趙統(tǒng)秀 李英蘭 婁明遠 崔曉珊 王佳斌(青海省人民醫(yī)院全科醫(yī)學科,西寧 810000)
慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease,COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病,氣流受限進行性發(fā)展可導(dǎo)致肺源性心臟病和呼吸衰竭。COPD的發(fā)病機制尚未闡明,但目前認為與肺部對有毒顆?;驓怏w慢性炎癥反應(yīng)增強有關(guān)[1]。氣道、肺實質(zhì)和肺部血管慢性炎癥是COPD的特征性改變,多種免疫細胞(包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、中性粒細胞、單核巨噬細胞等)均參與COPD發(fā)病過程[2]。CD4+T細胞在COPD發(fā)病中的作用越來越受到重視。初始CD4+T細胞在不同轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子作用下可分化為不同的輔助性T細胞(T helper,Th)亞群,其中,Treg高表達轉(zhuǎn)錄因子FoxP3和CD25,但CD127表達較低,主要參與機體免疫耐受。而Th17高表達轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨核受體γt(retinoic acid-related orphan receptorγt,RORγt),并分泌IL-17和IL-22,主要參與機體炎癥應(yīng)答[3]。由于Treg和Th17在功能上相互制約,兩者比例變化在感染、免疫及炎癥性疾病發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮決定作用[4]。多種因素(包括Toll樣受體、Notch信號通路、小分子化合物等)在不同疾病過程中均可影響Treg/Th17平衡[5-8]。IL-35是由EB病毒誘導(dǎo)基因3(epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)和IL-12 p35亞基構(gòu)成的異源二聚體,主要由Treg和調(diào)節(jié)性B細胞分泌,促進Treg增殖分化并抑制Th17功能[9]。但IL-35在COPD過程中對Treg/Th17平衡的調(diào)控作用尚未見報道。因此,本研究檢測COPD患者IL-35表達及Treg/Th17變化,并采用體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)觀察外源性IL-35對COPD患者Treg/Th17平衡的影響。
1.1 資料
1.1.1 研究對象選取2020年6月至2020年12月在青海省人民醫(yī)院全科醫(yī)學科住院的COPD患者,COPD診斷符合慢性阻塞性肺疾病全球倡議(Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease,GOLD,2017年版)標準[10],包括慢性咳嗽、咳痰、進行性呼吸困難、暴露于COPD危險因素中的病史,有或沒有呼吸窘迫癥狀;第一秒用力呼氣容量(forced expira?tory volume in 1 second,F(xiàn)EV1)與用力肺活量(forced vital capacity,F(xiàn)VC)比值<0.7。入選標準:①確診為COPD并完善肺功能檢查;②COPD處于穩(wěn)定期;③入組前2周內(nèi)未接受過抗生素、氧療、糖皮質(zhì)激素或茶堿類藥物治療;④無急性加重期征象;⑤知情同意。排除標準:①影像學檢查合并肺部感染;②合并肺間質(zhì)纖維化、結(jié)核、支氣管哮喘或肺部惡性腫瘤;③合并嚴重心臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或肝臟、腎臟功能不全;④妊娠期婦女。所有患者均根據(jù)改良醫(yī)學研究委員會(modified medical research council,mMRC)呼 吸 困 難 評分(1999年版)[11]對COPD患者呼吸困難嚴重程度進行評分,0分:僅在用力運動時出現(xiàn)呼吸困難;1分:平地快步行走或步行爬小坡時出現(xiàn)氣短;2分:由于氣短,平地行走時比同齡人慢或需要停下來休息;3分:在平地行走100 m左右或數(shù)分鐘后需要停下來喘氣;4分:因嚴重呼吸困難不能離開家,或在穿衣服、脫衣服時出現(xiàn)呼吸困難。根據(jù)GOLD(2017年版)標準[10]對COPD患者進行嚴重程度分級,GOLD-1:預(yù)計FEV1百分比≥80%;GOLD-2:預(yù)計FEV1百分比≥50%且<80%;GOLD-3:預(yù)計FEV1百分比≥30%且<50%;GOLD-4:預(yù)計FEV1百分比<30%。選擇同期在青海省人民醫(yī)院進行體檢的健康志愿者作為對照。本研究經(jīng)青海省人民醫(yī)院倫理委員會批準(省醫(yī)倫理2019013號),所有參與者知情同意,一般資料見表1。
表1 COPD患者和對照者一般資料[例(%)]Tab.1 General characteristics of COPD patients and con?trols[n(%)]
1.1.2 試劑與儀器 淋巴細胞分離液(美國Sigma公司);人CD4+CD25+CD127dim/-Treg分選試劑盒Ⅱ(德國美天旎公司);重組人IL-35(美國Peprotech公司);抗人CD4-PE Cy5.5、抗CD25-FITC、抗CD127-PE、抗IL-17-APC(美國BD公司);人IL-35、IL-10、IL-17、IL-22 ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物公司);RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司);Prime?Script RT reagent Kit(Perfect Real Time,寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司);CCK-8試劑盒(武漢碧云天公司);高速低溫離心機(美國西門子公司);MACS磁力分離架(德國美天旎公司);M680型全自動酶標儀(美國伯樂公司);FACS AriaⅡ流式細胞儀(美國BD公司)。
1.2 方法
1.2.1 血漿和外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離于清晨空腹采集COPD患者和健康對照者外周血20 ml,EDTA抗凝,4℃、1 000 r/min離心10 min,收集上層血漿,-80℃凍存?zhèn)溆茫聦友毎捎昧馨图毎蛛x液、以密度梯度離心法分離PBMC,液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 CD4+CD25+CD127dim/-Treg純化采用人CD4+CD25+CD127dim/-Treg分選試劑盒Ⅱ?qū)BMC中的CD4+CD25+CD127dim/-Treg進行純化,復(fù)蘇PBMC后采用臺盼藍檢測細胞活性并計數(shù),取1×107個PBMC于4℃、416 r/min離心10 min,采用CD4+CD25+CD127dim/-T細胞生物素標記抗體雞尾酒Ⅱ剔除CD4-CD127high細胞,收集CD4+CD127dim/-細胞,4℃、416 r/min離心10 min,采用CD25磁珠Ⅱ分選CD25+細胞,得到CD4+CD25+CD127dim/-Treg。
1.2.3 細胞培養(yǎng)取1×106個PBMC加入重組人IL-35(1 ng/ml)刺激培養(yǎng)24 h后收集細胞和上清,取2×104個純化的CD4+CD25+CD127dim/-Treg采用重組人IL-35(1 ng/ml)刺激培養(yǎng)24 h,洗滌3次去除外源性IL-35,與自體PBMC分別以1∶1、1∶5和1∶10共培養(yǎng),加入抗CD3/CD28抗體(1μg/ml)共培養(yǎng)48 h。
1.2.4 流式細胞術(shù)檢測PBMC中CD4+CD25+CD127dim/-Treg和Th17比例取1×105個PBMC,佛波酯(50 ng/ml)和伊烏諾霉素(1μg/ml)刺激培養(yǎng)6 h,同時向培養(yǎng)液中加入莫能霉素(10μg/ml)抑制蛋白轉(zhuǎn)運。刺激后的PBMC轉(zhuǎn)入FACS管,加入抗人CD4-PE Cy5.5、抗CD25-FITC、抗CD127-PE進行表面染色,4℃避光孵育30 min,洗滌,加入破膜固定液,4℃避光孵育30 min,加入抗IL-17-APC進行胞內(nèi)染色,4℃避光孵育20 min,洗滌2次,加入含4%多聚甲醛的PBS固定后采用FACS AriaⅡ流式細胞儀得到細胞,F(xiàn)lowJo V10軟件分析結(jié)果。
1.2.5 ELISA檢測血漿IL-35和培養(yǎng)上清中IL-10、IL-17和IL-22表達采用商品化ELISA試劑盒按說明書檢測血漿IL-35和培養(yǎng)上清中IL-10、IL-17和IL-22水平,設(shè)置7點標定的標準本、陽性對照和陰性對照繪制標準曲線,計算各孔相關(guān)細胞因子濃度。
1.2.6 RT-PCR檢測FoxP3和RORγt mRNA表達采用RNA提取試劑盒提取PBMC中的總RNA,PrimeScript RT reagent Kit兩步法試劑盒對RNA中的FoxP3和RORγt mRNA進行半定量分析。反轉(zhuǎn)錄及RT-PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件均嚴格按說明書進行。PCR引 物 序列 為FoxP3 F:5'-CCTCCCCCAT?CATATCCTTT-3',F(xiàn)oxP3 R:5'-TTGGGGTTTGTGTT?GAGTGA-3',RORγt F:5'-AGTCGGAAGGCAAGAT?CAGA-3',RORγt R:5'-CAAGAGAGGTTCTGGGCAAG-3',GAPDH F:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',GAPDH R:5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。以GAPDH為 內(nèi) 參,2-ΔΔCt法 分 析FoxP3和RORγt mRNA相對表達。
1.2.7 CCK-8檢測細胞增殖細胞培養(yǎng)的最后4 h向培養(yǎng)液中加入10%CCK-8溶液,培養(yǎng)結(jié)束后測量490 nm處OD值,以O(shè)D490表示細胞增殖水平。
1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析,對計量資料進行正態(tài)性檢測,所有計量資料均符合正態(tài)分布,采用±s表示,兩組間比較采用t檢驗或配對t檢驗,多組間比較進行單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 COPD患者血漿IL-35水平COPD組與對照組血漿IL-35水平差異有統(tǒng)計學意義[(108.20±12.13)pg/mlvs(133.30±22.91)pg/ml,t=5.980,P<0.000 1,圖1A],但<70歲和≥70歲COPD患者血漿IL-35水平差異無統(tǒng)計學意義[(106.00±12.27)pg/mlvs(109.90±11.97)pg/ml,t=1.063,P=0.294 0,圖1B],吸煙和不吸煙COPD患者差異亦無統(tǒng)計學意義[(107.30±11.29)pg/mlvs(110.30±14.18)pg/ml,t=0.756,P=0.454 0,圖1C]。mMRC評分為4分的COPD患者血漿IL-35水平顯著低于2分、3分患者[(100.90±12.08)pg/mlvs(115.30±10.03)pg/ml,(111.40±9.78)pg/ml,t=3.066,t=2.851,P=0.005 3,P=0.007 5,圖1D]。GOLD分級4級的COPD患者血漿IL-35水平顯著低于2級、3級患者[(100.80±12.71)pg/mlvs(114.50±9.81)pg/ml,(111.20±9.67)pg/ml,t=2.912,t=2.714,P=0.007 6,P=0.011 0,圖1E]。
圖1 COPD組和對照組血漿IL-35水平比較Fig.1 Comparison of plasma IL-35 level in COPD group and control group
2.2 COPD患者Treg/Th17變化采用前向散射光(forward scatter,F(xiàn)SC)和側(cè)向散射光(side scatter,SSC)對淋巴細胞進行圈門,在淋巴細胞門內(nèi),對CD4+T細胞進行圈門,在CD4+T細胞門內(nèi)對CD25+CD127dim/-細胞圈門,即為CD4+CD25+CD127dim/-Treg,在CD4+T細胞門內(nèi)對IL-17+細胞圈門,即為Th17(圖2A)。COPD組外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg占CD4+T細胞的比例顯著低于對照組[(4.71±1.00)%vs(6.07±1.03)%,t=5.362,P<0.000 1,圖2B],COPD組外周血Th17占CD4+T細胞的比例顯著高于對照組[(2.97±0.72)%vs(2.28±0.61)%,t=4.060,P=0.000 1,圖2C],COPD組Treg/Th17顯著低于對照組(1.69±0.60vs2.86±0.91,t=6.279,P<0.000 1,圖2D)。
圖2 COPD組和對照組外周血CD4+CD25+CD127dim/-Treg、Th17、Treg/Th17比較Fig.2 Comparison of peripheral CD4+CD25+CD127dim/-Treg,Th17 and Treg/Th17 between COPD group and control group
2.3 重組IL-35對COPD患者PBMC中Treg/Th17、轉(zhuǎn)錄因子表達和細胞因子分泌的影響重組人IL-35刺激后CD4+CD25+CD127dim/-Treg占CD4+T細胞比例顯 著 升 高[(5.31±1.25)%vs(4.71±1.00)%,t=4.157,P=0.000 2,圖3A],而Th17占CD4+T細胞比例在無IL-35刺激和經(jīng)IL-35刺激后差異無統(tǒng)計學意義[(2.97±0.72)%vs(2.85±0.68)%,t=0.867,P=0.391 0,圖3B],Treg/Th17顯著升高(2.00±0.79vs1.69±0.60,t=2.547,P=0.015 0,圖3C),培養(yǎng)上清中IL-10水平顯著升高[(145.10±24.40)pg/mlvs(123.50±24.11)pg/ml,t=4.520,P<0.000 1,圖3D],而IL-17水平[(273.40±72.28)pg/mlvs(286.40±65.35)pg/ml,t=0.837,P=0.407 0,圖3E)和IL-22水平在無IL-35刺激和經(jīng)IL-35刺激后差異無統(tǒng)計學意義[(7.76±1.36)ng/mlvs(8.11±1.35)ng/ml,t=1.128,P=0.266 0,圖3F],F(xiàn)oxP3 mRNA表達顯著升高(1.27±0.19vs0.96±0.10,t=7.600,P<0.000 1,圖3G),而RORγt mRNA表達在無IL-35刺激和經(jīng)IL-35刺激后差異無統(tǒng)計學意義(1.06±0.12vs1.05±0.12,t=0.768,P=0.447 0,圖3H)。
圖3 重組IL-35對COPD患者PBMC中Treg/Th17、細胞因子分泌和轉(zhuǎn)錄因子表達的影響Fig.3 Influence of recombinant IL-35 on Treg/Th17,cy?tokine secretion,and transcription factor expres?sion in PBMC from COPD patients
2.4 重組IL-35對COPD患者Treg免疫抑制活性的影響取14例COPD患者PBMC,分選CD4+CD25+CD127dim/-Treg,經(jīng)IL-35刺激后與自體PBMC分別以1∶1、1∶5和1∶10共培養(yǎng)48 h,重組IL-35刺激Treg后,Treg抑制PBMC增殖的能力顯著增強(圖4)。
圖4 重組人IL-35對COPD患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg免疫抑制功能的影響Fig.4 Influence of recombinant IL-35 on immunosuppres?sive function of CD4+CD25+CD127dim/-Treg in COPD patients
IL-35是一種新發(fā)現(xiàn)的抗炎癥因子,但IL-35在不同炎癥性疾病中的表達存在差異。在膿毒癥誘導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥、睡眠呼吸暫停綜合征、川崎病等炎癥性疾病中,外周血IL-35水平均升高[12-14]。但在Vogt-小柳原田綜合征、干燥綜合征等自身免疫性疾病中,IL-35水平降低[15-16]。COPD是一種慢性炎癥性疾病,既往研究發(fā)現(xiàn),COPD患者外周血IL-35水平顯著降低,且與患者年齡、吸煙史、疾病分期分級等密切相關(guān)[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),COPD患者IL-35水平降低,但與患者年齡、吸煙史等無關(guān),本研究以70歲作為分界點進行統(tǒng)計分析,由于病例數(shù)較少,可能會導(dǎo)致患者年齡、吸煙史相關(guān)性判斷產(chǎn)生統(tǒng)計偏倚。但IL-35與疾病分級呈負相關(guān),提示IL-35參與了COPD進程,但IL-35在COPD過程中發(fā)揮何種作用尚未闡明。
Treg和Th17失衡在自身免疫性疾病和炎癥性疾病中均發(fā)揮重要作用[3]。Treg和Th17共享TGF-β信號通路,在TGF-β單獨作用下,初始CD4+T細胞分化為Treg;而在IL-6或IL-21聯(lián)合TGF-β共同作用下,初始CD4+T細胞分化為Th17[3-4]。Treg分泌IL-10和IL-35等抑制性細胞因子,主要發(fā)揮免疫抑制作用,抑制自身免疫應(yīng)答;而Th17分泌IL-17和IL-22,募集中性粒細胞等非特異性炎癥細胞,促進感染和炎癥過程,在多種自身免疫性疾病中發(fā)揮促炎作用[3]。因此,兩類細胞在炎癥和免疫應(yīng)答中作用完全相反。在斑塊狀銀屑病患者皮損部位Treg/Th17下降,F(xiàn)oxP3水平降低,RORγt水平升高[19]。新型冠狀病毒感染患者中,Treg/Th17、FoxP3/RORγt、IL-10/IL-17均 顯 著 降 低[20]。本 研 究 發(fā) 現(xiàn),COPD患 者CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例降低,Th17比例升高,Treg/Th17降低,與既往在COPD小鼠模型中的研究結(jié)果一致[21-22]。提示COPD患者Treg水平降低,免疫抑制功能下降,而Th17水平升高,誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答,說明Treg/Th17失衡在COPD發(fā)病中發(fā)揮重要作用。
IL-35在結(jié)締組織病、手足口病、牙周炎中均可調(diào)控Treg/Th17平衡,參與疾病發(fā)病過程[23-25]。IL-35不但可增強Treg的免疫抑制功能,在過敏性鼻炎中還可抑制Th17應(yīng)答[26-27]。但本研究發(fā)現(xiàn),外源性IL-35刺激COPD患者PBMC后,CD4+CD25+CD127dim/-Treg比例和FoxP3 mRNA水平升高,IL-10分泌增多,但Th17比例、RORγt mRNA水平、IL-17/IL-22水平均無明顯變化,導(dǎo)致Treg/Th17升高,更為重要的是,IL-35刺激后Treg的免疫抑制功能增強,提示IL-35主要影響COPD患者Treg水平和功能,但對Th17數(shù)量和功能無明顯影響。
本研究具有一定局限性,首先,本研究對照組病例數(shù)偏少。其次,由于吸煙是COPD發(fā)病的重要危險因素之一,導(dǎo)致在有吸煙史和無吸煙史COPD患者血漿IL-35比例中,無吸煙史例數(shù)偏少。因此,本研究結(jié)果仍需要擴大樣本量并進行動物實驗加以證實。
綜上,COPD患者IL-35水平降低無法維持CD4+CD25+CD127dim/-Treg水平和免疫抑制功能,導(dǎo)致Treg/Th17數(shù)量和功能失衡。COPD疾病過程中IL-35可能主要發(fā)揮免疫保護作用,IL-35可作為COPD治療的潛在靶點之一通過調(diào)控機體免疫應(yīng)答平衡發(fā)揮治療作用。