楊麗萍 毛寶宏 劉倩 王燕俠 李靜 代志蓉 李亞梅④
(甘肅省中醫(yī)院公共衛(wèi)生與醫(yī)院感染管理處,蘭州730050)
復(fù) 發(fā) 性 流 產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指在妊娠28周之前有2次以上的胎兒丟失,影響著2%~5%的育齡期女性[1]。RSA在臨床上缺乏特異性且致病原因復(fù)雜,主要與遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染、免疫、環(huán)境等因素密切相關(guān),目前仍有50%的RSA患者原因未明[2]。有研究表明,Th1/Th2細(xì)胞平衡對(duì)母體免疫耐受和妊娠維持至關(guān)重要[3]。單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子在脂質(zhì)代謝、凝血、胰島素抵抗等方面的多功能作用均與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)有關(guān),而IL-6作為T(mén)h2細(xì)胞因子,在促進(jìn)胚胎著床、下調(diào)細(xì)胞免疫反應(yīng)以及維持妊娠方面具有重要意義[4]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外已有部分研究涉及IL-6基因多態(tài)性與URSA的關(guān)系,但研究結(jié)論尚不一致,且未進(jìn)行環(huán)境-基因交互作用分析[5-6]。因此,本研究采用病例對(duì)照的研究方法,探討甘肅蘭州地區(qū)育齡期女性IL-6相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleo?tide polymorphism,SNP)及環(huán)境危險(xiǎn)因素與URSA的遺傳易感性,以期為臨床基因篩查和預(yù)防策略的制定提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 資料
1.1.1 研究對(duì)象以2019年1月至2020年8月在甘肅省婦幼保健院復(fù)發(fā)性流產(chǎn)門(mén)診就診的150例URSA患者為病例組,入選標(biāo)準(zhǔn):①因胚胎停止發(fā)育導(dǎo)致2次及2次以上URSA者;②甲狀腺激素、胰島素、性激素等內(nèi)分泌檢查正常;③月經(jīng)周期及排卵正常;④生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)正常且無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒等感染者;⑤免疫學(xué)相關(guān)抗體篩查(抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗β2-糖蛋白Ⅰ抗體)正常;⑥丈夫精液分析正常。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有甲狀腺及肝腎功能性疾病者;②凝血功能異常者;③染色體及生殖系統(tǒng)異常者;④其他由遺傳、免疫、感染等因素導(dǎo)致的流產(chǎn)。選取同期在本院體檢的150例健康女性為對(duì)照組,入選標(biāo)準(zhǔn):①至少成功分娩過(guò)1胎的育齡期女性;②無(wú)RSA及死胎、死產(chǎn)史;③生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)正常且無(wú)遺傳、內(nèi)分泌異常和感染。
1.1.2 主要試劑與儀器全自動(dòng)核酸純化儀HF16 Plus[愷碩生物科技(廈門(mén))有限公司];2720型PCR擴(kuò)增儀(ABI);蝦堿酶(Promega);外切酶Ⅰ(Epicentre);SNaPshot Multiplex Kit(ABI);FR-110紫外分析儀、FR-250電泳儀(上海復(fù)日科技有限公司);凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 基線(xiàn)調(diào)查方法經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后,研究對(duì)象在自愿參與的基礎(chǔ)上,由統(tǒng)一培訓(xùn)的專(zhuān)職醫(yī)務(wù)人員以面對(duì)面詢(xún)問(wèn)的形式現(xiàn)場(chǎng)填寫(xiě)調(diào)查表,獲取一般人口學(xué)特征、生理生育史、環(huán)境暴露史及相關(guān)生活行為特征。同時(shí)采集每位研究對(duì)象外周血3 ml,于2 h內(nèi)入庫(kù)深低溫(-80℃)儲(chǔ)存。
1.2.2 DNA提?、僭?.0 ml樣品管內(nèi)加入40μl蛋白酶K溶液(10 mg/ml),再加入400μl解凍后的全血樣本進(jìn)行預(yù)處理;②嚴(yán)格按照相關(guān)操作步驟,利用全自動(dòng)核酸純化儀HF16 Plus及其配套試劑盒進(jìn)行全自動(dòng)DNA提??;③使用分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA濃 度 和 純 度,DNA濃 度>20 ng/μl表 明 提 取成功。
1.2.3 基因分型本研究采用SNaPshot多重SNP分型技術(shù)對(duì)rs1800796位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)。SNaPshot多重SNP分型技術(shù)由美國(guó)應(yīng)用生物公司(ABI)開(kāi)發(fā)的一種基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù),也稱(chēng)小測(cè)序,主要用于中等通量的SNP分型,其優(yōu)勢(shì)為分型準(zhǔn)確、通量高、檢測(cè)速度快,且不受樣本個(gè)數(shù)與SNP位點(diǎn)多態(tài)性特性限制。引物用在線(xiàn)Primer3軟件設(shè)計(jì)(http://bioinfo.ut.ee/prim?er3-0.4.0/),引物序列及長(zhǎng)度見(jiàn)表1。具體基因分型過(guò)程如下:①PCR擴(kuò)增:在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增,程序如下:95℃2 min;94℃20 s,65℃(-0.5℃/循環(huán))40 s,72℃1.5 min,11個(gè)循環(huán);94℃20 s,59℃30 s,72℃2 min,24個(gè)循環(huán);72℃2 min。將5 U蝦堿酶和2 U外切酶Ⅰ加入10μl PCR產(chǎn)物中,37℃溫浴1 h,然后75℃滅活15 min進(jìn)行純化。②SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng):延伸反應(yīng)體系(10μl)包括5μl SNaPshot Multiplex Kit(ABI),2μl純化后多重PCR產(chǎn)物,1μl延伸引物混合物,2μl超純水。程序如下:96℃1 min;96℃10 s,55℃5 s,60℃30 s,28個(gè)循環(huán)。然后在10μl延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶,37℃溫浴1 h,75℃滅活15 min進(jìn)行純化。③測(cè)序檢測(cè):取0.5μl純化后的延伸產(chǎn)物,與0.5μl Liz120 SIZE STANDARD、9μl Hi-Di混勻,95℃變性5 min后用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper 4.1軟件進(jìn)行分析。
表1 擴(kuò)增的SNP引物序列Tab.1 Primer sequence of amplified SNP
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以SAS9.4軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)完成組間一般特征分布及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。利用非條件Logis?tics回歸模型分析IL-6基因SNP位點(diǎn)及環(huán)境因素與URSA的關(guān)系?;诓嫔治龇ㄓ孟喑私换プ饔媚P吞接懎h(huán)境-基因交互作用對(duì)URSA的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α取值0.05。
2.1 一般情況本研究共納入研究對(duì)象300例,其中URSA組150例,對(duì)照組150例。經(jīng)均衡性檢驗(yàn),兩組在年齡、文化程度、家庭人均月收入、居住地、工作類(lèi)別等方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),URSA人群文化程度與家庭人均月收入普遍較低,以農(nóng)村人口居多,且多數(shù)從事中度以上體力勞動(dòng),詳見(jiàn)表2。
表2 研究對(duì)象一般特征分布[例(%)]Tab.2 Distribution of basic characteristics of study population[n(%)]
2.2 IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性與URSA易感性的關(guān)聯(lián)經(jīng)檢驗(yàn),兩組人群IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P<0.05)。在共顯性模型中,與CC基因型相比,攜帶GC基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.91倍(OR=1.91,95%CI:1.09~3.36),攜帶GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.54倍(OR=1.54,95%CI:1.02~2.34)。顯性遺傳模型分析顯示,與未攜帶G等位基因女性相比,攜帶G等位基因發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.03倍(OR=2.03,95%CI:1.18~3.47)。隱性遺傳模型分析顯示,組間基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。按流產(chǎn)次數(shù)進(jìn)一步進(jìn)行分層分析,結(jié)果顯示在共顯性遺傳模型、顯性遺傳模型及隱性遺傳模型中,G等位基因攜帶者均不增加2次RSA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.44,95%CI:0.92~2.26;OR=2.05,95%CI:0.95~3.47;OR=1.49,95%CI:0.68~3.26),但顯著增加3次以上RSA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=2.46,95%CI:1.17~5.13;OR=2.15,95%CI:1.17~3.61;OR=2.15,95%CI:1.10~8.97),見(jiàn)表3。
表3 rs1800796位點(diǎn)SNP與URSA易感性的關(guān)系Tab.3 Association between rs1800796 SNP and risk of URSA
2.3 IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性與URSA易感性的分層分析分別以年齡、工作屬性、吸煙(包括主動(dòng)和被動(dòng))、環(huán)境高危因素進(jìn)行分層分析,結(jié)果顯示在高齡、重體力勞動(dòng)、吸煙(包括主動(dòng)和被動(dòng))、接觸環(huán)境高危因素女性中,G等位基因攜帶者發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)分別增加3.96倍(OR=3.96,95%CI:1.17~12.47)、4.98倍(OR=4.98,95%CI:1.38~15.98)、1.86倍(OR=1.86,95%CI:1.19~2.92)與1.89倍(OR=1.89,95%CI:1.28~2.77)。同樣,顯性及隱性遺傳模型分析中,得到類(lèi)似的研究結(jié)果,見(jiàn)表4。
表4 rs1800796位點(diǎn)SNP與環(huán)境相關(guān)因素對(duì)URSA易感性的分層分析Tab.4 Stratified analysis on association between rs1800796 SNP and environmental risk factors and risk of URSA
2.4 IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用分析叉生分析顯示,吸煙(包括主動(dòng)和被動(dòng))、接觸環(huán)境高危因素且攜帶GC+GG基因型女性并未增加URSA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.29,95%CI:0.98~1.69;OR=1.23,95%CI:0.99~2.98),但進(jìn)一步代入相乘交互作用模型分析顯示,吸煙(包括主動(dòng)和被動(dòng))且攜帶GC+GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.96倍(OR=1.96,95%CI:1.15~3.35)。接觸環(huán)境高危因素且攜帶GC+GG基因型女性 發(fā) 生URSA的 風(fēng) 險(xiǎn) 增 加2.18倍(OR=2.18,95%CI:1.29~3.68)。同理,從事重體力勞動(dòng)且攜帶GC+GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加3.27倍(OR=3.27,95%CI:1.98~5.40),見(jiàn)表5。
表5 rs1800796位點(diǎn)SNP與部分環(huán)境因素的交互作用Tab.5 Analysis of interaction between environmental factors and rs1800796 SNP on risk of URSA
URSA病因復(fù)雜,其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確,是目前生殖健康領(lǐng)域面臨的重點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題,嚴(yán)重影響著我國(guó)育齡期女性的生殖健康。母胎界面存在獨(dú)特的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),各因子之間的平衡及免疫調(diào)節(jié)對(duì)維持正常妊娠至關(guān)重要。有研究顯示,一定程度的炎癥反應(yīng)能促進(jìn)維持正常妊娠,但過(guò)度炎癥反應(yīng)又可導(dǎo)致胚胎著床失敗,引起URSA的發(fā)生,故母胎界面的免疫失衡在URSA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[7-9]。
人類(lèi)IL-6基因位于染色體7p15~21區(qū)域,由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成。IL-6是白介素家族中的一種多肽類(lèi)促炎細(xì)胞因子,是機(jī)體復(fù)雜細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員,主要在急性炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及C反應(yīng)蛋白急性期的蛋白調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用,是一類(lèi)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡的重要細(xì)胞因子[10-11]。有研究表明,URSA患者外周血中IL-6細(xì)胞因子水平與健康人群間存在顯著性差異,并指出IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性可能增加了URSA的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),但其結(jié)論尚不一致[5-6,12-13]。本研究顯示,IL-6基因rs1800796位點(diǎn)攜帶G等位基因的育齡期女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.03倍,發(fā)生3次以上URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.15倍。也有研究表明,IL-6基因參與蛻膜調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞中STAT3的磷酸化過(guò)程,而STAT3過(guò)度磷酸化會(huì)損害細(xì)胞的增殖,抑制Treg細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,影響母胎免疫耐受及胚胎植入,這可能是發(fā)生URSA的病理基礎(chǔ)[8]。
環(huán)境是人類(lèi)生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ),在人類(lèi)長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,已逐漸對(duì)生態(tài)環(huán)境的變化做出了適應(yīng)和改造,形成一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程平衡,而一旦這種平衡被打破將導(dǎo)致URSA等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[14]。有研究顯示,工作或生活環(huán)境中接觸過(guò)量苯、甲苯、甲醛等空氣污染物會(huì)引起胚胎毒性導(dǎo)致流產(chǎn)[15];接觸環(huán)境鉛、砷、汞等重金屬化合物可干擾正常妊娠的內(nèi)分泌狀態(tài),導(dǎo)致胚胎丟失[16];接觸殺蟲(chóng)劑、化肥、增塑劑等合成化學(xué)品后改變體內(nèi)氧化應(yīng)激與免疫平衡狀態(tài),引發(fā)自然流產(chǎn)。本研究顯示,G等位基因攜帶者中,接觸環(huán)境高危因素的育齡女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.89倍;吸煙(包括主動(dòng)和被動(dòng))女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加1.86倍。進(jìn)一步進(jìn)行環(huán)境-基因交互作用分析顯示,接觸環(huán)境高危因素且攜帶GC+GG基因型育齡女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.18倍;從事重體力勞動(dòng)且攜帶GC+GG基因型女性發(fā)生URSA的風(fēng)險(xiǎn)增加3.27倍。說(shuō)明環(huán)境高危因素及重體力勞動(dòng)分別與rs1800796位點(diǎn)基因多態(tài)性存在正向協(xié)同的交互作用,提示URSA病因復(fù)雜,環(huán)境與遺傳因素在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮了非常重要的作用。
總之,IL-6基因表達(dá)產(chǎn)物在孕早期胚胎植入與胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,其rs1800796位點(diǎn)的基因突變可能會(huì)改變母胎界面相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平,破壞調(diào)控平衡,造成妊娠丟失[17],但它們?nèi)绾斡绊懞驼{(diào)節(jié)相關(guān)趨化因子的表達(dá),還需要進(jìn)一步的探究。另外,環(huán)境-基因交互作用分析顯示,孕早期接觸環(huán)境高危因素、吸煙(包括主動(dòng)和被動(dòng)吸煙)、重體力勞動(dòng)均與IL-6基因rs1800796位點(diǎn)基因突變存在相乘的交互作用。說(shuō)明URSA是由環(huán)境和遺傳因素共同影響的復(fù)雜性疾病,在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合環(huán)境因素-內(nèi)表型-基因進(jìn)行交互分析,這將有助于從更廣泛的角度去闡明URSA的病理機(jī)制。