釋液），保證免疫接種劑量相同；分別在免疫后28 和60 d，采集羊頸部靜脈血液，分離血清，做好標(biāo)記，-20 ℃冷凍保存，用于免疫抗體檢測(cè)。

1.4.2 血清學(xué)檢測(cè) 采用RBPT 進(jìn)行初檢，SAT進(jìn)行復(fù)核確認(rèn)。RBPT 和SAT 具體操作與結(jié)果判定，按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2018）[4]進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 軟件對(duì)采樣場(chǎng)群數(shù)和血清樣品數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用GraphPad Prism 7 軟件對(duì)不同年度、不同縣區(qū)、不同品種以及不同規(guī)模羊場(chǎng)戶的免疫抗體陽(yáng)性率（轉(zhuǎn)陽(yáng)率）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總體情況

2018—2021 年共采集71 個(gè)羊場(chǎng)戶的8 243 份羊血液樣本，涵蓋高山細(xì)毛羊、藏羊、小尾寒羊和湖羊4 個(gè)品種。經(jīng)RBPT 初篩和SAT 復(fù)核，對(duì)照組免疫抗體均為陰性；試驗(yàn)組免疫后28 d 共檢出抗體陽(yáng)性4 585 份，抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率為55.62%，60 d 共檢出抗體陽(yáng)性1 378份，抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率為16.72%（表2）。

表2 武威市布魯氏菌S2 疫苗免疫抗體檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 不同年度情況

統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖1）顯示：免疫后28 d，各年度的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率整體呈升高趨勢(shì)，其中2018 年最低（53.21%），2021 年最高（57.91%）；60 d 時(shí)抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率出現(xiàn)一定起伏，2019 年最高（17.81%），2018 年最低（15.55%）。但不同年度間免疫后28 d 和60 d 的免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 不同年度布魯氏菌免疫抗體變化趨勢(shì)

2.3 不同縣區(qū)情況

統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖2）顯示：不同縣區(qū)的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率存在一定差異。免疫后28 d，天?？h的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率最高（59.18%），民勤縣最低（52.87%），差異顯著（0.01 ＜P＜0.05），而其他縣區(qū)間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；免疫后60 d，各縣區(qū)間的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 不同縣區(qū)間布魯氏菌免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率對(duì)比結(jié)果

2.4 不同品種情況

不同品種統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖3）顯示：免疫后28 d，不同品種間的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率存在一定差異，藏羊（59.04%）、高山細(xì)毛羊（58.06%）抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率較高，小尾寒羊最低（51.94%），與藏羊、高山細(xì)毛羊差異顯著（0.01 ＜P＜0.05），其他品種間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；免疫后60 d，藏羊抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率最高（17.89%），小尾寒羊最低（15.30%），但品種間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 不同品種布魯氏菌免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率對(duì)比結(jié)果

2.5 不同規(guī)模情況

不同規(guī)模羊場(chǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖4）顯示：免疫后28 d，存欄量小于100 只和大于100 只的羊場(chǎng)戶抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；免疫后60 d，不同規(guī)模場(chǎng)戶間的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率差異極顯著（P＜0.01）。

圖4 不同規(guī)模場(chǎng)戶布魯氏菌免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率對(duì)比結(jié)果

3 討論

S2 疫苗是用于我國(guó)羊布病防控的主要疫苗，以口服免疫為主要途徑。在口服免疫接種劑量及抗體消漲規(guī)律研究方面：鐘映梅等[6]研究表明，羊口服S2 疫苗后30 d 的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率為52.63%，135 d 時(shí)降至0；趙詠中等[5]報(bào)道，綿羊在口服150 億CFU S2 疫苗后21 d，抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率可達(dá)83%，抗體存續(xù)時(shí)間可達(dá)150 d，而注射免疫產(chǎn)生的免疫抗體存續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，且抗體滴度更高。本監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，S2 疫苗在口灌服1×1010CFU 劑量下，免疫后28 d 的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率僅為50%左右，至60 d 時(shí)降至15%左右，抗體存續(xù)時(shí)間與樊生平等[7]的研究結(jié)果相似。劉燕等[8]報(bào)道，S2 疫苗陰道灌注免疫方式的免疫保護(hù)效果優(yōu)于點(diǎn)眼免疫，但免疫抗體持續(xù)時(shí)間短于注射免疫。黃新等[9]報(bào)道，S2 疫苗經(jīng)氣霧免疫的抗體陽(yáng)性率變化曲線與口服免疫途徑相同，但在成年羊體內(nèi)產(chǎn)生的特異性血清抗體陽(yáng)性率優(yōu)于口服免疫。孫晶晶等[10]報(bào)道，S2 疫苗經(jīng)灌服免疫所產(chǎn)生細(xì)胞因子要優(yōu)于M5 疫苗。李艷軍[11]報(bào)道，S2 疫苗以200 億CFU 劑量灌服免疫的抗體陽(yáng)性率顯著優(yōu)于100 億CFU 劑量灌服免疫以及首免后21 d 加強(qiáng)免疫模式。

綜上，S2 疫苗注射免疫產(chǎn)生的抗體保護(hù)期更長(zhǎng)，抗體滴度更高，劑量更低；氣霧免疫產(chǎn)生的血清抗體陽(yáng)性率優(yōu)于口服免疫，但有氣溶膠感染風(fēng)險(xiǎn)，操作要求較高；陰道黏膜免疫的保護(hù)效果優(yōu)于點(diǎn)眼免疫，但抗體持續(xù)時(shí)間短于注射免疫；S2 疫苗灌服免疫時(shí)劑量加倍，可提高抗體陽(yáng)性率，但保護(hù)期與正常劑量相同。另外，S2 疫苗為弱毒活疫苗，灌服途徑主要產(chǎn)生黏膜免疫與細(xì)胞免疫，血清抗體檢測(cè)結(jié)果并不能完全體現(xiàn)疫苗保護(hù)效率。因此，S2疫苗不同免疫方式和免疫劑量所產(chǎn)生的免疫效果可能不同。今后需探索S2 疫苗在不同接種途徑與劑量情況下，免疫動(dòng)物細(xì)胞因子表達(dá)情況與血清抗體陽(yáng)性率的綜合結(jié)果，以此來(lái)完善現(xiàn)有免疫程序。

本監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在灌服1×1010CFU 條件下，大群的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率要略低于小群，且抗體存續(xù)時(shí)間明顯短于小群。其原因可能是小群試驗(yàn)的影響因素可控。小群試驗(yàn)樣本量較小，納入試驗(yàn)的個(gè)體一致性較好；試驗(yàn)時(shí)能保證接種劑量，避免漏免等情況發(fā)生，而且飼養(yǎng)管理水平也能夠保持穩(wěn)定。而大群試驗(yàn)則無(wú)法做到影響因素的穩(wěn)定控制，而且影響因素比小群體要多，實(shí)際情況更加復(fù)雜，因而實(shí)際效果可能要比小群差一點(diǎn)。

監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同縣區(qū)的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率表現(xiàn)出一定的差異。這可能與不同地區(qū)布病強(qiáng)制免疫工作的落實(shí)情況有一定的關(guān)系，但這種差異并不明顯。監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，藏羊和高山細(xì)毛羊的免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率要高于小尾寒羊，在28 d 時(shí)表現(xiàn)為差異顯著。藏羊是我國(guó)現(xiàn)存最古老的三大原始綿羊品種之一，主要分布于青藏高原[12]，而高山細(xì)毛羊是20 世紀(jì)80 年代初在祁連川高寒牧區(qū)育成的毛肉兼用品種。這兩個(gè)品種在當(dāng)?shù)鼐休^長(zhǎng)的適應(yīng)時(shí)間，且個(gè)體高大，耐粗飼[13]。飼養(yǎng)管理模式在夏秋季節(jié)以放牧為主，冬春季輔以舍飼，而放牧草場(chǎng)地處高海拔地區(qū)，環(huán)境條件較為惡劣，從而使其具備了較強(qiáng)的適應(yīng)能力，抗病性較高。而湖羊和小尾寒羊則主要引自太湖流域、山東等平原地區(qū)，個(gè)體相對(duì)較小，在高海拔、低濕度等地區(qū)抗逆性與適應(yīng)性相對(duì)較弱。因此，免疫抗體陽(yáng)性率的差異可能與不同品種羊群的適應(yīng)性和抗病性有一定的關(guān)系。

本監(jiān)測(cè)結(jié)果提示，在實(shí)際的大范圍羊群免疫接種時(shí)，要控制好影響免疫效果的各種因素。要制定標(biāo)準(zhǔn)化免疫接種程序，明確合理的接種劑量、免疫方式和免疫次數(shù)，選擇合適的疫苗種類(lèi)，按照正確的操作程序開(kāi)展免疫接種，既要保證免疫質(zhì)量，也要保證免疫覆蓋率達(dá)到100%。另外，還要提升綜合飼養(yǎng)管理水平，減少免疫過(guò)程中的應(yīng)激。

4 結(jié)論

監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)：武威市羊群S2 疫苗口服免疫后的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率總體不高，抗體存續(xù)時(shí)間較短；不同年度、不同縣區(qū)的免疫效果基本一致；藏羊、高山細(xì)毛羊的免疫效果明顯好于小尾寒羊，小規(guī)模羊群的免疫效果略好于大規(guī)模羊群。結(jié)果提示，布病大群免疫需綜合考慮大群免疫影響因素，探索S2 疫苗的最佳免疫模式和免疫劑量，確保免疫覆蓋率，以提升整體免疫效果。