苦參堿通過TLR3下調(diào)PI3K/Akt通路抑制子宮肌瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移

譚冠 文朱朱 周文靜（河南省信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，信陽 464000）

子宮肌瘤是育齡期婦女常見的良性腫瘤，其癥狀多樣，具有個體差異，臨床主要表現(xiàn)為月經(jīng)過多、陰道出血、習(xí)慣性流產(chǎn)、腹部壓迫等癥狀，好發(fā)于30~50歲的女性，在育齡期婦女中發(fā)病率達(dá)20%~30%，且呈逐年升高趨勢［1-2］。目前對子宮肌瘤的治療手段主要有藥物治療、手術(shù)治療與激素治療，但手術(shù)與激素會對患者造成創(chuàng)傷并產(chǎn)生副作用，因此尋找有效的治療藥物具有重要意義?？鄥A是從中藥苦參中提取的生物堿，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性，研究表明苦參堿能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬［3］。Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）細(xì)胞外跨膜糖蛋白利用細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［4］。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-ki?nase，PI3K）是一種重要激酶，與蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）組成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt，在細(xì)胞增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［5］。研究表明，TLR3可通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)分枝桿菌RNA誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生［6］。因此，本研究通過探索苦參堿對TLR3和PI3K/Akt通路的影響，進(jìn)一步探討苦參堿在抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲中的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料RNA提取試劑、LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；TLR3、PI3K、GADPH引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成；pcDNA3.1/TLR3表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒由廣州銳博生物公司設(shè)計與合成；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液、ECL試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）、Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；兔抗人TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9、β-actin單克隆抗體購自Abcam公司；山羊抗兔lgG購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 原代子宮肌瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定選取2018年10月至2019年8月于信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的10例子宮肌瘤標(biāo)本，經(jīng)病理診斷為子宮肌瘤。選取其中1例標(biāo)本，無菌條件下取肌瘤組織1 cm×1 cm×1 cm，參考文獻(xiàn)［7-8］方法鑒定子宮肌瘤細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞為小梭形，呈放射狀生長，采用α-actin抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法染色鑒定為子宮平滑肌細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染將人子宮肌瘤細(xì)胞分為6組，分別為對照組（不做任何處理）、苦參堿低、中、高劑量組（分別用0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿處理）、pcDNA3.1/TLR3質(zhì)粒（TLR3）+高劑量苦參堿組（2.0 mg/ml苦參堿處理）、NC組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒+2.0 mg/ml苦參堿處理），按照Lipofectamine2000說明書將pcDNA3.1/TLR3質(zhì)粒和TLR3-NC轉(zhuǎn)染子宮肌瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h，熒光鑒定轉(zhuǎn)染成功后更換含2.0 mg/ml苦參堿的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-qPCR檢測TLR3、PI3K mRNA水平使用RNA提取試劑盒提取1.2.2各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn) 錄 合成為cDNA后，RT-qPCR檢 測TLR3、PI3K mRNA的相對表達(dá)量。以GADPH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分別計算TLR3、PI3K mRNA相對表達(dá)量。TLR3、PI3K、GADPH引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 細(xì)胞增殖實驗通過CCK-8法檢測1.2.2各組子宮肌瘤細(xì)胞增殖情況，按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀測定吸光度值（A），實驗重復(fù)3次，細(xì)胞存活率（%）=（A實驗組/A空白對照組）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取1.2.2各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用0.25%EDTA胰酶消化細(xì)胞，PBS沖洗后將細(xì)胞制成懸液，加入10μl Annexin VFITC和5μl PI混勻，避光孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實驗收集1.2.2各組對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×106個/孔接種于6孔板，待各組子宮肌瘤細(xì)胞長滿80%后，用20μl移液器槍頭在6孔板垂直劃痕，D-hanks液洗去除飄落細(xì)胞，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，隨機選擇3個×100視野，倒置顯微鏡拍照，測量劃痕距離，計算平均值。遷移率（%）=（0 h劃痕距離-36 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實驗Transwell檢測各組細(xì)胞侵襲情況，培養(yǎng)基與基質(zhì)膠按照體積比8∶1混勻后，以50μl/孔均勻鋪在Transwell小室上室，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液待用，小室上室加入200μl單細(xì)胞懸液，下室加入650μl含10%FBS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽拭去上室細(xì)胞后，PBS沖洗，0.5%結(jié)晶紫染色，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 Western blot檢測TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)收集1.2.2各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，以5%的BSA室溫封閉2 h，加入一抗TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9和β-actin（1∶1 000），4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG與羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育30 min，滴加ECL發(fā)光試劑，暗室曝光顯影，分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS22.0分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以±s描述，多組間比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代子宮肌瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定HE染色顯示，子宮肌瘤組織可見炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核仁明顯，免疫組化顯示α-actin抗體呈陽性（圖1）。細(xì)胞生長曲線顯示擴(kuò)增出的原代子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力良好。

圖1 原發(fā)性子宮肌瘤的培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of primary uterine fibroids

2.2 苦參堿對子宮肌瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響

與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A，P>0.05）。與對照組相比，苦參低、中、高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2B、C）。

圖2 苦參堿對子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effects of matrine on proliferation and apoptosis of uterine leiomyoma cells

2.3 苦參堿對子宮肌瘤細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞遷移率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞遷移率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞遷移率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖3A、C）。Transwell結(jié)果顯示，與對照組相比，各藥物干預(yù)組細(xì)胞侵襲率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞侵襲率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞侵襲率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖3B、D）。

圖3 苦參堿對子宮肌瘤細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.3 Effects of matrine on migration and invasion of uterine leiomyoma cells

2.4 苦參堿對子宮肌瘤細(xì)胞部分基因表達(dá)的影響與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組TLR3 mRNA與PI3K mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組TLR3 mRNA與PI3K mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組TLR3 mRNA與PI3K mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖4A）。與對照組相比，苦參堿低、中、高劑量組TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與苦參堿高劑量組相比，TLR3+苦參堿高劑量組TLR3、PI3K、p-Akt、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），TLR3-NC+苦參堿高劑量組子宮肌瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖4B、C）。

圖4 各組細(xì)胞相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.4 mRNA and protein expression levels of cell related genes in each group

3 討論

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)常見腫瘤，目前對于子宮肌瘤的根治尚無有效藥物，手術(shù)為治療子宮肌瘤的主要手段，對育齡期女性而言，藥物治療為首選。子宮肌瘤的發(fā)病與其細(xì)胞增殖、侵襲等相關(guān)，因此尋找可有效抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的藥物對子宮肌瘤的治療具有重要意義［9-10］。

苦參堿被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤領(lǐng)域研究，主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。YANG等［11］研究表明，苦參堿可劑量和時間依賴性地抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖活性，苦參堿可阻斷PAX2表達(dá)，從而干擾上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號通路，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，使用苦參堿處理子宮肌瘤細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性、遷移與侵襲能力降低，凋亡率增高，表明苦參堿能夠抑制子宮肌瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，然而其具體機制尚不明確。PI3K/Akt信號通路是存在于多種細(xì)胞內(nèi)的一條重要信號通路，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等方面發(fā)揮功能，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲、化療耐藥等密切相關(guān)［12］?？滦∑降龋?3］研究表明，前列腺素E2（PGE2）/前列腺素E2受體（PGE2-R）通過介導(dǎo)P13K/Akt信號途徑參與調(diào)控子宮肌瘤發(fā)病，表明P13K/Akt信號通路與子宮肌瘤發(fā)生有關(guān)。研究表明，苦參堿可通過P13K/Akt信號通路抑制細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞耐藥性［14］。PENG等［15］研究表明，苦參堿可通過PI3K/Akt/UPA途徑顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，苦參堿處理子宮肌瘤細(xì)胞后，細(xì)胞P13K、Akt mRNA及蛋白水平降低，表明苦參堿可下調(diào)P13K/Akt信號通路，抑制細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。

TLR3是TLR家族的重要成員之一，是識別病毒和哺乳動物細(xì)胞雙鏈RNA（dsRNA）的受體。TLR3與其配體結(jié)合后，可啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子釋放，參與非特異性免疫反應(yīng)［16］。研究表明，TLR3的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡和血管再生有關(guān)［17］。本研究結(jié)果顯示，苦參堿處理子宮肌瘤細(xì)胞后，細(xì)胞TLR3 mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，表明苦參堿可抑制TLR3表達(dá)。研究證實，TLR3通過PI3K/Akt通路發(fā)揮其功能，其在CD34（+）細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板中表達(dá)，TLR3激動劑可激活NF-κB、PI3K/Akt通路［18］。FAN等［19］研究表明，TLR3在體內(nèi)外實驗中均能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，其介導(dǎo)的增殖抑制是通過下調(diào)EGFR/PI3K/Akt通路引起的。本研究結(jié)果顯示，與苦參堿高劑量組相比，使用TLR3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，子宮肌瘤細(xì)胞的TLR3、PI3K、p-Akt表達(dá)均升高，而TLR3-NC+苦參堿高劑量組TLR3、PI3K、p-Akt表達(dá)變化不顯著，提示苦參堿可能通過抑制TLR3表達(dá)來下調(diào)PI3K/Akt通路，從而抑制子宮肌瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。

綜上所述，苦參堿通過抑制TLR3表達(dá)下調(diào)PI3K/Akt通路，抑制子宮肌瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，為臨床治療子宮肌瘤提供了新的方向。但其具體機制尚不明確，本課題組將聯(lián)合動物模型對苦參堿的作用機制做進(jìn)一步研究。