犬瘟熱、犬細小病毒膠體金二聯(lián)檢測卡研制

余春明，鄭雪瑩，范君文，史 記，李華斌，鄭金來，鄧柏林

（1.北京市動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629；2.北京標馳澤惠生物科技有限公司，北京 102629）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，在春冬季節(jié)多發(fā)，導(dǎo)致病犬的肺、脾、肝等多種臟器產(chǎn)生病變。CDV 可通過排泄物、氣溶膠等傳播，病犬是其主要傳染源[2]。CDV 宿主種類繁多，除犬類外，貓類、熊類甚至海洋哺乳動物也可被感染[3]。此外在人類骨組織中也曾檢出CDV基因，提示其可能對人類健康有潛在危害[4]。犬細小病毒病由犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）引起，臨床癥狀主要為出血性腸炎和心肌炎[5-8]，患病犬只表現(xiàn)為食欲不振、精神萎靡。CPV 的傳染源主要是病犬及其排泄物，康復(fù)的犬只也可長時間帶毒。這兩種病的發(fā)病率和死亡率均較高，發(fā)病后如不及時治療，犬瘟熱死亡率可達80%以上[9]，犬細小病毒病也可達50%[10-11]。

犬瘟熱和犬細小病毒病在發(fā)病早期臨床癥狀相似，且往往呈混合感染，單憑臨床癥狀難以作出鑒別診斷，確診必須借助實驗室手段[12]。目前國內(nèi)檢測CDV、CPV 的現(xiàn)行標準主要基于病毒分離鑒定和免疫學(xué)試驗，但這些方法均存在耗時較長、操作繁瑣等缺點[13]。免疫膠體金快速診斷技術(shù)是一種將金標記、免疫檢測和液相層析等技術(shù)合為一體的固相標記免疫檢測技術(shù)，具有簡便快速、特異性強、靈敏度高、肉眼可判讀、結(jié)果易保存、無需特殊儀器等優(yōu)點，已在醫(yī)學(xué)、動植物檢疫、食品安全監(jiān)督等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[14]。為了實現(xiàn)CDV和CPV 的同步快速檢測，本研究開發(fā)了CDV、CPV 膠體金二聯(lián)檢測卡，用于兩種疾病的臨床快速診斷和大規(guī)模檢測工作，以期為提高犬源重要傳染病的監(jiān)測和控制水平提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與實驗動物 CDV、CPV，均由北京標馳澤惠生物科技有限公司提供；SPF 級Balb/c 小鼠（8～12 周齡，雌性），購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 弗氏完全佐劑、PEG 4000、HAT（H0262）、BSA，購自Sigma 公司；HRP-山羊抗小鼠IgG，購自北京博爾西科技有限公司；Protein A 親和層析柱，購自GE 公司；抗體類及亞類膠體金檢測試紙條，購自北京五康新興生物技術(shù)有限公司；2 種CDV 抗原快速檢測卡，分別購自賽諾利康生物技術(shù)有限公司（A）、深圳芬德生物技術(shù)有限公司（B）；2 種CPV 抗原快速檢測卡，分別購自北京榮科利康科技有限公司（英國STANDARD 檢測卡，C）、義烏市寵愛有佳寵物用品有限公司（美國艾博檢測卡，D）；CDV 熒光定量PCR 檢測試劑盒，購自中聯(lián)瑞生物科技有限公司；CPV 熒光定量PCR 檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司；XYZ 三維劃膜噴金儀，購自上海金標生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫小鼠 分別以CDV 和CPV 為免疫原，將200 μg 病毒與200 μL 弗氏完全佐劑混合后充分乳化，每只Balb/c 小鼠多點皮下注射200 μL；2 周后加強免疫，佐劑換為弗氏不完全佐劑，免疫量不變；間隔2 周后進行第二次加強免疫，免疫量不變；在細胞融合前3 d，腹腔注射含200 μg 病毒抗原的生理鹽水，以進一步增強免疫效果。

1.2.2 雜交瘤細胞株制備和篩選 用常規(guī)方法收集免疫小鼠的脾細胞，將脾細胞與SP2/0 骨髓瘤細胞按10:1 體積比在500 g/L PEG 4 000 的誘導(dǎo)下進行融合；將融合的細胞用HAT 培養(yǎng)液在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中選擇培養(yǎng)10～15 d；取上清用間接ELISA 法篩選分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。間接ELISA 的操作步驟：用110 μL 質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的病毒抗原包被板，拍干后，以1%BSA 封閉液封閉，以1:2 000 稀釋的免疫小鼠血清為陽性對照，以無克隆生長的培養(yǎng)基上清和正常小鼠血清為陰性對照，每孔加入100 μL 1:2 000 稀釋的HRP-山羊抗小鼠IgG。測定各孔OD450nm，以O(shè)D450nm大于陰性對照孔OD450nm的2 倍為陽性判斷依據(jù)。

1.2.3 雜交瘤細胞株鑒定 進行多次亞克隆和間接ELISA 篩選，以細胞培養(yǎng)液為陰性對照。P/N＞2.1 判為陽性，否則判為陰性。將分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株按照克隆位置進行編號。

1.2.4 抗體效價測定 采用間接ELISA 法檢測雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清的抗體效價。以空白細胞培養(yǎng)液為陰性對照，以免疫小鼠血清為陽性對照。測定各孔OD450nm，以O(shè)D450nm大于陰性對照孔OD450nm的2 倍為陽性判斷依據(jù)。

1.2.5 雜交瘤細胞株傳代培養(yǎng) 將雜交瘤細胞株在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液（含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）中連續(xù)培養(yǎng)、傳代。培養(yǎng)到第10 代后，通過間接ELISA 法檢測培養(yǎng)液的抗體效價，并在倒置顯微鏡下觀察細胞是否能夠連續(xù)傳代，判斷細胞株是否為可持續(xù)增殖、穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

1.2.6 雜交瘤細胞保存 去掉細胞培養(yǎng)瓶中舊的培養(yǎng)液，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，使細胞懸浮；1 000 r/min 離心10 min，去上清，細胞沉淀用細胞凍存液（二甲基亞砜:胎牛血清:RPMI-1640 體積比為1:2:7）復(fù)溶制成懸液，密度為5.0×105個細胞/mL；臺盼蘭染色，計數(shù)活細胞（占比95%以上合格）；將細胞無菌分裝至細胞凍存管，1.0 mL/管；4 ℃放置2 h 后-20 ℃放置2 h，之后液氮罐氣態(tài)部分（-70 ℃）放置2 h，最后轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。

1.2.7 單克隆抗體制備及純化 選擇成年Balb/c 小鼠，每只小鼠腹腔接種0.5 mL 液體石蠟；7～10 d 后每只小鼠腹腔接種1×106～5×106個第16 代雜交瘤細胞；7 d 后，小鼠腹部明顯膨大，待行動不便時斷頸采集腹水；腹水經(jīng)10 000 r/min 離心30 min，除去細胞成分和其他沉淀物，收集上清用15～30 倍體積的10 mmol/L PBS 稀釋，用Protein A 親和層析柱進行親和純化，上柱液為pH 7.0～7.6的10 mmol/L 的PBS 緩沖液，洗脫液為pH 3.5 的100 mmol/L 檸檬酸緩沖液，洗脫下來的抗體盡快用1 mol/L pH 9.6 的Tris-HCl 調(diào)整pH 至中性，得到單克隆抗體。

1.2.8 單克隆抗體鑒定

1.2.8.1 純度鑒定 對獲得的單克隆抗體進行8%SDS-PAGE 電泳純度鑒定。取20 μL 抗體與15 μL SDS 上樣緩沖液混合點樣，80 V 電泳30 min。

1.2.8.2 類及亞類鑒定 采用抗體類及亞類膠體金試紙條檢測單克隆抗體亞型。

1.2.9 膠體金二聯(lián)檢測卡研制

1.2.9.1 硝酸纖維素膜包被 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，以1C5（標記）-4B5（包被）、1C6（標記）-4B8（包被）的配對模式研制膠體金試紙條（圖1）。用質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的單克隆抗體4B5 包被檢測T1 線，質(zhì)量濃度為3 mg/mL 的單克隆抗體4B8包被檢測T2 線，質(zhì)量濃度為3 mg/mL 的HRP-山羊抗小鼠IgG 包被質(zhì)控C 線。具體操作步驟：用XYZ 三維劃膜噴金儀分別將上述抗體噴于300 mm長、20 mm 寬的硝酸纖維素膜上；質(zhì)控C 線和檢測T1 線與檢測T1 線和T2 線間距均為0.3 cm；將包被好的硝酸纖維素膜置于干燥室中（相對濕度≤30%）干燥6 h 備用。

圖1 膠體金檢測卡結(jié)構(gòu)

1.2.9.2 單克隆抗體標記膠體金 在磁力加熱攪拌作用下，向三角瓶中加入145 mL 純化水，煮沸；加入5 mL 1%四氯化金溶液，煮沸；加入7 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，煮沸5 min，得到膠體金溶液，冷卻后保存于2～8 ℃。取1 mL 膠體金溶液于離心管中，加入10 μL 0.2 mol/L 的碳酸鉀溶液，室溫靜置5 min；加入10 μL 單克隆抗體1C5，混勻后靜置30 min；加入10 μL 20% BSA 溶液，平衡5 min；加入10 μL 20% PEG 20000 溶液，平衡30 min；10 000 r/min 離心10 min，去上清液；加入100 μL 金標復(fù)溶液（含有2%蔗糖、1%酪蛋白、0.5% BSA、0.1% Triton X 100、0.1% SDS 的硼酸緩沖液）后備用。用同樣方法標記抗體1C6。

1.2.9.3 結(jié)合物釋放墊制備 將膠體金標記的單克隆抗體1C5 和1C6 等體積混合，按照8 μL/cm的速度噴膜，置于干燥室中（相對濕度≤30%）干燥6 h 備用。

1.2.9.4 膠體金試紙條和檢測卡組裝 在PVC 背板上粘貼硝酸纖維素膜，在靠近硝酸纖維素膜質(zhì)控C 線的一端粘貼吸水墊，在靠近檢測T2 線的一端粘貼結(jié)合物釋放墊和樣品墊，按所需大小進行切割，得到CDV、CPV 檢測膠體金試紙條，放入干燥劑后密封保存。將制備的膠體金試紙條裝入塑料卡中，制成檢測卡。

1.2.10 膠體金二聯(lián)檢測卡特性測試

1.2.10.1 特異性測試 利用制備的膠體金檢測卡分別檢測CDV、CPV、犬冠狀病毒（CCV）、犬傳染性肝炎病毒（ICHV）和犬副流感病毒（CPIV），觀察有無檢測條帶出現(xiàn)。

1.2.10.2 靈敏度測試 將CDV、CPV 的重組質(zhì)粒分別稀釋至拷貝數(shù)濃度依次為1.3×105～1.3×100拷貝/μL，并用熒光定量PCR 方法進行同步檢測，檢驗?zāi)z體金檢測卡的靈敏度。

1.2.10.3 準確性測試 分別在東城、西城、朝陽、順義、大興、懷柔6 個區(qū)/縣，各選取5 個動物診療機構(gòu)作為CDV、CPV 膠體金二聯(lián)檢測卡應(yīng)用示范點。每季度采樣1 次，每次采樣20 份，1 年為1個周期，共采樣4 次，采樣量約2 000 份。以熒光定量PCR 檢測結(jié)果作為參考，使用本研究制備的二聯(lián)檢測卡與目前應(yīng)用較多的4 種單一檢測卡進行同步檢測，評價其臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞鑒定

經(jīng)過2 次細胞融合，4 次亞克隆和間接ELISA篩選，獲得多株可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。根據(jù)克隆產(chǎn)生位置編號，分別命名為1C5（CDV）、4B5（CDV）、1C6（CPV）、4B8（CPV）和5F8（CPV），其中5F8雜交瘤細胞株抗體信號較弱。

2.2 抗體效價測定

經(jīng)測定，1C5、4B5、1C6、4B8 雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清的效價均≥1:320，5F8 雜交瘤細胞效價接近1:80，效價較低。結(jié)合初步篩選時5B8 抗體信號較弱，故將其放棄，選擇1C5、4B5、1C6和4B8 雜交瘤細胞株進行后續(xù)試驗。

2.3 雜交瘤細胞傳代培養(yǎng)

經(jīng)驗證，4 株雜交瘤細胞傳至10 代以上仍然生長良好、能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體，培養(yǎng)液上清效價均≥1:320。

2.4 抗體純度鑒定

SDS-PAGE 電泳結(jié)果（圖2）顯示，4 株單克隆抗體均出現(xiàn)兩條帶，無明顯雜帶。說明抗體純度良好，可以滿足試驗需求。

圖2 4 株單克隆抗體純度鑒定結(jié)果

2.5 抗體類及亞類鑒定

經(jīng)檢測，4 株單克隆抗體均為IgG 亞型。

2.6 膠體金二聯(lián)檢測卡特異性測試

利用制備的膠體金檢測卡分別檢測CDV、CPV、CCV、ICHV 和CPIV。結(jié)果（圖3）顯示，僅CDV 和CPV 出現(xiàn)檢測線，其他病毒均未出現(xiàn)檢測線。

圖3 膠體金二聯(lián)檢測卡特異性測試結(jié)果

2.7 膠體金檢測卡靈敏度測試

結(jié)果（圖4）顯示，熒光定量PCR 和膠體金檢測卡檢測CDV 陽性DNA 模板的最低檢測限分別為1.3×101和1.3×102拷貝/μL；檢測CPV陽性DNA 模板的最低檢測限分別為1.3×101和1.3×102拷貝/μL。

圖4 熒光定量PCR 及膠體金二聯(lián)檢測卡靈敏度測試結(jié)果

2.8 準確度測試

本研究制備的膠體金二聯(lián)檢測卡、市場上常用的A、B 抗原快速檢測卡與CDV 熒光定量PCR結(jié)果的符合率分別為88.0%、86.0% 和90.0%（表1）；二聯(lián)檢測卡與A、B 檢測卡的符合率分別為97.7%和97.8%（表2）。

表1 3 種CDV 檢測卡結(jié)果與熒光定量PCR 結(jié)果的符合率統(tǒng)計

表2 3 種CDV 檢測卡結(jié)果的符合率統(tǒng)計

本研究制備的膠體金二聯(lián)檢測卡、市場上常用的C、D 抗原快速檢測卡與CPV 熒光定量PCR的符合率分別為90.8%、92.5%和88.3%（表3）；二聯(lián)檢測卡與C、D 檢測卡的符合率分別為98.2%和97.2%（表4）。

表3 3 種CPV 檢測卡結(jié)果與熒光定量PCR 結(jié)果的符合率統(tǒng)計

表4 3 種CPV 檢測卡結(jié)果的符合率統(tǒng)計

3 討論

隨著人們生活水平的提高，犬只的飼養(yǎng)量也在飛速增長。截至2018 年，北京市注冊犬數(shù)達到100 萬只以上。據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)推算，我國養(yǎng)犬數(shù)量超過1.3 億只。寵物犬作為主要伴侶動物，其健康關(guān)系到億萬家庭的和諧。犬瘟熱和犬細小病毒病是犬中常發(fā)的兩大傳染病，早期的臨床癥狀相似且常為混合感染。在寵物犬中，貴賓犬、松獅犬是犬細小病毒病易感品種，吉娃娃、金毛犬是犬瘟熱易感品種，哈士奇對二者都易感[15]。目前犬瘟熱和犬細小病毒病主要以免疫預(yù)防為主，并配合早發(fā)現(xiàn)、早治療，但現(xiàn)行常用的實驗室檢測方法步驟繁瑣，耗時較長，檢測成本也較高，市面上常見的膠體金試紙條也大都針對單一病毒。

本研究通過細胞融合獲得了4 株可穩(wěn)定分泌CDV 和CPV 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并以此為基礎(chǔ)制備了膠體金二聯(lián)檢測卡，實現(xiàn)了CDV和CPV 的同步快速檢測。該檢測卡特異性強，只與CDV 和CPV 產(chǎn)生檢測條帶，而不與CCV、ICHV、CPIV 等犬類病毒反應(yīng)；靈敏度高，其靈敏度僅比熒光定量PCR 方法低10 倍，最低檢測限可達102拷貝/μL；準確性好，與熒光定量PCR 方法的符合率高于88.0%，與市面上常用的單一病毒檢測卡符合率高于97.2%。以上結(jié)果說明，本研究制備的膠體金二聯(lián)檢測卡作為一種早期快速篩選試劑，可以滿足大規(guī)模檢測的需求，具有較好的市場前景和應(yīng)用價值。